Curso1 | patologia

DIAGNÓSTICO DE MARTEILIA EN MEJILLÓN

STICODEMARTEILIA

DIAGNÓSTICO DE MARTEILIA

Squash + VOE

Impronta + HEMACOLOR

CITOCENTRIFUGACION

Corte histológico teñido con hematoxilina eosina

DIAGNÓSTICO DE BONAMIA EN OSTRA PLANA POR CITOCENTRIFUGACIÓN DE LA HEMOLINFA

1. Extracción de hemolinfa por punción cardiaca o succión directa sobre el pericardio,

2. Fijación en solución de Alsever con 3% de formaldehido,

3. Citocentrifugación y tinción con May Grünwald-Giemsa.

Bonamia se puede diagnosticar también con extensiones de hemolinfa o improntas de branquias teñidas con Hemacolor

Teoria0

Bonamia en hemocitos (Corte histológico+H&E)

Bonamia en hemocitos (Citocentrifugación + Hemacolor)

Teoría:

Introducción al diagnóstico histológico en moluscos bivalvos. Anatomía básica de almeja, ostra y mejillón.

Muestreo de moluscos bivalvos para el diagnóstico de Enfermedades

Anamnesis:

1. Datos medioambientales

2. Datos del cultivo (origen, fechas, datos morfométricos, alimentación)

3. Sintomatología y mortalidad

Toma de muestras:

1. El número de ejemplares y tipo de muestreo (aleatorio simple, estratificado o por conglomerados) depende de los objetivos

2. Análisis del comportamiento: desenterrados, "gaper", etc.

3. Examen de visu (aspecto externo)

4. Improntas, frotis o squash para diagnóstico de Marteiliasis

5. Extensiones o citocentrifugación de hemolinfa para diagnóstico de Bonamiasis

6. Toma de muestra de branquias e incubación en FTM para diagnóstico de Perkinsosis

7. Toma aséptica de muestras para análisis microbiológico

8. Toma de muestras para análisis histopatológicos 9. Toma de muestra para diagnóstico molecular mediante PCR

Procesado Histológico:

1. Fijación

Objetivo: evitar la descomposición y putrefacción del tejido y conservar la estructura celular e histológica

Fijar siempre tejido vivo
Tamaño de la pieza: grosor máximo 5 mm
Tiempo de fijación: min 24h, máx. 48h. Pasar a ETOH 70%
Elegir el fijador de acuerdo con los procedimientos posteriores
Volumen muestra 1 : 10 Volumen fijador

1. Fijación. Principales soluciones fijadoras:

Fijador Davidson's (Shaw & Battle, 1957) (Fijador universal para histología e ISH): 100 mL glicerina + 200 mL de formaldehído al 35-40% tamponado pH 7 + 300 mL de ETOH 100% + 300 mL de agua de mar filtrada. Antes de usar añadir 1 mL de ácido acético glacial por cada 9 mL de fijador. (el acético se puede eliminar si se desea en un futuro extraer DNA del bloque de parafina, en tal caso añadir cantidad equivalente en agua de mar)
Fijador Carson (1990)(Fijador Universal que permite conservar la ultraestructura para posterior análisis al microscopio electrónico): disolver 23,4 g de sodio dihidrógeno fosfato dos hidrato + 5 g de hidróxido sódico en 900 mL de agua destilada y añadir 100 mL de formaldehído al 35-40% tamponado pH 7

2. Descalcificación tras la fijación

Objetivo: Paso obligatorio, sólo cuando se desea observar la concha en moluscos, la cascara en crustáceos o el hueso en peces. Es muy importante controlar el tratamiento para no degradar el resto de tejidos. Varios procedimientos:

Usando EDTA:

Añadir 10 g EDTA Na por cada 100 mL de fijador durante 1- 5 días. Comprobar la descalcificación con una pinza.
Lavar en agua del grifo
ETOH 70%

Usando ácido nítrico:

Fijar 24h y lavar con agua del grifo.
2- 5% ácido nítrico en formol a 4%: 1-24h. Comprobar la descalcificación con una pinza
Lavar con agua del grifo.
ETOH 70%

Usando soluciones comerciales (HISTOSEC):

Fijar 24h y lavar con agua del grifo.
Sumergir la muestra en la solución descalcificadora el tiempo necesario para ablandar las conchas( de 1 a 48h)
Lavar con agua del grifo.

ETOH 70%

3. Inclusión en parafina:

Objetivo: deshidratar el tejido y embeberlo en parafina para tener consistencia al corte.

Diferentes protocolos y solventes. Los tiempos dependen del grosor de la muestra y del uso o no de vacío.

Etanol 70° (conservada en)
Etanol 100° 2-4h
Etanol 100° 2-4h
Etanol 100° 2-4h
1soparafina H (sustituto del xileno/tolueno) 2-4h
1soparafina H 2-4h
1soparafina H 2-4h
1soparafinahl: Parafina (con DMSO) (8:2): 2-4h
Parafina (con DMSO) 65°C 4-8 h
Parafina (con DMSO) 65°C 4-8 h
Montaje sobre placa caliente (evitar recalentar la muestra) ORIENTAR CORRECTAMENTE LA MUESTRA
Enfriar rápido <0°C en placa fría

4. Corte en microtomo:

Objetivo: obtener secciones suficientemente finas que permitan una buena definición de la estructura celular y tisular tras la tinción

Enfriar los bloques de parafina a 4°C
Pretallar hasta llegar a la zona de interés
Cortar secciones entre 2-5 micras
Extender las secciones en agua destilada caliente (37°C)
Recoge los cortes orientados en un portaobjetos
Si se desea realizar varios tipos de tinciones es conveniente obtener cortes seriados recogidos en portaobjetos numerados
Dejar secar en la estufa (37°C) antes de teñir

5. Tinción

Objetivo: Teñir la sección histológica con colorantes acordes a lo que se desea observar:

Hematoxilina-Eosina: general

P.A.S.: glucógeno y mucopolisacáridos

Feulgen: ADN

Giemsa: bacterias

Tinción Hematoxilina-Eosina. Procedimiento general (adaptado de Howard y Smith 1983)

Desparafinar: Isoparafina H 10 min x 3 veces.
Hidratar: ETOH 100° 10 min x 3 veces. ETOH 70° 10 min x 3 veces Agua destilada 10 min x 2 veces.
Tinción: Hematoxilina de Harris o Mayer 30 min.
Lavado: Agua del grifo 5 min.
Diferenciar: ETOH ácido (0,04% HCI en etanol 70°) 1 min.
Lavar: Agua del grifo 5 min.
Azular: Na HCO₃, una cuchada en 250 mL H₂O 1min
Lavar: Agua del grifo 5 min. Agua destilada 5 min.
ETOH 90° 10 min.
Contratinción: Eosina amarillenta 10 min.
Deshidratar: ETOH 100° 10 min x 3 veces
Aclarar: Isoparafina H 10 min x 3 veces.
Montar: Resina o DePeX compatible con Isoparafina:

4. Examen histopatológico

Conocimiento profundo de la anatomía del molusco
Sección adecuada y orientación correcta del corte
Conocimiento de la histología normal y patológica

Ruditapesdecussatusw

Anatomía de un molusco bivalvo: esquema básico

Plano sagital Plano coronal

Anatomía de la almeja fina, Ruditapes decussatus

Crassostreagigas

Anatomía de la ostra, Crassostrea gigas

Anatomía del mejillón (Mytilus galloprovincialis)

Mytilusgalloprovincialis)

Teoria1

Quefunciones

Teoría: Técnicas básicas de muestreo. El muestreo en la estimación de la prevalencia de una patología.

El muestro el la pieza clave que permite (o no) extrapolar los resultados

¿Qué funciones debe cumplir un muestreo?

Que sea adecuado a nuestro objetivo. Por ejemplo:

Estudiar la prevalencia de un enfermedad en una población comprendida entre unas tallas determinadas
Estudiar la asociación entre la mortalidad y la presencia de un parásito

Que sea suficientemente representativo de la población objeto. Población objeto: grupo de individuos del que se desea obtener información (no confundir con la población total)

Dos preguntas claves que definen un muestreo

¿Qué individuos debo incluir en la muestra? El muestreo debe ser aleatorio dentro de la población objeto
¿Cuántos individuos debo tomar?

Las dos preguntas claves que definen un muestreo

¿Qué individuos debo incluir en la muestra?
¿Cuántos individuos debo tomar?

1. ¿Qué individuos debo incluir en la muestra?

El muestreo debe ser aleatorio dentro de la población objeto Tipos de Muestreos Aleatorios:

Aleatorio simple: TODOS los individuos de la Población OBJETO tienen la mismas posibilidades de ser muestreados. ¿Cómo elegir los ejemplares? Establecer un orden y utilizar una tabla de números aleatorios

Aleatorio estratificado (simple o compuesto): Primero se estratifica la población total según in criterio (distribución de tallas, sexo...) en varias poblaciones objeto y luego se las somete a cada una de ellas a un muestreo aleatorio simple.

Aleatorio por conglomerados: primero se divide la población en subgrupos similares y luego se muestrea al completo algunos de los subgrupos elegidos al azar (calicatas)

¿Cómo son los muestreos que se suelen llevar a cabo para el estudio de prevalencia en poblaciones de moluscos?

Poblaciones en cultivo (tallas definidas y localizadas): muestreo aleatorio estratificado simple
Poblaciones naturales (dispersión espacial no homogénea y dispersión de tallas)
En el muestreo de poblaciones naturales de moluscos es difícil que todos los individuos tengan las misma probabilidad de ser muestreados (discriminación por tallas en los rastros de captura).
Cuando se requiere un número significativo de muestra, los muestreos por conglomerados usando calicatas no son viables
Se recurre a muestreos aleatorios sobre subpoblaciones capturadas del medio natural. Estas están siempre estratificadas a los criterios del primer muestreo (p.e. talla mínima de captura del rastro utilizado)
Además estos muestreos iniciales con rastros son de tipo conglomerados (recorrido del rastro) pero que no suelen ser elegidos al azar debido a la distribución no homogénea de las poblaciones.

Dospreguntas

Comoson

2. ¿Cuántos individuos debo muestrear para saber si una población está libre o no de un parásito?

¿Cómo calcular el tamaño muestral "n"?

Para ello es necesario tener validado el método de diagnóstico = conocer su Sensibilidad y Especificidad

Sensibilidad diagnóstica (Se): probabilidad de que un infectado real sea diagnosticado como tal = 1- probabilidad de un falso negativo
Especificidad diagnóstica (Sp): probabilidad de que un ejemplar sano sea diagnosticado como tal = 1- probabilidad de un falso positivo

Una prueba perfecta (Gold estándar) es la que Se = Es = 1

La Se y Sp de un método se calcula comparándola con un Gold Estándar

Validacionde

Cuando no hay pruebas diagnósticas perfectas de referencia la estimación de la Se y Sp se hace mediante métodos de Clases Latentes: Máxima verosimilitud y análisis Bayesiano

Validación de un método diagnóstico

Prevalencia = N° de infectados/N° total

Nosotros medimos siempre una

Prevalencia "aparente" (Pa)=

N° de infectados correctamente diagnosticados + n° de sanos erróneamente diagnosticados como infectados

Pa = (P x Se) + [(1-P)x(1-Sp)]

La prevalencia real (P) es P = [Pa — (1-Sp)] / {1-[(1-Sp)+(1-Se)ll

El tamaño de muestra "n" para detectar una enfermedad (Thorburn, 1999)

Depende de:

El tamaño real de la población "N"
La prevalencia real de la enfermedad "P"
La Se y la Sp del método de diagnóstico
El error tipo alfa que estemos dispuestos a asumir (a =0.05), es decir la probabilidad de no detectar ningún positivo en la muestra "n" para una prevalencia dada
Para poblaciones suficientemente grandes: n = In (a) / In (1- Pa)

Donde Pa = (P x Se) + [(1-P)x(1-Sp)]

Un caso práctico: Cómo calcular el número de ejemplares a muestrear para saber hasta qué punto una zona puede estar libre de una enfermedad

Tenemos un método de diagnóstico con una Se = 0.70 y Sp = 0.99

Deseamos saber qué tamaño "n" muestra deberíamos tomar, de una población de tamaño considerable (N>1000), para poder afirmar, con un 95% de posibilidades de acierto (alfa=0.05), que - en el caso de no detectar ningún infectado - la población tiene una prevalencia real inferior al 5 % de los individuos, o lo que lo mismo:

¿Cuántos ejemplares debo muestrear para detectar, con un 95% de posibilidades, al menos un ejemplar infectado en una población de tamaño considerable (>1000) con una prevalencia real igual o superior al 5%?

Se = 0.70

Sp = 0.99

P= 0.05

Aplicando Pa = (P x Se) + [(1-P)x(1-Sp)].= 0.0445

n = In (a) / In (1- Pa) = 65 ejemplares

Uncaso

Teoría:

Introducción al diagnóstico microbiológico en patología de moluscos bivalvos

Patología de Moluscos Bivalvos: Diagnóstico microbiológico

Infecciones bacterianas en larvas (Vibrio spp., Pseudomonas spp. y Aeromonas spp.)
Aislamiento y caracterización de vibrios en infecciones en concha (Vibrio tapetis)
Nocardiosis (nódulos en conectivo de bacterias filamentosas Gram+, Acido resistente, PAS positivo)

teoria2

Ruta básica para el diagnóstico microbiológico clásico

Guía orientativa para la asignación a posibles géneros

Teoría:

Introducción al diagnóstico molecular mediante PCR y PCR-RFLP

OBJETIVOS

1. Técnicas de Extracción de DNA

2. Cuantificación

3. PCR y PCR-RFLP (Restriction fragment Length polymorphism)

4..Breve descripción del procedimiento a seguir para el Diagnóstico de Perkinsus, Bonamia, Marteilia, OsHV-1

1.- Técnicas de Extracción de DNA

http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi

3.- PCR (Polymerase Chain Reaction) y RFLP (Restriction fragment length polymorphism)

Qué es PCR?

Polymerase Chain Reaction

2.- Cuantificación

Qué es PCR?

Polymerase Chain Reaction

3.- PCR y RFLP (Restriction fragment length polymorphism)

Tabla resumen

3.- PCR y PCR-RFLP (Restriction fragment length polymorphism)

Gel de agarosa

Fuente de electroforesis

Tras-iluminador

3.- PCR y PCR-RFLP (Restriction fragment length polymorphism) (Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción)

3.- PCR y PCR-RFLP (Restriction fragment length polymorphism)

Breve descripción del procedimiento a seguir para el Diagnóstico de Perkinsus, Bonamia, Marteilia, OsHV-1

Teoría:

Introducción al diagnóstico mediante hibridación in situ (ISH)

Hibridación in situ (ISH)

Fundamentos: utilizar la especificidad de un fragmento de DNA/RNA para localizar al patógeno en los tejidos del hospedador

Aplicaciones:

Confirmación visual de la especificidad de la sonda.
Diagnóstico confirmativo
Seguimiento de la progresión del parásito en los tejidos
Detección de formas crípticas del parásito

Estrategias para el diseño de sondas moleculares de diagnóstico

Requisito: secuencias específicas y repetidas
Candidato: DNA repetitivo (DNA satélite o ribosómico)
Procedimientos:

Aislamiento del parásito, extracción de su DNA, digestión con enzimas de restricción, clonación y secuenciación
Aplicación de cebadores universales para la secuenciación de la región 28S-IGS-18S de los genes ribosómicos

Pasos de la Hibridación in situ (ISH)

Fijación y procesado histológico del tejido.
Obtención de secciones histológicas seriadas adheridas fuertemente a portaobjetos (salinizados): control histológico (H&E), control ciego y muestra.
Desarrollar también controles positivos y negativos con muestras sanas e infectadas
Síntesis y marcaje de la sonda: diversos métodos asociados a una reacción de PCR e incorporación de marcadores no radiactivos (dUTP-DIG, UTP-Biotina o dUTP-Fluoresceina para la FISH directa)
Protocolo de ISH