3. Materiales y Metodología
3.1. Materiales
Se utilizó una serie de reactivos, equipos e insumos necesarios para realizar de forma correcta las metodologías aplicadas. Estos son específicos para cada una de las técnicas utilizadas para determinar: actividad proteolítica, glutación peróxidasa y metaloproteinasas.
3.2. Metodología
3.2.1. Diseño experimental
El estudio se realizó en músculo de salmón ocho cultivado por Ewos Innovation Chile, en piscicultura ubicada en Colaco, X Región de Chile, donde se dispuso de jaulas separadas para ensayar 3 tipos de dieta: Dieta I o Control, Dieta II (Exceso de Tocoferoles) y Dieta III (Extracto de Romero), las cuales se diferencian en el tipo de antioxidante adicionado tanto a la harina como al aceite de pescado.
En el mes de Septiembre, cuando los salmones pesaban en promedio 1.500 g, se separaron en 3 jaulas independientes y se les alimentó con las dietas antes mencionadas. El ensayo se prolongó hasta el período de cosecha, Diciembre, cuando el peso promedio fue de 2.500 g por individuo.
Los salmones fueron procesados, tipo HG (sin cabeza, sin vísceras, sin agallas), en la planta Fitz Roy de la procesadora Mainstream, también ubicada en Colaco. Se congelaron en túneles, se glasearon, y cada individuo se envasó en bolsa de polipropileno, luego en caja de aislapol para ser enviados a la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la Universidad de Chile.
El estudio consistió en analizar para cada dieta, 5 individuos, cada tres meses de almacenamiento congelado a –18º C (Figura 5).
3.2.2. Métodos
3.2.2.1. Actividad proteolítica
La AP, en músculo de salmón, fue determinada por un procedimiento de autolisis, de acuerdo con lo expuesto por Pacheco-Aguilar y Crawford (1994), con algunas modificaciones.
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Preparación de la muestra
Se separaron 4 muestras de 3 g de músculo de salmón cada una. A cada muestra se agregó 3 ml de NaCl 0,1M frío y agitó. Luego, tres de las muestras fueron incubadas en un baño de agua termorregulado a 60º C por 30 minutos. La muestra restante (control) fue puesta en hielo, también por 30 minutos. Después de la incubación, se deben adicionar 6 ml de solución de ácido tricloroacético 10% (TCA) frío a cada uno de los tubos para terminar la reacción, inclusive a la muestra de control.
Todas las muestras ya tratadas con TCA fueron mantenidas a una temperatura entre 2 – 4º C por 30 minutos. Entonces éstas fueron filtradas a través de un papel Whatman No 1. El filtrado fue recibido y mantenido a temperatura de refrigeración, ya que corresponde al extracto enzimático con el cual se continuó el análisis.
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Determinación de la actividad proteolítica
La actividad enzimática se determinó utilizando el método expuesto por Bradford en 1976, modificando lo expuesto por Pacheco-Aguilar y Crawford (1994) quienes utilizan el método de Lowry (1951) (Anexo 3).
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Análisis estadísticos
Se realizó un tratamiento estadístico de los datos obtenidos para determinar si existen o no diferencias significativas entre los factores involucrados en la determinación de AP. Además se realizó una correlación de Pearson con propiedades físicas y sensoriales del salmón. Para tal propósito se utilizó el programa computacional Statgraphics Plus versión 4.0.
3.2.2.2.Glutatión peróxidasa
Figura 5: Diagrama que muestra el Diseño Experimental
La actividad de la enzima GSH - Px en el músculo de Salmón coho, fue determinada mediante un ensayo acoplado a glutatión reductasa, de acuerdo con lo expuesto por Chiu y cols. En 1976.
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Preparación de la muestra
Para la determinación y cuantificación de glutatión peróxidasa, se preparó un extracto enzimático de acuerdo a Aubourg y cols. (2004), con algunas modificaciones.
La enzima fue extraída por homogeneización de la 1 g de muestra con 4 ml de solución de NaCl 0,1M, en reemplazo de KCl. Luego se centrifugó hasta la separación del sobrenadante de los restos de músculo.
El sobrenadante obtenido fue usado para medir la actividad enzimática de acuerdo al método de Chiu y Cols. En 1976.
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Determinación de glutatión peróxidasa
Se realizó un ensayo acoplado a glutatión reductasa y la razón de oxidación de NADPH fue medida espectrofotométricamente a 340 nm. La mezcla a reaccionar consiste en 150 μl de 2,5 mM de glutatión reducido, 100 μl de peróxido de hidrógeno, 150 μl de 1,2 mM de NADPH, 0,45 unidades de glutatión reductasa (1 unidad oxida 1ųmol por minuto), 150 μl de 0,91 mM EDTA, y 150 μl de 500 mM de buffer Tres Hcl (pH 7,6).
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Análisis estadísticos
Se realizó un tratamiento estadístico de los datos obtenidos para determinar si existen o no diferencias significativas entre los factores involucrados en la determinación de GSH - Px. Además se realizó una correlación de Pearson con propiedades del salmón e indicadores de oxidación y deterioro del mismo. Para tal propósito se utilizó el programa computacional Statgraphics Plus versión 4.0.
3.2.2.3. Metaloproteinasas
La metodología a seguir para la determinación de la enzima se basa en lo expuesto por Pozo (2003), con algunas modificaciones en la concentración de los geles.
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Preparación de la muestra
La muestra se obtuvo mediante un corte en el músculo del Salmón coho, en el cual se introdujo papel Whatman N°1, de 7 mm de ancho por 40 mm de largo, durante 1 hora. Luego, el papel fue retirado del músculo del salmón e introducido en 180 μl de Tris-HCl 1M pH 6,8 y fue agitado; de esta solución se tomó 15 μl los cuales se mezclaron con 5 μl de tampón desnaturante en condiciones no reductoras, Tris-Hcl pH 6,8 y SDS, obteniéndose así la muestra tratada para ser llevada a un gel.
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Preparación de los geles
Las enzimas buscadas tienen actividad gelatinásica en presencia de un ión metálico, lo cual se explica la presencia de gelatina, como sustrato, en el gel separador. Los geles se realizaron de 1 mm de espesor, el gel separador se realizó al 10% de acrilamida y el concentrador al 5% de acrilamida. En cada calle del gel, se agregó 30 μl de muestra tratada, y se aplicaron 200 volts durante un período de tiempo de 45 minutos, en una solución de tampón de electrodos.
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Determinación de la actividad enzimática
Una vez realizada la electroforesis, que produce la separación de las proteínas por peso molecular, las enzimas se reactivaron mediante lavado en 50 ml de una solución de tritón X-100 al 2,5 % por 30 minutos a temperatura ambiente con agitación orbital y luego fueron incubadas por 48 horas a 37° C en una solución de CaCl₂ 5 mM, NaN³ 0,02%, Tris-HCl 50mM pH 8. Se reveló por tinción con una solución compuesta de 5 partes de metanol, 5 partes de agua, 2 partes de ácido acético y 0,1% de azul de coomasie R-250, por un mínimo de 6 horas y posterior lavado con una solución desteñidora de ácido acético al 10%. La actividad corresponde a bandas transparentes sobre fondo azul de gelatina sin degradar.
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Análisis estadísticos
Se realizó un análisis computacional en el programa UN SCAN IT, el cual determina los pixeles en las bandas que presentan actividad gelatinásica. Luego, mediante el uso del programa computacional Statgraphics Plus versión 4.0, se realizó un tratamiento estadístico de los datos para determinar si existen diferencias significativas (p < 0,05) en la intensidad de las bandas para el período de almacenamiento y cada una de las diferentes dietas de engorda. Además se realizó una correlación de Pearson con propiedades del salmón y también se correlacionó con los parámetros de AP, GSH – Px y peso de los individuos.