3. VIRUS EN MOLUSCOS
Resumen
Los bivalvos son organismos filtradores que pueden acumular patógenos, entre ellos virus, y no sólo aquellos que les afectan a estos animales sino también a muchos otros organismos. Las condiciones en las que se realiza el cultivo de los bivalvos provocan que éstos estén sometidos a un mayor estrés que aumenta el riesgo de infección.
Los patógenos virales han causado mortalidades masivas ya que son altamente infecciosos y fácilmente transmisibles, sin embargo, las mortalidades causadas por éstos agentes son las más desconocidas debido a la falta de herramientas para su estudio, fundamentalmente, la ausencia de líneas celulares. En los últimos años, con el avance de las técnicas de biología molecular (PCR, hibridación in situ, PCR a tiempo real, etc.) se ha conseguido avanzar en el diagnóstico de las enfermedades virales en los bivalvos. Se han detectado infecciones con etiología viral causadas por virus de los grupos de Birnavirus, Reovirus, Picornavirus, Retrovirus, Herpesvirus, Iridovirus y Papovavirus.
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1. INTRODUCCIÓN
Según la FAO, se producen anualmente en el mundo 1.500.000 toneladas de moluscos bivalvos, de las cuales casi un 40% se producen en Europa. España se sitúa como segundo productor de estos organismos después de China con unas 300.000 toneladas anuales.
Los bivalvos son animales filtradores que pueden acumular virus, no solo propios, sino también de otros animales (Meyers 1984). Es posible que muchos de estos virus ni siquiera repliquen en los moluscos y simplemente sean reservorios de virus de vertebrados que llegan a su hospedador definitivo mediante la ingestión del molusco (Lees 2000; Potasman et al. 2002; Nishida et al. 2003).
Las condiciones en las que se lleva a cabo el cultivo es otra de las causas por las que los moluscos están sometidos a estrés que conlleva una mayor susceptibilidad a infecciones. Los patógenos virales han causado mortalidades masivas, ya que normalmente son altamente infecciosos y fácilmente transmisibles. El control de estas enfermedades pasa por un diagnóstico eficaz y un manejo adecuado de los stocks que permitan una mejora de las condiciones en las que se cultivan estos animales y al mismo tiempo, una sostenibilidad y una falta de agresividad con el medio ambiente.
Se han registrado mortalidades en bivalvos producidas por protozoos, bacterias y virus, siendo éstas las más desconocidas debido a la falta de herramientas para su estudio. La ausencia de líneas celulares es una de las mayores limitaciones para diagnosticar adecuadamente una infección viral (Figueras y Novoa 2004). De hecho, las enfermedades de bivalvos se han estudiado tradicionalmente mediante técnicas histológicas que son muy útiles para detectar patógenos, fundamentalmente parásitos protozoos, asociados a mortalidades o a pérdidas de calidad de los stocks cultivados. Además esta técnica permite estudiar las lesiones y la interacción entre el patógeno y los mecanismos del sistema inmune del hospedador. De esta forma se han llevado a cabo estudios epidemiológicos y se han descrito patógenos asociados con mortalidades. Sin embargo, hay que señalar que se suele atribuir la causa de las mortalidades a aquello que se ve y es posible que las infecciones virales no se diagnostiquen por la falta de métodos de detección. La microscopía electrónica permite la visualización de virus, sin embargo es una técnica costosa en tiempo y dinero, por lo que no se suele emplear para llevar a cabo estudios epidemiológicos de rutina.
En los últimos años, con el avance de las técnicas de biología molecular como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la hibridación in situ, la PCR a tiempo real, etc., se ha conseguido profundizar en la patogénesis y, sobre todo, en el diagnóstico de las enfermedades virales en estos animales.
TABLA 1. Características de los virus encontrados en moluscos bivalvos.
A pesar de la falta de herramientas de diagnóstico, se han descrito episodios de mortalidades en diferentes especies de moluscos asociados a la presencia de virus. Así, ya en los años 70, se detectaron mortalidades masivas en ostras portuguesas (Crassostrea angulata), que se asociaron a infecciones por iridovirus (Comps et al. 1976; Comps y Bonami 1977; Comps y Duthoit 1979).
Se han detectado otras infecciones con etiología viral causadas por virus de las familias Herpesviridae, Papovaviridae, Togaviridae, Retroviridae, Reoviridae, Birnaviridae y Picornaviridae (Farley et al. 1972; Farley 1976; Farley 1978; Opandri et al. 1981; Meyers 1979; Bower 2001, Rasmussen 1986; Renault y Novoa 2004).
En este capítulo intentaremos resumir los últimos avances en el estudio de los distintos virus que afectan a los moluscos bivalvos en cultivo.​
2. VIRUS CON GENOMA RNA
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2.1. Birnavirus
Los birnavirus infectan a especies tan diferentes como vertebrados, moluscos, insectos y rotíferos
(Delmas et al. 2005). Esta familia incluye virus con un genoma RNA de doble hebra bisegmentado que se clasifican en cuatro géneros: avibirnavirus (especie tipo: infectious bursal disease virus [IBDV]), entomobirnavirus (especie tipo: Drosophila X virus (DXV), aquabirnavirus (especie tipo: infectious pancreatic necrosis virus [IPNV]) and blosnavirus (especie tipo: blotched snakehead virus [BSNV]).
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Han sido detectados en Europa (Hill 1976), en Taiwán (Lo et al. 1988) y en Canadá (Bower 2001). También se les han asociado con episodios de mortalidad en ostras cultivadas en Japón (Suzuki et al. 1998). Estos virus se han llamado birnavirus marinos, ya que tienen características distintas del virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV) de salmónidos. El virus de Tellina 1 (TV-1) fue aislado del bivalvo marino Tellina tenuis (Hill 1976) y más tarde incluido en la familia Birnaviridae (Brown 1986; Dobos et al. 1979). Se realizaron ensayos de neutralización cruzada y se comprobó que los cuatro géneros de birnavirus eran antigénicamente distintos del TV-1 (Dobos et al. 1979; Hill y Way 1995; John y Richards 1999). Este hecho fue corroborado recientemente por Nobiron et al. (2008) quienes estudiaron la secuencia genómica del virus y lo separaron definitivamente de otros birnavirus acuáticos.
Aunque la patogenicidad de estos virus en bivalvos no parece ser elevada, en situaciones de estrés puede provocar mortalidades eleva das como ha sucedido en almeja (Meretrix lusoria) (Chou et al. 1994, 1998) o en ostra perlífera (P. fucata) (Suzuki et al. 1997, 1998).
Se han aislado birnavirus de moluscos aparentemente sanos por lo que se ha sugerido que los bivalvos pueden actuar como reservorios (Riva s et al. 1993). De hecho, recientemente, se han aislado birnavirus de mejillones, sedimentos y agua en las proximidades de granjas de salmón infectados por estos virus (Gregory et al. 2007). En estudios llevados a cabo en ostra perlífera (Pinctada fucata) se determinó que los virus podían persistir en los hemocitos durante el verano para después, en invierno, extenderse y pasar a las células parenquimales (Kitamura et al. 2000).
2.2. Retrovirus
Los retrovirus son importantes agentes causantes de enfermedades en animales y en el hombre (Coffin et al. 1997). Todos ellos poseen una enzima esencial para la replicación que es la reverso transcriptasa que es una polimerasa capaz de transcribir el RNA genómico viral a una doble hebra de DNA que se integra en el genoma del hospedador como un provirus. Se ha demostrado que la actividad retrotranscriptasa existe en neoplasias diseminadas de varios moluscos como en Mya arenaria (Oprandy et al. 1981) donde se pudo reproducir la enfermedad en almejas sanas, y en berberecho Cerastoderma edule en España (Romalde et al. 2007). Se han publicado evidencias de una posible etiología viral por varios autores. En primer lugar la neoplasia se transmite entre individuos en diferentes especies como mejillón, Mya arenaria y berberecho (Collins y Mulcahy 2003; Elston et al. 1988; Kent et al. 1991; Sunila 1994, Twomey y Mulcahy 1988) indicando que un agente infeccioso podría estar involucrado. Estos autores publicaron la inducción de la replicación viral y de la neoplasia en almejas con 5-bromodeoxyuridine, un inductor de la expresión de partículas retrovirales en cultivos celulares de mamíferos (Oprandy y Chang 1983). Unos años más tarde, Sunila (1994) aisló un virus icosaédrico a partir de Mya arenaria con neoplasia. Sin embargo, hay que señalar que otros autores no encontraron patógenos similares en mejillones o berberechos con los mismos síntomas (Auffret y Poder 1986; Elston et al. 1992). En estudios recientes se ha podido llevar a cabo un seguimiento de la neoplasia en Mya arenaria midiendo el porcentaje de células tetraploides y se encontró una correlación entre la reverso transcriptasa y el porcentaje de estas células circulantes en la hemolinfa de la almeja (Aboelkhair et al. 2009).
2.3. Reovirus
Se ha descrito un virus similar a los reovirus (I3p2) en C. virginica capaz de replicar y de ser aislado en líneas celulares de peces. El virus tenía unos 79 nm de diámetro y no era neutralizado con un anticuerpo frente al virus de Tellina (birnavirus), por lo que Meyers (1979) lo clasificó como reovirus. Análisis genéticos posteriores indicaron que el virus pertenecía al nuevo género Aquareovirus descrito por Lupiani et al. (1993). Con respecto a su patogenicidad, existe controversia, ya que es posible que los virus detectados sean apatogénicos para los bivalvos y simplemente estos animales actúen como reservorios. Chou et al. (1994) proporcionaron evidencias de que los reovirus inducían mortalidades en los bivalvos, sin embargo no se reaisló el virus ni se llevaron a cabo estudios sobre las lesiones que producían. Por lo tanto, la infectividad de estos virus permanece todavía hoy en día como hipotética aunque está claro que algunos de estos virus no infectan a los moluscos (Meyers 1980).
2.4. Picornavirus
Existen bastantes publicaciones sobre la detección de partículas virales similares a picornavirus en moluscos bivalvos, sin embargo, en ningún caso se llevó a cabo un aislamiento de los virus en línea celular y simplemente han sido visualizados mediante microscopía electrónica o con tinciones de ácidos nucleicos, por lo que faltan evidencias de que los virus detectados sean la causa de las mortalidades de los bivalvos. En 1986, Rasmussen detectó partículas virales de unos 27 nm de diámetro en Mytilus edulis en Dinamarca. Las partículas se encontraban en vesículas formando estructuras paracristalinas o individualmente y se asociaron a granulocitomas.
Más adelante se publicó la presencia de picornavirus en otro mejillón, Perna canaliculus, que sufría mortalidades en Nueva Zelanda (Jones et al. 1996). Estaba asociada a hemocitosis extensiva y necrosis de las células intersticiales, basales y las del epitelio de los túbulos digestivos. El estudio ultraestructural reveló el retículo endoplasmático muy modificado y asociado a partículas similares a virus envueltas que medían de 25 a 45 nm de diámetro. Se detectaron también en M. galloprovincialis de la misma zona. Más adelante, en 1999, Comps et al. detectaron partículas similares a virus en la ostra perlífera Pinctada maragaritifera en la Polinesia francesa. Se visualizaron en granulocitomas asociados a necrosis focales y se sugirió que podría tratarse de un picornavirus.
En el año 2000, Novoa y Figueras publicaron la descripción del primer virus que afectaba a la almeja fina asociado a mortalidades. Las partículas virales se encontraban en el citoplasma de células del tejido conectivo y tenían un aspecto similar a los picornavirus ya que eran icosaédricos y con un diámetro de unos 27-35 nm. En la misma zona (Galicia) se detectaron partículas similares unos años después en otra especie de molusco, el berberecho (Cerastoderma edule) (Carballal et al. 2003) e incluso en Urastoma cyprinae que es un parásito turbelario que infecta las branquias de varios moluscos bivalvos marinos (Crespo-González et al. 2008).
3. VIRUS CON GENOMA DNA
3.1. Herpesvirus
A pesar de que no se ha conseguido la replicación de los herpesvirus que afectan a moluscos bivalvos en cultivos primarios o en líneas celulares de peces, la posibilidad de obtener un purificado de virus después de aplicar gradientes de sacarosa (Le Deuff y Renault 1999) ha permitido estudiar a fondo a estos virus y desarrollar técnicas de diagnóstico basadas en la biología molecular (Renault y Novoa 2004). De hecho, son los virus de moluscos más estudiados y son los únicos virus de moluscos de los que se ha secuenciado su genoma (Davison et al. 2005).
Los herpesvirus tienen una forma circular o poligonal y se replican en el núcleo de las células infectadas. Se observan además, grupos de virus envueltos en el citoplasma dentro de vesículas. Cuando se liberan al espacio extracelular los virus son envueltos y miden unos 100-180 nm de diámetro. Su genoma presenta una estructura general similar a la de los herpesvirus de mamíferos (como el herpes simplex o el citomegalovirus) (Davidson et al. 2005).
Los herpesvirus afectan a Crassostrea virginica tal como publica Farley et al., en 1972, lo cual supuso la primera descripción de estos virus en bivalvos. También se han asociado a mortalidades de larvas de C. gigas en Nueva Zelanda (Hine et al. 1992) y en Estados Unidos (Burge et al. 2006). Desde que se publicaron estas detecciones, los herpesvirus se han asociado a mortalidades esporádicas de juveniles de distintas especies de ostra en Francia (Renault et al. 2000; 1994 a, b; Comps y Cochennec 1993). Se han descrito en Ostrea angasi en Australia (Hine y Thorne 1997), en Tiostrea chilensis en Nueva Zelanda (Hine 1997; Hine et al. 1998) y en larvas de Ruditapes philippinarum y Pecten maximus en Francia (Renault 1998, Arzul y Renault 2002). Recientemente, en un estudio patológico llevado a cabo en C. ariakensis y otras especies de ostras en Asia, se pudo constatar la presencia de tres tipos genéticos distintos de herpesvirus (Moss et al. 2007).
Las larvas afectadas por infecciones de herpesvirus suelen mostrar una reducción en su capacidad de alimentarse y de nadar. Además muestran lesiones en el velo y en el manto. En juveniles, las elevadas mortalidades se producen en cortos períodos de tiempo y la manifestación más notable de la enfermedad es la presencia de núcleos anormales en los tejidos conectivos de manto, palpos labiales, branquias y glándula digestiva, aunque estas modificaciones no están asociadas a grandes reacciones inflamatorias (Renault et al. 1994 a, b; Renault et al. 2000). Los adultos no son tan susceptibles a las infecciones por herpesvirus, sin embargo se ha apuntado la posibilidad de que actúen como portadores asintomáticos del virus ya que se ha detectado su presencia en ostras adultas (Arzul et al. 2002).
Ha sido posible demostrar la patogenicidad de estos virus mediante infecciones experimentales poniendo en contacto larvas de ostra infectadas con larvas libres de la enfermedad (Le Deuff et al. 1996). Sin embargo, hasta ahora no ha sido posible reproducir la enfermedad mediante infecciones experimentales en adultos y solo los juveniles sometidos a estrés mostraron mortalidades (Renault y Novoa 2004).
Recientemente se ha controlado la mortalidad de tres familias de ostras cultivadas en las mismas condiciones y se cuantificó la carga viral del herpesvirus OsHV-1 mediante PCR en tiempo real en individuos vivos y muertos durante y después de los eventos de mortalidad. El nivel de infección estuvo correlacionado con la mortalidad en las distintas familias. Además, los resultados confirman que existe una elevada base genética que explica la resistencia de la ostra frente a la mortalidad de verano atribuida a estos herpesvirus (Sauva ge et al. 2009). Esto ha sido también observado cuando se estudiaron varias familias de ostras de distintos orígenes y se comprobó que no todas las familias estaban infectadas lo que podría sugerir de nuevo una influencia paterna (da Silva et al. 2008).
Se han desarrollado técnicas de biología molecular, como PCRs e hibridaciones in situ para detectar a los virus en los tejidos infectados de los bivalvos (Renault y Novoa 2004; Batista et al. 2006). Estos métodos rápidos de diagnóstico han permitido llevar a cabo estudios epizootiológicos amplios en Europa. Recientemente, se ha puesto a punto una PCR a tiempo real para la detección de este patógeno que permite una sensibilidad mucho mayor y que probablemente consiga detectar el virus en ostras asintomáticas profundizando en aspectos no conocidos de la cinética de la infección (PEPIN et al. 2008).
3.2. Iridovirus
Los iridovirus son de forma icosaédrica con un diámetro de unos 300 nm. Constan de un centro electrodenso de unos 190 nm de diámetro que está rodeado de una zona clara seguida por una zona densa de unos 45 nm de grosor. Se ensamblan en el citoplasma.
Los iridovirus se han asociado a mortalidades de moluscos bivalvos en diferentes países. Se han descrito varias patologías principales. En Francia, se describió la llamada «enfermedad de las branquias» causada por el GNV (gill necrosis virus asociada a mortalidades masivas en Crassostrea angulata (Comps et al. 1976; Comps 1978, 1980). También se describieron brotes de esta enfermedad en C. gigas (Comps y Bonami 1977). Otra de las enfermedades que se ha relacionado con los iridovirus es la enfermedad del velo de las larvas, OVVD (oyster velar virus disease), que afectó a larvas de la ostra del Pacífico en la costa oeste de Norteamérica (Elston 1979; Elston y Wilkinson 1985). Por último, en 1970, se produjeron mortalidades importantes en C. angulata de Francia en las que se observaron virus similares a iridovirus en los hemocitos. Se le llamó HIV (hemocyte infection virus). A pesar de que en todos estos episodios se han descrito virus identificados como iridovirus, todavía no existen suficientes avances en la caracterización molecular y datos definitivos de infecciones experimentales.
En la enfermedad de las branquias de C. angulata es característica la aparición de varios puntos amarillos en las branquias y los palpos labiales, los cuales aumentan su tamaño haciendo que el tejido se ponga de color marrón llegando a producirse perforaciones en el tejido. En estados avanzados de la infección, se puede llegar a producir una destrucción completa de los filamentos branquiales. Los síntomas son similares en C. gigas pero más leves, demostrando que esta especie es un poco más resistente a la enfermedad. Se han descrito brotes de enfermedad similares en los que no se detectaban síntomas externos aparentes, sin embargo a nivel histológico se observaba una degeneración del tejido conectivo y la presencia de células atípicas que parecían ser hemocitos infectados (Comps y Bonami 1977).
Con respecto a la enfermedad del velo de las larvas, OVVD, fue descrita por primera vez en ostras de la costa oeste de Norteamérica (Elston 1979; Elston y Wilkinson 1985). El virus se asoció a mortalidades ocasionales de larvas. Los animales afectados por esta enfermedad son menos activos y presentan un desprendimiento de las células del velo (Elston y Wilkinson 1985). Es en estas células del epitelio del velo donde se observan partículas virales de unos 228±7 nm de diámetro con simetría icosaédrica. Los viriones forman además cuerpos de inclusión intracitoplasmáticos de unos 1.2 ± 2.4 μm de diámetro, primero sin un núcleo definido y después desarrollando partículas completas, que constan de un núcleo interno denso separado de la cápside. El contenido de DNA de los cuerpos de inclusión se detectó mediante tinción con naranja de acridina (Elston 1997).
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3.3. Papovavirus
Los papovavirus son virus no envueltos de unos 40- 55 nm de diámetro con replicación intranuclear. No se han podido asociar por el momento a mortalidades de bivalvos. Inicialmente la familia Papovaviridae estaba formada por dos géneros: Papillomavirus y Polyomavirus.
Sin embargo, hoy en día se consideran como dos familias separadas: Papillomaviridae y Polyomaviridae. Los papillomavirus, ahora considerados como una nueva familia (García et al., 2006), fueron responsables de la hipertrofia gametocítica viral (VGH), que fue descrita por primera vez en 1973 en adultos de C. virginica en Maine (Estados Unidos) por Farley (1976). Se han descrito virus similares a los papovavirus en epitelio gonadal de varios bivalvos, especialmente de ostras, asociados a hipertrofia de los gametocitos (Elston 1997; McGladdery 1999; Dong et al. 2004). Así, se han detectado en C. virginica en Canadá (McGladdery y Stephenson 1994) y en Estados Unidos (Meyers 1981; Farley 1985; Winstead y Courtney 2003). Además, también se han detectado papovavirus en C. gigas recientemente en Corea. Así, Choi et al. (2004) detectaron la presencia de virus similares a papovavirus en tejidos gonadales. En este caso, aunque se observaron muchas mitocondrias y células espermáticas alrededor del cuerpo de inclusión, no se detectó ninguna reacción del hospedador tal como una infiltración hemocitaria. También se ha publicado la detección de papovavirus en C. gigas en Francia (García et al. 2006) donde se observó que tanto los gametos masculinos como los femeninos estaban hipertrofiados y presentaban inclusiones basofílicas en el núcleo.
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Estudios de microscopía electrónica de transmisión revelaron que estas inclusiones presentaban partículas virales similares de las de los Papilomavirus o Poliomavirus (los dos grupos de Papovavirus). La frecuencia y la intensidad de infección fueron bajas y no se detectó una reacción del hospedador con lo que se sospecha que las partículas virales tenían un débil impacto en la ostra. Recientemente, se han detectado estos virus en C. hongkongensis en Asia (Moss et al., 2007) y en C. gigas en la costa de Alemania (Watermann et al. (2008) e Irlanda (Cheslett et al. 2009). En este caso, aunque la infección se asoció con la presencia de mortalidades, no se detectó una reacción del bivalvo frente a la misma.
Aunque el impacto que estos virus tienen en las distintas especies de bivalvos parece bajo, no debemos olvidar las características oncogénicas de otros miembros de las familias Papillomaviridae y Polyomaviridae (Van Regenmortel et al., 2000). Por ejemplo, en Mya arenaria se ha sospechado que estos virus estaban relacionados con la neoplasia gonadal (Harshbarger et al. 1979). Además del posible impacto patogénico se ha señalado la posibilidad de emplear estos virus en el desarrollo de líneas celulares de moluscos (García et al. 2006).
4. ACTIVIDAD ANTIVIRAL EN MOLUSCOS BIVALVOS
A pesar de que no se han descrito moléculas similares a interferón en invertebrados, se han publicado varios trabajos sobre actividad antiviral de los extractos de distintas partes de su cuerpo, por ejemplo, en bivalvos, se encontró una actividad neutralizante de la hemolinfa de Mya arenaria frente al colifago T3 (Bachere et al. 1990). Recientemente, se detectó que la hemolinfa de C. gigas inhibía la replicación del herpes simplex tipo 1 y de IPNV (Olicard et al. 2005). Además, se ha descrito que los péptidos antimicrobianos presentes en los moluscos bivalvos, como son la mitilina o defensina de mejillón, presentan actividad antiviral (Roch et al. 2004).