4. ENFERMEDADES BACTERIANAS DE MOLUSCOS BIVALVOS
Resumen
Uno de los problemas de la acuicultura de moluscos bivalvos son los repetidos episodios de mortalidad, que merman gravemente a la producción. Estos brotes de enfermedad afectan tanto a las fases larvarias y post-larvarias en criaderos, como a los juveniles y adultos cultivados en medio natural. En el caso de los criaderos, las mortalidades masivas suponen la pérdida completa de los lotes de producción, con graves implicaciones económicas. En la mayoría de los casos, los estudios han demostrado que se trata de patologías bacterianas, destacando de entre los agentes responsables los miembros del género Vibrio. En lo que se refiere a las fases cultivadas en el mar, aunque inicialmente se prestó atención sólo a las patologías causadas por protozoos parásitos, en los últimos años se han descubierto diferentes enfermedades de origen bacteriano que afectan a la supervivencia de los cultivos.
En este capítulo se revisan los conocimientos actuales sobre el tema, detallando los principales patógenos bacterianos que afectan tanto a las fases larvarias y post-larvarias cultivadas en criadero, como a los juveniles y adultos cultivados en medio natural. Se describen los signos característicos de las enfermedades causadas por las diferentes especies bacterianas, el rango de hospedadores susceptibles y su distribución geográfica. Además, se incluye un apartado que analiza los métodos de detección empleados, prestando especial atención a los nuevos métodos moleculares de identificación, que implican un gran avance en el estudio y control de las enfermedades de origen bacteriano que afectan a los cultivos de bivalvos.
1. INTRODUCCIÓN
La acuicultura de moluscos ha pasado de ser una industria tradicional, centrada en economías familiares, a constituirse como una industria moderna, en algunos casos altamente tecnificada, con empresas competitivas y con un creciente grado de diversificación. Su contribución al desarrollo económico de muchas regiones costeras es incuestionable (Pazó 1987; Guerra et al. 1993). El impacto sobre este sector de brotes severos de enfermedades es tal que, en muchas ocasiones, ha limitado la producción en un área determinada, así como el comercio entre distintas zonas geográficas. Estos brotes pueden producirse, en ocasiones, debido a movimientos de stocks infectados, siendo un problema habitualmente asociado al cultivo de moluscos. Las enfermedades, ya sean bacterianas, virales o parasitarias, pueden afectar en diferentes estadíos, de larva a adulto, independientemente de la técnica de cultivo utilizada.
Hasta hace relativamente poco tiempo, la mayoría de las enfermedades de bivalvos descritas se debían a protozoos, como Bonamia, Haplosporidium, Marteilia y Perkinsus (ampliamente tratados en otros capítulos), y en menor medida a hongos y virus (LAUCKNER 1983; SINDERMANN 1990; BOWER et al. 1994; MCGLADDERY 1999; PAILLARD et al. 2004). A lo largo de este capítulo se revisarán las principales enfermedades bacterianas de los bivalvos marinos, tanto de estadíos larvarios, como de juveniles y adultos, incluyendo la sintomatología característica de cada una de ellas, su etiología y patogenicidad del agente causal, así como aspectos de su patogénesis. Por último, se analizarán los últimos avances en el desarrollo de métodos moleculares de identificación, rápidos y fiables, y su utilidad e importancia en la prevención y control de enfermedades de bivalvos con etiología bacteriana.
2. BACTERIAS PATÓGENAS DE LARVAS DE BIVALVOS
2.1. Cultivo de bivalvos en criadero. Problemática general
Los criaderos son actualmente la principal fuente de semilla para la acuicultura de muchos moluscos bivalvos de valor económico, entre los que se encuentran diferentes especies de ostras, almejas o pectínidos. La obtención de semilla mediante puesta inducida ha sido estudiada desde el punto de vista técnico para establecer las condiciones bajo las que se debe realizar. Así, la influencia de factores como la salinidad, la temperatura, la densidad de los cultivos, los tiempos de acondicionamiento, la alimentación… han sido objeto de numerosos trabajos. Sin embargo, hay un gran desconocimiento de los problemas patológicos asociados, a diferencia de acuiculturas como las de peces o crustáceos, debido en buena medida a la falta de estudios sistemáticos.
Los episodios de altas mortalidades se dan a menudo en estas instalaciones, sin que se busquen en muchos casos los agentes causantes. Suelen traducirse en pérdidas de lotes de producción completos, con la consiguiente implicación económica y falta de regularidad en el suministro de semilla. Las epizootias de consecuencias fatales están ampliamente recogidas en la bibliografía, como episodios intermitentes que dificultan este tipo de cultivos (TUBIASH et al. 1965, 1975; BROWN y LOSEE 1978; DISALVO et al. 1978; PRIEUR y CARVAL 1979; ELSTON y LEIBOVITZ 1980; BROWN 1981a; GARLAND et al. 1983; ELSTON 1984; SUGUMAR et al. 1998; PRADO et al. 2005).
Las condiciones óptimas de cultivo de bivalvos (densidad, temperatura, carga de materia orgánica, concentración de nutrientes inorgánicos, etc.) favorecen el crecimiento y proliferación de bacterias y la acumulación de sus metabolitos (MURCHELANO et al. 1975; TUBIASH 1975; PRIEUR y CARVAL 1979; ELSTON 1984; BROWN y TETTELBACH 1988; ARAYA et al. 1999). El desarrollo de la enfermedad en muchas ocasiones se desencadena por un aumento de la susceptibilidad de las larvas a las infecciones debido a factores de estrés externos, como variaciones en la calidad del alimento o del agua, contaminación por exceso de restos orgánicos, etc. Estos factores facilitan el crecimiento selectivo de bacterias que pueden resultar patógenas para los cultivos al superar el umbral crítico de concentración en la población larvaria (DISALVO et al. 1978; TUBIASH y OTTO 1986). Además, una fase característica del desarrollo larvario de bivalvos, como es la fijación, conlleva la deposición temporal en el fondo del tanque y la exposición de las larvas a altas concentraciones de bacterias patógenas, asociadas a las superficies, a larvas muertas y moribundas, y a los detritos depositados allí (DISALVO et al. 1978; SUTTON y GARRICK 1993).
Por tanto, los criaderos son capaces de obtener larvas de bivalvos en condiciones controladas, pero con mucha frecuencia, cultivos alimentados correctamente y con un crecimiento normal mueren sin causa aparente, convirtiendo la producción comercial en una realidad errática. Aunque son muchas las variables que pueden influir, la implicación de poblaciones bacterianas en estas mortalidades repentinas y catastróficas es un hecho demostrado que precisa ser tenido en cuenta.
Los agentes responsables de las mortalidades masivas en cultivos larvarios de bivalvos en criadero forman parte en muchas ocasiones de la microbiota normal. Los potenciales patógenos bacterianos están ampliamente distribuidos como saprófitos o comensales de organismos marinos (TUBIASH et al. 1965) y no asociados exclusivamente a individuos enfermos. Estas bacterias son tolerables a ciertos niveles, si otros factores como los medioambientales son favorables (JEFFRIES 1982).
ELSTON (1984) define «patógeno oportunista» como microorganismo de vida libre, pero que requiere condiciones favorables para proliferar, en el sistema o asociado al hospedador, y causar enfermedad. Frecuentemente causan infecciones secundarias, que siguen al estrés causado por factores menos aparentes como la densidad larvaria, la temperatura, la tensión de oxígeno…». Son numerosas las referencias en la bibliografía a este término en relación con episodios de mortalidades (TUBIASH y OTTO 1986; SUGUMAR et al. 1998; PRADO et al, 2005).
2.3. Relación bacterias-mortalidades
La asociación entre bacterias y problemas de crecimiento y mortalidades en criaderos de bivalvos está ampliamente documentada, desde que WALNE (1956) establece que las poblaciones bacterianas en cultivos larvarios pueden ser 100 veces mayores que en el mar y ese mismo año DAVIS y CHANLEY (1956) demuestran que las mortalidades larvarias se reducen a veces con el uso de antibióticos. Posteriormente, WALNE (1958) aporta la primera evidencia del efecto patógeno de bacterias en larvas de bivalvos, relacionando estas con los problemas de crecimiento de larvas de ostra. Sugiere dos posibles modos de interacción bacterias–larvas. Uno sería el de bacterias patógenas, causantes directas de enfermedades, mientras el otro correspondería a aquellas que, siendo componentes habituales del agua de mar, dañaran de alguna forma a las larvas, bien uniéndose a la concha o a los tejidos y multiplicándose, bien por liberación de metabolitos al medio. En 1959, GUILLARD demuestra por primera vez la relación entre mortalidades en larvas de Mercenaria mercenaria y aislados bacterianos concretos.
TUBIASH et al. (1965) describen por primera vez los síntomas clínicos de una enfermedad que denominan «necrosis bacilar», causada por una vibriosis experimental en larvas de diferentes especies de bivalvos. Este término aparece referido en numerosos estudios posteriores (BROWN y LOSEE 1978; DISALVO et al. 1978; LODEIROS et al. 1987; SÁINZ et al. 1998; LUNA-GONZÁLEZ et al. 2002).
ELSTON y LEIBOVITZ (1980) describen tres tipos de patogénesis (I, II y III), basándose en sus experimentos con larvas de Crassostrea virginica inoculadas con dos Vibrio sp., que cursan con diferentes signos y afectan a distintos estadios del desarrollo larvario.
TABLA 1. Resumen de la bibliografía publicada sobre patologías larvarias de moluscos bivalvos causadas por bacterias del género Vibrio. *Abreviaturas de los géneros: A = Argopecten, Ae = Aequipecten, C = Crassostrea, M = Mercenaria, My = Mytilus, N = Nodipecten, O = Ostrea, P = Pecten, R = Ruditapes.
Otros muchos estudios han confirmado esta relación entre bacterias y enfermedad en diversas especies de moluscos bivalvos, incluyendo ostras (Ostrea y Crassostrea), almejas (Mercenaria y Ruditapes), pectínidos (Aequipecten, Argopecten, Pecten, Nodipecten, Chlamys y Euvola), mejillones (Mytilus), berberecho (Cerastoderma), y otras especies como Teredo navalis, Tridacna gigas o Atrina maura.
2.4. Vibriosis
El género Vibrio incluye a muchos de los principales patógenos de la acuicultura marina, tanto de peces como de crustáceos y moluscos. El historial de su relación con los problemas en cultivos larvarios de bivalvos comienza con la descripción de la enfermedad observada por GUILLARD (1959) en la especie M. mercenaria, causada por la inoculación (10⁶/ml) de un aislado obtenido de larvas moribundas. Los signos que observa son la distensión y el desprendimiento del velo, y la aparición de estrías en el cuerpo, para terminar con mortalidades por encima del 70%. Un dato curioso es que los inóculos de esta misma bacteria filtrados o sometidos a tratamiento térmico no causan mortalidad, pero sí un menor crecimiento y el cese de la alimentación. Como mecanismo de acción sugiere la necesidad del contacto o la invasión por la bacteria activa, más que una acción mediada por exotoxinas, ya que se aprecian bacterias vivas alrededor de las larvas moribundas, y que el filtrado o la bacteria muerta no causan mortalidades. Pero los problemas de crecimiento que se observan en estos dos últimos casos, hacen que el autor no descarte el efecto negativo de metabolitos bacterianos, al menos cuando se acumulan grandes cantidades. Demuestra además que la patogenicidad es independiente de la temperatura y del medio en que se cultive la bacteria.
TUBIASH et al. (1965) establecen por vez primera la secuencia de signos de la enfermedad causada por tres aislados bacterianos pertenecientes al género Vibrio, obtenidos de larvas moribundas de M. mercenaria y Crassostrea virginica, inoculándolas en el agua de cultivos larvarios (10⁶/ml) de M. mercenaria, C. virginica, Ostrea edulis, Aequipecten irradians y Teredo navalis.
Acuñan el término «necrosis bacilar» para denominar la enfermedad, cuyos primeros signos se manifiestan a las 4-5 horas, con reducción de la movilidad y tendencia a permanecer quiescentes con el velo extendido. Aparecen grupos puntuales de bacterias en los márgenes de las larvas, con aspecto de enjambres, lo que lleva a los autores a denominar el fenómeno como «swarming- pululando» bacteriano. A las 8 horas hay muerte con necrosis granular. Se ven velos desprendidos que mantienen la actividad ciliar. Pueden proliferar ciliados carroñeros, como invasores secundarios.
No establecen la ruta de infección, pero apuntan que las pocas larvas malformadas que aparecen son las últimas en mostrar signos de enfermedad y las que más sobreviven. Como estos individuos anormales raramente se alimentan, postulan que quizá la invasión inicial sea a través del tracto digestivo.
Ensayos de inoculación masiva de adultos con las mismas bacterias demuestran que estos no son susceptibles, ni siquiera a especies bacterianas que son patógenas para fases larvarias (M. mercenaria y C. virginica). En esta misma línea se desarrolla un trabajo posterior con adultos de C. virginica (TUBIASH 1974) que confirma la marcada resistencia de los adultos a los patógenos larvarios.
Los aislados causantes de la necrosis bacilar se caracterizaron posteriormente (TUBIASH et al. 1970), identificándose como V. alginolyticus, Vibrio sp. y la nueva especie V. tubiashii (HADA et al. 1984). Nuevos ensayos (TUBIASH y OTTO 1986) realizados con las mismas especies larvarias y cepas de V. anguillarum y V. alginolyticus aisladas de larvas de M. mercenaria y C. virginica enfermas, rindieron resultados idénticos a los explicados anteriormente, con el mismo desarrollo de la enfermedad.
BROWN (1973) realiza un estudio con embriones y larvas de diferentes edades (2 días y 2 semanas, respectivamente) de C. virginica, inoculando aislados obtenidos de larvas de C. virginica y M. mercenaria, así como de materia particulada presente en el agua de mar. Como resultado algunas cepas, pertenecientes al género Vibrio, causan problemas de desarrollo (protusión del velo o formación incompleta de la concha) o mortalidades en los embriones. En ocasiones observa que las larvas continúan creciendo hasta que son invadidas por las bacterias y mueren, mientras en otras hay un retraso del crecimiento y los individuos aparecen más claros, debido a que no se alimentan. En general, hay una mayor susceptibilidad de los embriones, que se justifica por la protección que la concha da a las larvas o por una mayor tolerancia de estas a las bacterias. Coincide con TUBIASH et al. (1965) en la aparición de protozoos ciliados invadiendo los tejidos necrosados, oportunistas que proliferan a expensas de las larvas debilitadas, pero no observa «swarming» bacteriano. Aunque el mecanismo de infección no parece claro, la inocuidad de los inóculos filtrados o tratados térmicamente apunta a una invasión bacteriana directa, más que a la actuación de toxinas.
Estudia también una enfermedad en un criadero de C. virginica, que muestra los primeros signos a los diez días de cultivos, sin retraso de crecimiento previo, y causa el colapso total en sólo una semana (BROWN y LOSEE 1978). También observa «swarming» y la presencia de ciliados entre las larvas moribundas. Aíslan una bacteria V. anguillarum-like, presente en el agua pero en números muy bajos, que utilizan para ensayos de inoculación. En este caso, tanto las células como el filtrado resultan tóxicos, pero no el inóculo tratado térmicamente, lo que indicaría una toxina proteinácea. Nuevos estudios con diferentes Vibrio sp. (BROWN 1983; BROWN y ROLAND 1984) apuntan también a un mecanismo de infección sin necesidad de invasión bacteriana, mediado por exotoxinas que se acumulan en las larvas por la alimentación.
La enfermedad sigue la progresión descrita para la necrosis bacilar, con algún retraso en la secuencia de signos de enfermedad que se puede achacar a la utilización de concentraciones menores. No hay sin embargo «swarming», por lo que no parece que se facilite el ataque de otras bacterias, ni que sea necesaria una invasión masiva para la necrosis. La bacteria se une al velo, deformándolo o incluso haciendo que se desprenda, y una vez que penetra en la larva se multiplica rápidamente. A dosis altas se alcanzan desarrollos anormales de hasta el 56.8%, quizá por permitir la acumulación de algún metabolito potencialmente teratogénico.
La aparición de los primeros signos al cabo de 10 días de cultivo estaría justificada por la presencia del agente responsable a baja concentración inicial. A esta presencia a baja concentración, más que a su ausencia, puede ser debido también el que no se aísle el patógeno del agua de cultivo; mientras que la escasa recuperación del agua de larvas infectadas parece una consecuencia de la invasión de las larvas (BROWN 1981a; BROWN y TETTELBACH 1988).
Con los mismos signos de la necrosis bacilar refieren DISALVO et al. (1978) la enfermedad sufrida por larvas de O. edulis y C. gigas. Los ensayos realizados con un aislado V. anguillarum-like en larvas de ostra plana confirman su patogenicidad. Describe el fenómeno de «spotting- punteo», la aparición de gran número de larvas agregadas en el fondo de los tanques, que beneficia a las bacterias ya que los detritos (heces, comida sedimentada) pueden estimular su crecimiento y promover la infección. Una toxina inhibidora de la natación podría ser la responsable.
En 1980, ELSTON y LEIBOVITZ detallan minuciosamente tres tipos de patogénesis, basándose en experimentos realizados con larvas de C. virginica inoculadas con dos Vibrio sp. aislados de epizootias larvarias.
La patogénesis tipo I afecta a todos los estadíos. La patogenicidad resulta directamente de la capacidad de las células bacterianas de unirse al periostraco larvario y al interior de la concha. Las células bacterianas crecen a lo largo de la concha, invaden el tejido del manto adyacente como vía de entrada, se expanden a lo largo del manto y penetran la cavidad visceral. El proceso llega a ser irreversible en un estadío temprano porque la reparación de los daños del manto periférico especializado en la formación de la concha no es posible.
Las larvas, sedentarias, se exponen a niveles bacterianos elevados asociados al sustrato y apenas se alimentan. Algunas extienden el velo parcial y periódicamente. Las pocas larvas activas muestran anormalidades en el velo (pérdida de las células del anillo ciliar preoral, grados variables de deformidad velar). Las larvas (3-5 días) contienen formas libres esféricas en el interior del área periférica de la cavidad del manto. La disrupción del manto e infección de la cavidad visceral altera las funciones reguladoras asociadas, llevando a la muerte.
Las larvas continúan activas, mostrando daños progresivos en el velo, consistentes en la pérdida de la textura normal de la cubierta celular y el redondeamiento y pérdida de las células ciliadas. Se mueven con los pocos cilios que conservan, que no son haces de cilios (cirri) del anillo ciliar principal sino cilios individuales. Como resultado los patrones natatorios son anormales: velocidad, movimientos erráticos y giros en círculos de diámetro más pequeño de lo normal. El músculo retractor se suelta y el velo permanece extendido (las larvas parecen incapaces de retraerlo). A medida que la enfermedad progresa, se ven cada vez más velos separados o fragmentos. Se observan también animales sedentarios con restos de velo no funcional.
La disfunción velar implica una pérdida de movilidad, de actividad alimenticia y problemas en los niveles de intercambio respiratorio y de metabolitos. Como la larva continúa activa, la falta de nutrientes es un factor clave. Afecta principalmente a estadíos jóvenes, con menores reservas nutritivas.
La patogénesis Tipo III se corresponde con el estadío de velíger tardía. Estas larvas responden inicial y rápidamente a la presencia de bacterias con una reducción de la movilidad y la alimentación, llegando a la inactividad, con los consiguientes problemas en la toma de nutrientes, intercambio respiratorio y balance metabólico. Las larvas sedentarias extienden los cilios velares entre las valvas, pero raramente el velo. Se detecta una atrofia visceral progresiva y extensiva. Los tejidos de las larvas inactivas no reciben suministro nutritivo y van degenerando hasta convertirse en masas irreconocibles. Parece que las bacterias se unen a la capa superficial del tracto digestivo, lo que origina la pérdida de células absorbentes. Los componentes bacterianos son absorbidos en pequeñas cantidades y ocasionan alteraciones intracelulares tóxicas que llevan al desprendimiento de las células. La posterior invasión bacteriana se caracteriza por lesiones puntuales en órganos del tracto digestivo (i.e., la invasión bacteriana de los tejidos no ocurre hasta el final del proceso de la enfermedad, como infección local en el tejido de la glándula digestiva).
Los trabajos comentados hasta aquí aportan la mayor parte de los conocimientos que aún hoy en día se tienen sobre el papel del que es sin duda el género bacteriano más importante en relación con las mortalidades larvarias en criadero. Estudios posteriores han confirmado lo ya observado por estos autores, incluyendo otras especies del género Vibrio en la lista de patógenos de larvas de bivalvos.
La especie V. anguillarum, además de lo ya detallado con anterioridad, ha resultado patógena también para A. purpuratus (RIQUELME et al. 1995).
La especie V. alginolyticus ha sido identificada como responsable de mortalidades en larvas de C. gigas y patógena también para O. edulis (JEFFRIES 1982), Tridacna tropical (SUTTON y GARRICK 1993), A. purpuratus (RIQUELME et al. 1996) A. ventricosus (SÁINZ et al. 1998), Nodipecten subnodosus, Atrina maura (LUNA-GONZÁLEZ et al. 2002), y Ruditapes decussatus (GÓMEZ-LEÓN et al. 2005). En los experimentos realizados con huevos de Mytilus galloprovincialis se observa un efecto subletal, no hay mortalidades masivas pero se ve afectado el desarrollo normal, llevando a mortalidades en la fase siguiente del desarrollo (ANGUIANO-BELTRÁN et al. 2004).
El grupo constituido por V. splendidus y aislados semejantes ha sido descrito también como patógeno de C. gigas, O. edulis (JEFFRIES 1982), Tridacna tropical (SUTTON y GARRICK 1993), Pecten maximus (NICOLAS et al. 1996), C. virginica (SUGUMAR et al. 1998) y R. decussatus (GÓMEZ-LEÓN et al. 2005).
Ocasionalmente se ha descrito la patogenicidad de otras especies, como es el caso de los estudios de SUTTON y GARRICK (1993) con larvas de Tridacna gigas, un pectínido tropical, que describen como patógenos aislados similares a V. orientalis, V. campbellii, V. metschnikovii y V. harveyi. Otros Vibrio sp., miembros del género sin adscribir a ninguna especie, han sido identificados como responsables de mortalidades en C. virginica (BROWN, 1973, 1983), C. gigas (GARLAND et al. 1983; ESTES et al. 2004) u O. edulis (LODEIROS et al. 1987; PRADO et al. 2005).
2.4.1. Nuevas especies patógenas de bivalvos
Vibrio pectenicida
NICOLAS et al. (1996) observan en cultivos larvarios de Pecten maximus, mantenidos sin hacer uso del cloranfenicol, la aparición sistemática de mortalidades en la tercera semana, precedidas de una ralentización del crecimiento, mientras los cultivos con antibiótico se mantienen vivos. Con los aislados obtenidos de ejemplares enfermos realizan experimentos de patogenicidad larvaria. La cepa A365, entre otras, causa elevadas mortalidades en P. maximus, repentinamente a las 48 horas de exposición, y se recupera como dominante de las larvas y el agua de cultivo. En ensayos con larvas de C. gigas, las mortalidades causadas por esta misma cepa no llegan al 40% al cabo de 6 días.
Refieren un redondeamiento de los hemocitos de P. maximus por exposición a esta bacteria, mucho más rápido que al ser expuestos a otros vibrios patógenos. De la misma manera, los hemocitos de otros bivalvos tienen una respuesta más débil enfrentados a la cepa A365. Esta especificidad puede ser debida a diferentes factores de virulencia (por ejemplo, factores de unión) o a toxinas.
El mecanismo de infección puede ser invasivo, ya que se observa una colonización de las larvas antes de que aparezca el brote. También puede deberse a una toxina termoestable, apoyándose en la rápida deposición de las larvas en el sustrato cuando son expuestas a la bacteria. Y puede ser una endotoxina que, al ser fagocitada la bacteria por los hemocitos, cause el redondeamiento de estos. Sin embargo, las mortalidades progresivas no pueden explicarse por la actuación de toxinas, ya que la presencia masiva de vibrios en el agua implicaría una gran cantidad de toxinas, que no se correspondería con el efecto gradual. Por tanto, parece tratarse de un mecanismo combinado, invasivo y por toxinas. La infección comenzaría con la invasión bacteriana, hasta alcanzar un número elevado en el interior de la larva. Las enzimas digestivas lisarían entonces las células bacterianas, liberando las toxinas, que interrumpirían el tránsito en el digestivo y degradarían los tejidos. El mecanismo descrito se corresponde con la patogénesis de tipo III (ELSTON y LEIBOVITZ 1980).
Esta cepa A365, junto con otros cuatro aislados del mismo origen, se incluye posteriormente en la descripción de la nueva especie, V. pectenicida (LAMBERT et al. 1998). Es interesante destacar entre sus características el hecho de que no crece en el medio TCBS, selectivo para vibrios y utilizado rutinariamente para su detección.
Profundizando en los mecanismos de patogenicidad de V. pectenicida, establecen la inhibición específica de la quimioluminiscencia de hemocitos de adultos de P. maximus, mientras que esa inhibición es sólo parcial en ensayos con C. gigas (LAMBERT & Nicholas 1998). La reducción de la actividad quimioluminiscente resulta tanto de la exposición a las células bacterianas (toxina específica) como a extractos citoplasmáticos (toxina inespecífica), en este último caso en menor medida (LAMBERT et al. 2001).
La patogenicidad de V. pectenicida podría por tanto estar relacionada con su capacidad para matar hemocitos. Sería así capaz de interferir con otras células fagocíticas de la glándula digestiva y allí, mediante endotoxinas, conseguir una disrupción de los sistemas de defensa y digestivo de las larvas.
El hecho de que las células vivas tengan mayor actividad que los extractos citoplasmáticos puede deberse a que sólo algunos de los factores tóxicos estén en el citoplasma, mientras que otras moléculas activas pueden encontrarse, bien en formas menos activas o precursoras, bien unidas a la membrana. Hay que considerar además el propio proceso de obtención del extracto.
En cuanto al modo de acción de las toxinas, puede estar relacionado con la actuación sobre algún paso del metabolismo del estallido respiratorio, o con una actividad citotóxica suficientemente intensa como para provocar la muerte del hemocito.
Consiguen purificar una toxina, a la que llaman VHKT («Vibrio hemocyte-killer toxin»), termoestable, resistente al ácido y proteasas, e hidrosoluble (LAMBERT et al. 2001). Su caracterización muestra que es diferente a otras descritas anteriormente para otras especies del género Vibrio, pero similar a la «toxina vibriostática» descrita por NOTTAGE et al. (1989). Sin embargo, experimentos preliminares muestran que existen diferencias, sugiriendo que se trata de una nueva toxina.
Finalmente realizan estudios de inmunohistoquímica de larvas infectadas por baño con V. pectenicida (SANDLUND et al. 2006). Según los resultados, no se ven células bacterianas, a pesar del elevado grado de tinción, que puede ser debido a productos bacterianos extracelulares parcialmente disueltos. El pequeño tamaño de las larvas hace muy difícil la observación de la degeneración tisular y la necrosis.
Vibrio neptunius
La especie Vibrio neptunius (THOMPSON et al. 2003) se crea para englobar una serie de aislados dominantes en la microbiota asociada a un sistema de cultivo de rotífero (Brachionus plicatilis) en recirculación, junto con otros procedentes del digestivo de larvas de rodaballo (Scophthalmus maximus) y de larvas del bivalvo Nodipecten nodosus.
PRADO et al. (2005) demuestran la patogenicidad de esta especie para cultivos larvarios de bivalvos. En un criadero se venían registrando problemas de mortalidades en cultivos larvarios y postlarvarios de ostra plana. Se hace un seguimiento de una fracción de larvas desde el momento en que se empieza a apreciar un retraso en el crecimiento, al cabo de dos semanas de cultivo. Los recuentos en el medio TCBS (selectivo para vibrios) de las muestras procesadas son mínimos. En la población que crece en el medio Agar Marino (AM, para bacterias marinas heterótrofas) predomina claramente una colonia pigmentada verde (tipo Pseudomonas), apareciendo también en pequeño número una colonia gris-crema. Las mortalidades comienzan cuatro días después, próxima ya la fijación, siendo más acusadas en las larvas «pequeñas» (≈ 150mm), individuos de menor desarrollo que en muchas ocasiones no alcanzan la fijación. Se observa un cambio en la población bacteriana asociada a las larvas, desaparece la colonia pigmentada verde y pasa a ser predominante la colonia gris-crema (también en TCBS), correspondiente al aislado 145.98.
Los experimentos de laboratorio realizados con la cepa 145.98 en cultivos larvarios de O. edulis demuestran su patogenicidad. En 48 horas, las mortalidades alcanzan valores medios de 98,6%, frente a la supervivencia de los controles por encima del 90%. Este período de tiempo tiene importancia, ya que es el mínimo que se suelen mantener las larvas en circuito cerrado, en un mismo tanque sin cambio de agua.
La edad de las larvas no influye en los resultados, idénticos para los dos fracciones utilizados en los ensayos (6 y 15 días respectivamente). Otros autores mantienen que la resistencia a la enfermedad podría incrementarse con la edad, por una mayor tolerancia o por el crecimiento de la concha (BROWN 1973; ELSTON 1984), lo que se corresponde con lo observado en el criadero. La falta de diferencias en laboratorio puede estar justificada por los elevados inóculos bacterianos emplea dos en los experimentos (≈ 10⁵ ufc/ml), si se comparan con los niveles iniciales a los que suelen estar los patógenos en los cultivos.
Los signos de la enfermedad observados en los experimentos se corresponden con la necrosis bacilar y la vibriosis tipo I. Comienza con una reducción de la movilidad, las larvas dejan de nadar o lo hacen siguiendo patrones anormales en círculo. Aparecen larvas depositadas en el fondo de los recipientes, con las valvas cerradas pero movimiento interno. En el pico de la infección se puede apreciar el fenómeno de «swarming» bacteriano en el interior y alrededor de las larvas moribundas (Fig. 1). Aparecen también velos deformados en larvas activas e incluso fragmentos que continúan en movimiento. En algunos casos se pueden ver protozoos ciliados carroñeros (Fig. 2).
La evolución de los problemas en el criadero, con la aparición de las primeras mortalidades en semilla pequeña y posteriormente en fases larvarias, parece sugerir una posible transmisión del patógeno entre los diferentes compartimentos. Se descarta la transmisión vertical (LODEIROS et al. 1987; RIQUELME et al. 1995), por ensayos de patogenicidad con aislados de los reproductores del criadero, y el fitoplancton como vía de entrada del patógeno, ya que no hubo crecimiento en TCBS, pero no se puede demostrar otro tipo de transmisión.
La cepa patógena se detecta inicialmente en bajo número, pero una vez que penetra en las larvas se multiplica rápidamente, para pasar a ser predominante al tiempo que se registran mortalidades en el cultivo. Se trata por tanto de la proliferación de un patógeno oportunista con graves consecuencias para la producción, como ya se ha descrito en otros casos (BROWN y LOSEE 1978; DISALVO et al. 1978; JEFFRIES 1982).
Vibrio ostreicida
Esta nueva especie del género Vibrio, V. ostreicida (PRADO et al. 2008), ha sido aislada en relación con mortalidades de semilla pequeña de ostra plana (≈ 500mm) en «nursery» (PRADO et al. 2005; PRADO 2006).
FIGURA 1. Detalle de los signos de enfermedad en larvas infectadas experimentalmente: «swarming» bacteriano alrededor de las larvas. La flecha señala los acúmulos de células bacterianas. Barra = 200 mm.
FIGURA 2. Larvas de ostra plana ya muertas, rodeadas de protozoos carroñeros (flecha). La punta de flecha señala los restos de las larvas ya atacadas previamente por bacterias. Barra = 100mm.
Estos episodios eran continuos, detectándose el inicio de los problemas por la apariencia de la semilla como una masa clara en el fondo de los tambores. Unas primeras muestras de semilla muerta muestran que la microbiota asociada está constituida por vibrios en su práctica totalidad, como se deduce del crecimiento en los medios AM y TCBS (≈ 10³ ufc/semilla en ambos). La comparación de ejemplares con signos iniciales de enfermedad con otros sanos permite establecer que los vibrios están presentes en ostras moribundas o muertas, pero no en individuos sanos, en los que ni siquiera se detectan.
La aparición sistemática de problemas al llegar los cultivos a la «nursery», y una vez descartadas otras fuentes como el fitoplancton, llevan a pensar en los propios tanques como reservorio de bacterias. La cepa 203 aparece en todas las muestras de los tambores del interior del tanque sembradas en el medio AM. Los ensayos de patogenicidad realizados en laboratorio con larvas de ostra plana demuestran que esta cepa causa la mortalidad del 86,4% de los cultivos en las primeras 24 horas, alcanzando el 98,5% en el siguiente día, siendo el único de todos los aislados relacionados con estos problemas que ocasiona mortalidades por encima del 5%.
El desarrollo de la enfermedad es similar al descrito para la necrosis bacilar. En este caso, además, se aprecia claramente el fenómeno de «spotting» ya descrito por otros autores (DISALVO et al. 1978; NOTTAGE y BIRKBECK 1987; ESTES et al. 2004), con las larvas aglutinadas en el fondo del recipiente (Fig. 3).
El aislamiento del patógeno de la superficie de los tambores que contienen las ostras justifica la aparición de problemas al llegar los cultivos a la «nursery». Su persistencia, causando mortalidades sucesivamente en los diferentes lotes, es probable que se deba a la formación de «biopelículas». Las biopelículas, comunidades de microorganismos unidos a una superficie, tienen ventajas ecológicas para los componentes que las forman. Estas estructuras favorecen la supervivencia en los cambios de agua, al mantenerse las bacterias adheridas en un ambiente húmedo con bajos niveles de oxígeno (ELSTON et al. 1982; ELSTON 1984).
FIGURA 3. Detalle de la acumulación de larvas en el fondo de los recipientes o «spotting». Barra = 200 mm.
Confieren protección frente a cambios bruscos del medio, principalmente por la producción de exopolisacáridos, que adsorben compuestos orgánicos disueltos, favorecen la disponibilidad de nutrientes y la cooperación metabólica (OPHIR y GUTNICK 1994; DAVEY y O’TOOLE 2000). Facilitan la incorporación de nuevos genes, favoreciendo la aparición de nuevos patógenos por adquisición de resistencia a antibióticos, factores de virulencia y/o capacidades de supervivencia medioambiental, como una mayor resistencia a la lejía y los detergentes (WATNICK et al. 2000). en su presencia (KARUNASAGAR et al. 1996) Impiden el acceso físico de agentes antimicrobianos y, además, cepas sensibles a un antibiótico pueden formar biopelícula en su presencia (KARUNASAGAR et al. 1996)
Por todo ello, la limpieza de los tanques es un punto de control de la persistencia de los patógenos en el sistema (ELSTON 1984).
Es preciso un tratamiento mecánico de las superficies (incluyendo también las tuberías de los circuitos de agua) y su esterilización, con muestreos regulares de control (ELSTON et al. 1982). Vibrio ostreicida se aísla en todas las muestras de tambores en números bajos, demostrándose una vez más que se trata de un patógeno oportunista, que prolifera cuando las condiciones son favorables.
2.5. Enfermedades producidas por representantes del Género Pseudomonas
El género Pseudomonas ha sido descrito, en algunos casos, como patógeno de larvas de bivalvos, en la mayoría de las ocasiones aislados obtenidos junto con miembros del género Vibrio causantes de problemas en los cultivos larvarios.
Ya en 1959, GUILLARD habla de un aislado patógeno para larvas de M. mercenaria, obtenido de larvas moribundas junto con un aislado de Vibrio del que ya se ha hablado en el apartado anterior. La enfermedad causada en laboratorio por la Pseudomonas sp. precisa de inóculos mayores (10⁷/ml) y cursa con signos diferentes a la vibriosis, apareciendo las larvas con el cuerpo granulado y en desintegración, y el velo rasgado y sin cilios. El hipotético mecanismo de infección sin embargo parece ser igual al descrito para el Vibrio sp.
HELM y SMITH (1971) describen una enfermedad en O. edulis que como primer signo manifiesta un cese de la natación, seguido por la extensión del velo con movimientos anormales y necrosis. Identifican el patógeno como una pseudomonas del grupo IV.
BROWN (1973) recoge un nuevo caso con diferentes aislados de ambos géneros que causan desarrollo anormal o mortalidades en larvas de C. virginica. No hay diferencia entre las enfermedades ocasionadas por uno u otro tipo de bacteria.
En trabajos posteriores (BROWN 1974) estudia el fenómeno de coloración rosa que aparece en los recipientes de cultivos embrionarios y larvarios de M. mercenaria y C. virginica. El aislado mayoritario asociado a estas manchas rosas resulta ser una cepa de Pseudomonas sp. Que crece en colonias pigmentadas en rojo. Los experimentos realizados demuestran que esta bacteria es capaz de producir la coloración rosa en recipientes de polietileno, tanto por inóculo de su cultivo líquido como de las células lavadas, pero no cuando el material es polipropileno
TABLA 2. Resumen de la bibliografía publicada sobre patologías larvarias de moluscos bivalvos causadas por bacterias del género Pseudomonas.
En cuanto a la importancia del fenómeno para los cultivos, el factor crítico no es la aparición de la mancha en sí, sino el número de células bacterianas. Así, el desarrollo de embriones de M. mercenaria inoculados con hasta 10³ células bacterianas por mililitro no se ve alterado, pero sí aparecen problemas graves cuando las concentraciones superan este valor. Los inóculos con filtrados de los cultivos líquidos o inactivados por calor no tienen efecto patógeno alguno.
La cepa es también patógena para C. virginica (BROWN 1981b), según se desprende de los experimentos llevados a cabo con huevos fertilizados de esta especie. Realiza ensayos con la cepa salvaje, con pigmento rojo, y mutantes sin pigmento y con pigmento amarillo o rosa, demostrando la implicación de esta sustancia. Mientras el mutante blanco no tiene efectos negativos, las cepas pigmentadas son responsables de retrasos en el crecimiento y formación anormal de la concha, en mayor o menor grado. Las larvas expuestas al mutante rosa presentan la línea media cóncava, en lugar de recta. En presencia del mutante amarillo y la cepa roja, el retraso del crecimiento y la formación de la concha son evidentes, de forma más acusada con la cepa salvaje. Los resultados obtenidos con la exposición directa al pigmento son muy similares.
La virulencia de esta Pseudomonas sp. está relacionada y varía con la pigmentación, no siendo esencial la invasión bacteriana (BROWN 1983), ya que se obtienen los mismos efectos utilizando células lavadas sonicadas que células sin lavar en crecimiento activo. Es interesante el resultado de los experimentos realizados con el mutante blanco junto con el extracto del pigmento, que hace que la cepa se vuelva invasiva y se observe «swarming» bacteriano alrededor de las larvas. Estos datos sugieren que la mortalidad puede ocurrir sin invasión bacteriana, siendo las bacterias invasivas sólo cuando las larvas están ya debilitadas.
Se obtienen también aislados patógenos del género Pseudomonas de muestras tomadas en un criadero de O. edulis en Galicia (LODEIROS et al. 1987). Los autores calculan el valor de patogenicidad asociando valores numéricos a los diferentes signos de la enfermedad causada, en función de las alteraciones de la actividad vital de las larvas, en las valvas y el efecto necrótico. Según los resultados obtenidos en los experimentos de patogenicidad con larvas de ostra plana, dos cepas de Pseudomonas sp. y una de Ps. aeruginosa resultan letales para los cultivos. En todos los casos, la enfermedad cursa con los signos descritos para la necrosis bacilar y la patogénesis tipo I. Los aislados proceden de larvas de ostra, y en el caso concreto de Ps. aeruginosa se aísla durante un episodio de mortalidades en el criadero. El hecho de que Pseudomonas sea el género predominante en la microbiota asociada a los reproductores, junto con el aumento en los contenidos de vibrios en reproductores acondicionados en el criadero, especialmente en las gónadas, hace pensar en una posible transmisión vertical de los patógenos.
Se aísla también una cepa de Pseudomonas sp. como predominante en una epizootia en cultivos larvarios de vieira tropical, Euvola ziczac, junto con vibrios del tipo V. anguillarum y V. alginolyticus (LODEIROS et al. 1992). Los ensayos en laboratorio demuestran que la mortalidad larvaria se debe a la invasión bacteriana y en menor medida a la acción de endotoxinas, pero no a exotoxinas. Por tanto, parece que la acción invasiva esté relacionada con mecanismos patógenos debidos a una endotoxina ligada a la pared bacteriana.
El aislamiento de esta cepa de Pseudomonas sp. patógena, junto con miembros del género Vibrio, sugiere para los autores la posibilidad de una actuación conjunta o secuencial de Vibrio y Pseudomonas. Dado que el mayor número de estudios se refiere a patógenos pertenecientes al género Vibrio, éstos parecen actuar como agentes iniciadores de la enfermedad, favoreciendo la invasión secundaria por bacterias con alta capacidad de metabolización de sustratos, como es el caso de esta cepa de Pseudomonas.
Aislados patógenos de este género se obtienen también de larvas moribundas de Tridacna gigas (SUTTON y GARRICK 1993), clasificados dentro de un grupo constituido por los géneros Pseudomonas, Alteromonas y Alcaligenes.
De la gónada de reproductores de otro Pectínido, Argopecten purpuratus, se aíslan también cepas del género Pseudomonas que en mayor o menor grado son responsables de la sedimentación larvaria por cese de la actividad natatoria (RIQUELME et al. 1995). Su origen, junto con el estudio comparado de la composición de las poblaciones bacterianas de reproductores y de los primeros estadíos del desarrollo, lleva a pensar a los autores en una transmisión vertical de posibles patógenos.
2.6. Enfermedades producidas por otros géneros bacterianos
En busca de los agentes responsables de los episodios de mortalidades registrados en un criadero de C. gigas, GARLAND et al. (1983) aíslan dos cepas del género Alteromonas que resultan patógenas para las larvas. La enfermedad cursa con los signos ya descritos en casos anteriores: pérdida de la movilidad larvaria, anormalidades en la estructura y función velares, y alteraciones en los órganos internos hasta su necrosis total, con la consiguiente mortalidad larvaria.
El género Moraxella se ha descrito puntualmente como patógeno para larvas de Tridacna gigas, concretamente un aislado de larvas moribundas (SUTTON y GARRICK 1993). También dos aislados obtenidos de gónada de reproductores de A. purpuratus en criadero inhiben de forma drástica la natación larvaria, causando la deposición de las larvas en el fondo de los recipientes (RIQUELME et al. 1995).
El grupo formado por los géneros Aeromonas – Plesiomonas incluye aislados patógenos obtenidos de larvas moribundas de T. gigas, de hecho el único punto del criadero donde se aíslan (SUTTON y GARRICK 1993). La patogenicidad de un aislado de la especie Aeromonas hydrophila ha sido demostrada para larvas de A. purpuratus (RIQUELME et al. 1996).
Como en el caso anteriormente mencionado, se aísla únicamente en larvas depositadas en el fondo de los tanques, moribundas, y prácticamente en cultivo puro, mientras en el resto de los compartimentos del criadero predomina los aislados del género Vibrio, concretamente de la especie V. alginolyticus, también patógenos. La proliferación en ese punto determinado del criadero parece justificada por la combinación de las condiciones de temperatura (elevada en estos cultivos) y acumulación de materia orgánica en los fondos con depósitos larvarios, que favorece el crecimiento rápido de Aeromonas. Por otro lado, el mecanismo de infección responde a la condición de patógeno oportunista secundario, con capacidad de invasión de las larvas cuando ya están moribundas por efecto de las toxinas producidas por V. alginolyticus.
TABLA 3. Resumen de la bibliografía publicada sobre patologías larvarias de moluscos bivalvos causadas por bacterias de géneros diferentes a Vibrio y Pseudomonas.
3. ENFERMEDADES DE JUVENILES Y ADULTOS
3.1. Vibriosis
La mayoría de las enfermedades de etiología bacteriana en moluscos bivalvos adultos están producidas por bacterias Gramnegativas, y particularmente pertenecientes al género Vibrio (Tabla 4).
Desde la primera descripción de mortalidades de mejillón (Mytilus californianus) adulto ocasionadas por bacterias de ZOBELL y FELTHAM (1938), se han descrito casos de mortalidades de diferentes
especies de bivalvos, incluyendo almejas (Mya arenaria, M. mercenaria, Ruditapes philippinarum), ostra (Crassostrea gigas, C. virginica, C. sikamea), vieira (Pecten maximus) o mejillón (M. edulis), producidas por diferentes especies de Vibrio como V. tubiashii, V. alginolyticus o V. splendidus entre otros (TUBIASH et al. 1965; TUBIASH 1974; ELSTON et al. 1982,1999; NOTTAGE y BIRKBECK 1990; LAMBERT et al. 1999; GAY et al. 2004 a,b). Todas estas especies bacterianas han sido ya tratadas con anterioridad en este capítulo.
3.1.1. Enfermedad del anillo marrón
La enfermedad del anillo marrón (BRD, del inglés Brown Ring Disease), causada por V. tapetis, fue la primera enfermedad de etiología bacteriana demostrada en almejas adultas (Ruditapes phillipinarum y R. decussatus) (BORREGO et al. 1996). La enfermedad, caracterizada por perturbaciones en el proceso de calcificación y la aparición de un depósito marrón en la cara interna de las valvas del molusco, es objeto de un capítulo independiente en este libro, y a él nos remitimos para una mayor información.
TABLA 4. Resumen de la bibliografía publicada sobre la relación existente entre las bacterias y patologías de moluscos bivalvos en fases no larvarias.
3.1.2. Mortalidad de verano
En cuanto al fenómeno denominado mortalidad de verano de la ostra del Pacífico (Crassostrea gigas), es un hecho bien conocido que las poblaciones juveniles de esta especie sufren de modo regular mortalidades significativas durante los meses cálidos (Tª del agua ≥ 18ºC), siendo motivo de gran preocupación para los productores de este bivalvo por las importantes pérdidas económicas que ocasiona.
Este fenómeno, descrito en diferentes países como Japón, USA, Brasil o Francia (LYPOWSKY y CHEW 1972; MEYERS et al. 1990; MORI et al. 1965), se ha asociado a condiciones de estrés como bajo contenido de oxígeno disuelto, algas nocivas, contaminantes o substancias tóxicas en el sedimento (CHENEY et al. 2000; LYPOWSKY y CHEW 1972; MORI et al. 1965; SOLETCHNIK et al. 1999). En general, se descartaba la hipótesis de una etiología microbiana ya que, aunque se habían observado en ocasiones tejidos colonizados por virus o bacterias, como herpes virus o V. splendidus (RENAULT et al. 1994, 1995; LACOSTE et al. 2001; WAECHTER et al. 2002; LE ROUX et al. 2002), ninguno de ellos pudo ser relacionado sistemáticamente con la aparición de epizootias en los cultivos (LABREUCHE et al. 2006a).
La primera evidencia de la relación entre la mortalidad de verano y un agente infeccioso la obtuvieron LIPP et al. (1976), cuando observaron que la hemolinfa de ostras moribundas contenía consistentemente un carga elevada de vibrios, los cuales provocaban mortalidad en ostra infectada experimentalmente. Posteriormente, LACOSTE et al. (2001) y GAY et al. (2004a, b) atribuyeron la causa de la enfermedad, al menos en Francia, a una infección por V. splendidus. Por su parte, WAECHTER et al. (2002) aislaron una cepa de V. chagasii, anteriormente clasificado como V. splendidus tipo II, reproduciendo la enfermedad experimentalmente. Parecía claro que diferentes especies del género Vibrio, concretamente del grupo de V. splendidus, podrían estar involucradas en la mortalidad de verano de C. gigas, sin embargo nunca se estudió de modo sistemático la prevalencia de estas especies bacterianas en ostras afectadas por la enfermedad.
En 2007, GARNIER et al. publican los resultados de un estudio de tres años en Francia en el que investigan la posible etiología bacteriana de la enfermedad, analizando las poblaciones de bacterias presentes en la hemolinfa de ostras moribundas en comparación con las de ostras sanas. Las primeras diferencias observadas fueron en la carga bacteriana de la hemolinfa, siendo mucho mayor en ostras enfermas que en ostras sanas. El estudio fenotípico y molecular de estas poblaciones, mediante técnicas de secuenciación y restricción del gen gyrB, mostró que pertenecían a un número limitado de especies bacterianas, principalmente V. aestuarianus, V. splendidus, V. natriegens, V. parahaemolyticus y Pseudoalteromonas sp., siendo V. aestuarianus la especie
aislada más frecuentemente (56%). Con una prevalencia menor (25%) aparecía V. splendidus. Además, los aislados de ambas especies resultaron ser patógenos para la ostra, demostrándose para V. aestuarianus la producción de factores extracelulares con actividad inmunosupresora sobre las funciones de los hemocitos (desregulación del metabolismo oxidativo de los hemocitos) y letales para los animales a bajas concentraciones (3,3 μg/g) (LABREUCHE et al. 2006a,b).
En función de todos estos resultados la teoría más aceptada hoy en día es, que la mortalidad de verano de la ostra C. gigas es el resultado de interacciones más o menos complejas entre el estado fisiológico y/o genético del hospedador, factores ambientales y uno o más agentes infecciosos que actúan más como oportunistas que como verdaderos patógenos (LABREUCHE et al. 2006b).
3.2. Enfermedad Juvenil de la ostra
La enfermedad juvenil de la ostra (JOD, del inglés Juvenile Oyster Disease) fue detectada por primera vez en poblaciones cultivadas de Crassostrea virginica en la costa nororiental de los Estados Unidos de América a finales de la década de 1980 (BRICELJ et al. 1992). La enfermedad afecta principalmente a ostras inferiores a 25 mm de altura de concha, y puede llegar a causar mortalidades del 90% de la producción anual (BRICELJ et al. 1992; DAVIS y BARBER 1994). Las mortalidades suelen comenzar entre 1 y 2 semanas después de la aparición de los primeros síntomas, aunque la intensidad de estos, así como la progresión de la enfermedad varían en función del tamaño de la ostra y su condición metabólica (BRICELJ et al. 1992; DAVIS y BARBER 1994). En las áreas afectadas, la enfermedad presenta frecuencia anual, apareciendo generalmente cuando la temperatura del agua alcanza los 20 ºC (BRICELJ et al. 1992; DAVIS y BARBER 1994; FORD y BORRERO 2001).
Los principales signos de la JOD son cese del crecimiento, bordes irregulares de las valvas y un ahuecamiento exagerado de la valva inferior seguido de un depósito de capas sucesivas de conchiolina en la superficie interna de las valvas alrededor de la periferia del manto (BRICELJ et al. 1992; FORD y BORRERO 2001). Si el animal sobrevive a la enfermedad, puede observarse la retracción del manto. Además del depósito de conchiolina, se han observado otras respuestas patológicas en la región extrapalial, incluyendo cambios en el recuento de hemocitos en hemolinfa y líquido intervalvar (PAILLARD et al. 1996), o lesiones en la superficie del manto (BRICELJ et al. 1992; FORD y BORRERO 2001).
La naturaleza transmisible de la enfermedad se demostró en experimentos de cohabitación con ostras afectadas y mediante inoculaciones de extractos de ostras enfermas o de filtrados de agua que contenía ostras afectadas (LEWIS et al. 1996; PAILLARD et al. 1996). La etiología de la JOD fue, sin embargo, más difícil de demostrar. Tras sugerirse que podría estar causada por bacterias o parásitos observados ocasionalmente en las lesiones de la ostra o en las capas de conchiolina (BOARDMAN 2005), en 1997 se confirmó la primera opción, ya que el empleo de agentes antibacterianos retrasaban y reducían la mortalidad de la enfermedad (BOETTCHER et al. 1999). Posteriores estudios revelaron que las ostras afectadas por JOD estaban fuertemente colonizadas por una nueva especie de alfa-proteobacteria dentro de la rama de Roseobacter (BOETTCHER et al. 1999), que ha sido caracterizada y designada como Roseovarius crasostreae (BOETTCHER et al. 2005). La inoculación experimental de ostras con esta bacteria resultó en un desarrollo de signos clínicos y mortalidades similares a las producidas por la JOD (BOETTCHER et al. 2000; MALOY et al. 2007), demostrándose la etiología de la enfermedad. De hecho se ha propuesto un cambio en el nombre de la enfermedad, que pasaría a denominarse «Roseovarius oyster disease (ROD)» para evitar confusiones con otras enfermedades de ostras en estadío juvenil (MALOY et al. 2007).
Se han llevado a cabo algunos estudios de patogénesis, concretamente sobre la localización y naturaleza de las interacciones entre R. crassostreae y C. virginica, observándose, tanto por microscopía electrónica como por métodos moleculares y de cultivo, que la localización primaria del patógeno es en la cara interna de las valvas y los depósitos de conchiolina (BOARDMAN et al. 2008), más que el manto o el fluido palial. Además, las células bacterianas estaban adheridas por los polos, lo que es consistente con la expresión de fimbrias polares por la bacteria (BOARDMAN et al. 2008). Estas observaciones se ajustan al proceso patológico observado en infecciones naturales y se ha sugerido que dicha localización, quizá en forma de biopelícula, podría ayudar a la bacteria a evitar ciertos mecanismos de defensa del hospedador como la acción de hemocitos.
En cuanto a diagnóstico, se ha desarrollado un protocolo de PCR para detección de R. crasostreae directamente a partir de tejidos de ostra (MALOY et al. 2005), basado en la amplificación de la región ITS (internal transcriber spacer) entre los genes 16S y 23S rRNA, con una confirmación posterior por restricción del amplicón. El método tiene una gran especificidad y sensibilidad (10 células bacterianas/ostra), y podría ser de gran utilidad, no sólo en el establecimiento y mejora de métodos preventivos de la enfermedad, sino también en estudios epizootiológicos y de patogénesis de la JOD.
3.3. Infecciones por procariotas de tipo Rickettsia
La presencia de procariotas intracelulares ha sido descrita en diversos invertebrados marinos (HARSHBARGER & Chang 1977; BUCHANAN 1978; OTTO et al. 1979; MEYERS 1981; COMPS 1983; GULKA et al. 1983; MORRISON y SHUM 1983; ELSTON y PEACOCK 1984; ELSTON 1986; MIALHE et al. 1987; HINE y DIGGLES 2002), sugiriéndose en algunos casos una asociación con mortalidades (GULKA et al. 1983). Sin embargo, durante mucho tiempo ha sido objeto de controversia si estas infecciones producían algún daño significativo en el hospedador (ELSTON 1986).
En marzo de 1987 ocurrió una mortalidad masiva (aprox. 40%) de vieira (Pecten maximus) en St. Brieuc, una localidad situada en el norte de Bretaña (Francia). El estudio anatómico-patológico subsecuente reveló la presencia de una infección bacteriana en las células endoteliales de las branquias (LE GALL et al. 1988). Las bacterias aparecían formando colonias intracelulares basófilas, con tamaño variable, pudiendo llegar incluso a obstruir espacios sanguíneos. En ocasiones, los microorganismos aparecían libres, posiblemente en fase de dispersión de la infección (LE GALL et al. 1988). Pese a que, en este trabajo, no pudieron demostrarse los postulados de Koch, y por tanto la patogenicidad de estos microorganismos, los autores sugerían que la intensidad de la infección apoyaba la hipótesis de que la funcionalidad de las branquias estaba comprometida (LE GALL et al. 1988). Algunos años más tarde, se consiguió purificar el microorganismo mediante centrifugaciones diferenciales en gradientes de sacarosa y renografina (LE GALL y MIALHE 1992), realizándose estudios de caracterización de estos. Así, se demostró que presentaban diferentes actividades enzimáticas, algunas de las cuales, como la catalasa o la fosfatasa ácida, podían relacionarse con la patogenicidad de estos procariotas intracelulares. Por otro lado, los estudios de microscopía electrónica demostraron su relación con el grupo Rickettsia, al permitir dilucidar algunas de sus características estructurales, concretamente de la pared celular.
En años posteriores se describieron casos, también asociados a mortalidades, en almeja (Venerupis rhomboides) en Galicia (España) (VILLALBA et al. 1999), ostra perlífera tropical (Pinctada maxima) y ostra australiana (Crassostrea ariakensis) en China (WU y PAN 1999; SUN y WU 2004). En estos casos, un procariota intracelular tipo Rickettsia fue el único patógeno observado y, por tanto, probable causante de las mortalidades. En el caso de la almeja, la infección estaba localizada en el epitelio branquial, mientras que en la ostra se observó una infección más generalizada, detectándose el microorganismo no sólo en branquias sino también en digestivo, manto y hepatopáncreas.
En todas las descripciones de organismos tipo Rickettsia en moluscos existen características comunes que incluyen entre otras, el ser parásito obligado con formación de inclusiones citoplasmáticas observables histológicamente (Fig. 4), tener morfología pleomórfica, carácter Gramnegativo, con pared celular de tipo bacteriana con membrana externa, una zona periplasmática con ribosomas densa a los electrones y con fisión binaria como modo de multiplicación (LE GALL et al. 1988; VILLALBA et al. 1999; WU y PAN 1999; WU et al. 2005). Si bien la mayoría de las descripciones hablan de inclusiones basófilas (HARSHBARGER & Chang 1977; MEYERS 1981; COMPS 1983; GULKA et al. 1983; MORRISON y SHUM 1983; ELSTON y PEACOCK 1984; ELSTON 1986; MIALHE et al. 1987; NORTON et al. 1993a; RENAULT y COCHENNEC 1994; WEN et al. 1994; HINE y DIGGLES 2002), en algunos casos se han observado inclusiones con carácter eosinófilo, incluso en el mismo hospedador (MEYERS 1981; NORTON et al. 1993b; WEN et al. 1994), sin que se conozca la razón de esta diferencia en la tinción. Se ha sugerido que podría deberse a diferencias entre distintas especies de Rickettsia o a diferentes estadíos de las inclusiones (SUN y WU 2004).
Ya hemos mencionado la controversia sobre la patogenicidad de estos procariotas para moluscos marinos y el daño que pueden causar en las células del hospedador. Mientras que algunos autores señalan su papel determinante en la mortalidad y la enfermedad (GULKA et al. 1983; LE GALL et al. 1988; NORTON et al. 1993 a,b; WU y PAN 1999, 2000; VILLALBA et al. 1999). Otros autores sugieren que estos microorganismos no producen daños a las células del hospedador o causan únicamente una patología limitada (FRIES y GRANT 1991; MORRISON y SHUM 1983).
Hay algunas evidencias que apoyarían la primera hipótesis. Entre ellas, y debido a que las células que sufren la infección en el hospedador son no fagocíticas (células epiteliales en general), estos organismos poseen probablemente mecanismos de penetración e infección de las células del hospedador. Las rickettsias no matan las células por producción de toxinas, sino por destrucción celular (WINKLER 1990; ROMERO et al., 2000). Estos hechos son consistentes con los resultados de algunos de los trabajos realizados con moluscos que describen las células infectadas repletas de bacterias hasta su ruptura y la liberación de la progenie bacteriana (VILLABA et al. 1999; WU y PAN 1999; SUN y WU 2004; WU et al. 2005).
La hipótesis más aceptada hoy en día es que estos microrganismos podrían presentar baja virulencia y que el grado de los daños producidos podría estar relacionado con el grado de infección.
FIGURA 4. Localización de inclusiones de organismos tipo Rickettsia en branquia (A) y células digestivas (B) de almeja fina (Ruditapes decussatus).
Así, sólo en casos de infecciones masivas que impedirían por acción mecánica la actuación de importantes funciones fisiológicas, se presentaría una patología significativa.
3.4. Nocardiosis
En 1945 se detectaron por vez primera en Japón mortalidades en ostras del Pacífico (C. gigas) durante los meses de verano (IMAI et al. 1965). Algunos años más tarde, en 1956, mortalidades similares ocurrieron en América del Norte (PERDUE et al. 1981).
Las primeras hipótesis sobre las posibles causas de la enfermedad fueron un estrés fisiológico inducido por un metabolismo elevado o la maduración de las gónadas en condiciones de alta concentración de nutrientes y elevadas temperaturas (IMAI et al. 1965; MORI et al. 1975; PERDUE et al. 1981). Sin embargo, la presencia de alteraciones patológicas en el tejido conectivo circundante al tracto digestivo, hacía sospechar de una naturaleza infecciosa, probablemente producida por una bacteria Gram positiva (NUMACHI 1965). En 1991, FRIEDMAN y HEDRICK aislaron una bacteria perteneciente al género Nocardia a partir de ostras enfermas cultivadas en el estado de Washington (USA) y en la Columbia Británica (Canadá), y nombraron la enfermedad como Nocardiosis de la ostra del Pacífico (PON, del inglés Pacific Oyster Nocardiosis).
La caracterización fenotípica y genética de las cepas aisladas a partir de ostras enfermas demostró que se trataba de una nuevas especie dentro del género Nocardia, recibiendo el nombre de Nocardia crassostreae (FRIEDMAN et al. 1998), siendo las especies más cercanas filogenéticamente N. otitidiscavarium y N. seriolae. La enfermedad, tanto en infecciones naturales como experimentales, se caracteriza por no presentar prácticamente síntomas externos. En casos de infecciones leves, los animales enfermos pueden presentar áreas de decoloración en el manto, mientras que en casos más graves se ha observado la aparición de nódulos verdosos o amarillentos en la mayoría de los tejidos incluyendo músculo abductor, branquias, corazón y manto (FRIEDMAN y HEDRICK 1991). Estos nódulos están formados por hemocitos y bacterias Grampositivas y con característica de ácido alcohol resistencia.
3.5. Otras enfermedades de etiología bacteriana
Se han descrito infecciones por representantes de los géneros Chlamydia y Mycoplasma en una amplia variedad de moluscos bivalvos adultos, incluyendo ostra, vieira, almeja, mejillón o berberecho, sugiriéndose su potencial patogénico (HARSHBARGER y CHANG 1977; JOLY y COMPS 1980; ELSTON 1986; BOWER y MEYER 1991; CAJARAVILLE y ANGULO 1991; BOWER 1992; AZEVEDO 1993; NORTON et al. 1993b; RENAULT y COCHENNEC 1995; SVÄRDH 1999; HINE y DIGGLES 2002; WARD et al. 2004; MOSS et al. 2007).
La mayoría de las descripciones son mediante estudios histológicos en los que se han observado prevalencias muy variables, y en ocasiones algunos daños en los tejidos del hospedador relacionados con la intensidad de la infección, como en el caso de rickettsias (SVÄRDH 1999; WARD et al. 2004). La transmisión vertical, en el caso de clamidias, y la posibilidad de zoonosis, por ambos tipos de microrganismos, son aspectos que están siendo investigados.
El género Cytophaga también ha sido descrito como causante de lesiones en juveniles de la ostra Crassostrea gigas. DUNGAN y ELSTON (1988), en un primer estudio relacionado con mortalidades en juveniles de C. gigas, observan mediante microscopía electrónica las lesiones degenerativas del ligamento que presentan los ejemplares. Detectan así la presencia de poblaciones bacterianas densas y homogéneas asociadas al «resilium» en proceso de degradación. El «resilium» es uno de los dos componentes estructurales del ligamento, responsable de la apertura de las valvas por oposición al músculo abductor, lo que hace que una pérdida de sus funciones redunde en problemas de alimentación, respiración y excreción, es decir, en un debilitamiento fisiológico. Además, supone una pérdida de la barrera mecánica que impide el acceso a la cavidad paleal y a los tejidos blandos de patógenos o factores ambientales tóxicos.
Bacterias pertenecientes al género Cytophaga resultan ser dominantes o codominantes en estas poblaciones. Mediante experimentos in vitro demuestran la capacidad de estos aislados de utilizar y de gradar el ligamento («resilium»), cuando éste es la única fuente de carbono y nitrógeno (DUNGAN et al. 1989).
Los resultados, aunque no son concluyentes en lo que se refiere a la relación directa del género Cytophaga con los daños observados en los tejidos blandos, sí apoyan la hipótesis de que las lesiones en el ligamento que ocasionan disminuyen la resistencia de las ostras a la colonización por otros microorganismos patógenos.
4. DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES BACTERIANAS
El diagnóstico tradicional de enfermedades bacterianas pasa por el aislamiento, en medios generales o selectivos (Fig. 5), y la caracterización bioquímica de los cultivos puros de los microorganismos aislados, ya que en la mayoría de los casos no existe una sintomatología específica que pueda ser asociada con la infección por una especie bacteriana determinada y que, por tanto, pueda ayudar en el diagnóstico. Los procedimientos largos y tediosos que resultan del empleo de métodos clásicos en tubo en placa (LEMOS et al. 1985; ROMALDE et al. 1990; PRADO et al. 2005), pueden reducirse en gran medida mediante el empleo de sistemas miniaturizados (i.e. API 20E, API 50CH o API ZYM) (Fig. 6). Sin embargo, hay que tener en cuenta que la mayoría de estos sistemas han sido diseñados para su uso en clínica humana y, en consecuencia, las bases de datos que utilizan para la identificación de los microorganismos pueden no ser muy completas en el caso de patógenos de moluscos. Además, en algunos casos se han descrito resultados falsos, positivos o negativos, para algunos patógenos en acuicultura (ROMALDE y TORANZO 1991; SANTOS et al. 1993).
Por otro lado, en el caso de los miembros del género Vibrio, y a pesar de que se han descrito algunas claves identificativas (ALSINA y BLANCH 1994), la existencia de variabilidad intraespecífica, en algunos casos, y el incremento espectacular en los últimos años en el número de especies dentro del género, hacen que su utilidad hoy en día sea limitada. Es destacable el caso del grupo de V. splendidus donde en los últimos años se han descrito más de 8 especies nuevas a partir de moluscos y otros hospedadores, presentando algunas de ellas como Vibrio crassostreae potencial patogénico (FAURY et al. 2004; LE ROUX et al. 2005; LE ROUX y AUSTIN 2006).
Estos hechos han impulsado en gran medida el uso de métodos moleculares para el diagnóstico de enfermedades en acuicultura y la identificación de patógenos, principalmente basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o en la secuenciación (CUNNINGHAM 2002; SAVAN et al. 2005).
FIGURA 5. Poblaciones de vibrios obtenidas a partir de muestras de moluscos en el medio selectivo TCBS (tiosulfato-citrato-bilis-sacarosa) agar.
FIGURA 6. Perfiles obtenidos para una cepa de Vibrio neptunius con los sistemas miniaturizados API 20E (a) y API ZYM (b).
Así, se han descrito protocolos de PCR específicos para la detección de Roseovarius crassostreae, agente de la enfermedad juvenil de ostra (JOD) (MALOY et al. 2005) o de Vibrio tapetis, causante de la enfermedad del anillo marrón (Fig. 7) (ROMALDE et al. 2007), entre otros. Por otro lado, la secuenciación de los genes de RNA ribosómico 16S y de otros genes conservados (genes «housekeeping») han permitido situar taxonómicamente nuevos patógenos de moluscos como V. neptunius, V. ostreicida , V. aestuarianus, o Nocardia crassostreae (FRIEDMAN et al. 1998; PRADO et al. 2005, 2008; GARNIER et al. 2007).
FIGURA 7. Detección de V. tapetis por PCR en agua intervalvar de almejas infectadas. Líneas: M: marcador de peso molecular; 1 a 6, almejas procedentes de poblaciones naturales; 7, Control negativo; 8, Control positivo. Los números indican el tamaño en pares de bases del marcador (izquierda) y del fragmento específico (derecha).
Mención aparte merecen los procariotas intracelulares de los grupos Rickettsia y Chlamydia. La falta de un línea celular de moluscos en la que poder cultivarlos in vitro hace imposible hasta el momento su aislamiento, y su estudio se ha realizado mediante purificación de las células bacterianas en gradientes de densidad y la posterior caracterización electroforética de las proteínas mayoritarias, la identificación bioquímica de sus enzimas o la preparación de sueros policlonales para trabajos serológicos (MIALHE et al. 1985, 1988; LE GALL et al. 1992; WU et al. 2005). Además, en los últimos años se están llevando a cabo estudios de caracterización genética de Rickettsias de moluscos bivalvos, mediante la amplificación del DNA bacteriano a partir de los tejidos infectados y su posterior análisis mediante secuenciación o tipado molecular.
Como se ha mencionado con anterioridad, se ha demostrado en muchas especies bacterianas patógenas de bivalvos variabilidad intraespecífica que en ocasiones, puede llevar aparejada una variabilidad en las características de virulencia de las cepas.
El tipado intraespecífico será por tanto una herramienta útil en el estudio de los patógenos bacterianos, no sólo desde el aspecto taxonómico, sino también en el epidemiológico (VAN BELKUM et al. 2001; ROMALDE 2005). Desde un punto de vista epidemiológico, las técnicas de tipado molecular y/o genético pueden ser de gran ayuda en el reconocimiento de brotes de enfermedad, en determinar el origen de la infección, la detección de cepas con particular virulencia, así como en el estudio de la distribución geográfica y del rango de hospedadores de posibles variantes de un patógeno específico (ROMALDE 2005).
Entre otras técnicas de tipado genético, el ribotipado, el análisis de polimorfismos de los fragmentos de restricción (RFLP, del inglés «Restriction Fragment Lenght Polymorphisms»), la electroforesis de campos pulsados (PFGE, del inglés «Pulsed Field Gel Electrophoresis »), el estudio de los polimorfismos de fragmentos de amplificación (AFLP-PCR, del inglés «Amplification Fragment-Length Polymorphism-PCR»), la amplificación aleatoria de DNA (RAPD, del inglés «Random amplified polymorphic DNA»), o la PCR de elementos repetitivos (Rep-PCR, del inglés «Repetitive element PCR»), han sido utilizadas para el estudio de patógenos de moluscos (CASTRO et al. 1997; ROMALDE et al. 2002; RODRIGUEZ et al. 2006; WANG et al. 2006; GARNIER et al. 2007).
5. CONSIDERACIONES FINALES
En este capítulo hemos intentado hacer una revisión lo más actualizada posible del estado actual de los conocimientos sobre patología bacteriana de moluscos bivalvos. Es esperable que en un futuro próximo, con la posible diversificación de especies de bivalvos en cultivo y con la incorporación de nuevas áreas geográficas al cultivo intensivo de estos organismos, aparezcan nuevas especies con potencial patogénico para diferentes tipos de bivalvos.
El pronto conocimiento de los nuevos patógenos podrá ser de gran ayuda para su control que pasa, debido a las especiales características del cultivo de bivalvos, especialmente de juveniles y adultos, por el establecimiento de medidas preventivas adecuadas y la limitación de movimientos de individuos afectados. El desarrollo de nuevos métodos moleculares de diagnóstico será crucial para lograr tales objetivos. Además, su aplicación en estudios acerca de los patógenos en cultivos en criadero permitirá un mejor conocimiento de la distribución del patógeno en los diferentes compartimentos de la instalación y las posibles transmisiones entre ellos. También permitirá identificar la etiología exacta de la enfermedad, las rutas de infección y el modo de acción de los patógenos.