10. RESPUESTA INMUNE DE MOLUSCOS
Resumen
La alta densidad de cultivo a la que se ven sometidos los moluscos incrementa la posibilidad de que se vean afectados por algún organismo patógeno. Para hacer frente a estos patógenos, los invertebrados, a diferencia de los vertebrados, tan sólo poseen mecanismos de defensa inespecíficos (la conocida como inmunidad innata). Dentro de estos mecanismos de defensa inespecíficos se encuentran los mecanismos de defensa humorales y los celulares, los primeros se llevan a cabo por proteínas que se encuentran disueltas en la hemolinfa y los segundos están mediados por hemocitos. Dentro de las proteínas disueltas en la hemolinfa que actúan como mecanismo de defensa se encuentran la lisozima, las lectinas, las opsoninas, las hemolisinas, las hemaglutininas, los péptidos antimicrobianos, etc.
Dentro de las respuestas inmunes de los hemocitos destacan: la respuesta inflamatoria, la fagocitosis, la agregación, la encapsulación y la liberación de radicales tóxicos (de oxígeno y de nitrógeno).
​1. INTRODUCCIÓN
La explotación de moluscos es una actividad importante económicamente en todo el mundo, y se ha visto intensificada en el último siglo. El confinamiento y la alta densidad a la que se ven sometidos los moluscos en cultivo incrementan la importancia de los organismos patógenos y de la respuesta frente a los mismos.
El mejillón, al igual que el resto de los invertebrados, sólo posee mecanismos de defensa inespecíficos, es decir no presenta memoria inmunológica. Los mecanismos de defensa humorales se llevan a cabo por proteínas que se encuentran disueltas en la hemolinfa mientras que el componente de la inmunidad celular está mediado por células sanguíneas o hemocitos.
2. EL HEMOCITO
El término hemocito fue propuesto por Farley en 1968 y desde ese momento se acuñó este nombre para designar a las células circulantes de la hemolinfa de moluscos bivalvos (Farley 1968). Los hemocitos están implicados en numerosas funciones tanto fisiológicas (digestión y excreción) (Narain 1973) como de tipo inmune, siendo responsables de la defensa frente a patógenos (Bayne 1980; Feng 1988).
A pesar de la diversidad de criterios para intentar clasificar los hemocitos, según la naturaleza de los orgánulos citoplasmáticos o en función de la tinción y morfología del núcleo (Feng 1971), hasta el momento se sigue manteniendo en vigor la clásica clasificación en función del tipo y número de granulocitos del citoplasma, propuesta por Cheng en 1981 y basada en observaciones a través del microscopio electrónico de transmisión. Según este esquema, en la población celular de los hemocitos se diferencian hialinocitos, con un citoplasma claro y pocos o ningún gránulo y hemocitos granulares o granulocitos con un citoplasma bien desarrollado y con numerosos gránulos. Se han considerado, a mayores, otras acepciones para clasificar los hemocitos de bivalvos, los «agranulares» que provienen de la misma línea hematopoyética que los hemocitos granulares pero no tienen gránulos visibles y los «no granulares» que describen a los hemocitos cuyo citoplasma contiene pocos o ningún gránulo (Auffret 1988). Sin embargo, este criterio no consigue consensuar la clasificación de los hemocitos de diferentes bivalvos, ya que parece haber una gran diversidad entre familias e incluso entre especies dentro de la misma familia (Auffret 1988). En términos generales, se considera que los bivalvos tienen dos tipos de hemocitos: los granulares y los no granulares. La presencia de estos dos tipos celulares se confirmó en Mya arenaria y Mytilus galloprovincialis (Cajaraville et al. 1995).
Además de técnicas morfológicas y citoquímicas se ha utilizado también la técnica de separación de poblaciones usando gradientes de densidad que consigue diferenciar más subpoblaciones de hemocitos en Crassostrea virginica (Cheng et al. 1980), en Crassotrea gigas (Bac here et al. 1988) y en Ostrea edulis (Xue et al. 2000). La identificación de subpoblaciones mediante la utilización de anticuerpos monoclonales se consiguió en Mytilus edulis (Dyrynda et al. 1997; Pipe et al. 1997) pero no en Ruditapes decussatus cuyas poblaciones de granulocitos fueron diferenciadas en función de la acidificación de los gránulos, (López et al. 1997) técnica que se utilizó también para distinguir las subpoblaciones de la almeja Tridacna crocea (Naka yama et al. 1997).
La reciente aplicación de técnicas de citometría de flujo utilizando marcadores fluorescentes permitió además de la identificación, la caracterización funcional de cada una de las subpoblaciones de hemocitos (Xue et al. 2001; Allam et al. 2002; Hegaret et al. 2003; Lambert et al. 2003; Goedken y De Guise 2004; Bugge et al. 2007; García-García et al. 2008).
2.1. Funciones inmunes de los hemocitos
Respuesta inflamatoria
En el proceso inflamatorio intervienen tanto componentes humorales como celulares. Este mecanismo se define como el reclutamiento hemocitario y la extravasación de proteínas plasmáticas hacia el lugar de la infección (Abbas y Lichtman 2000). La respuesta inflamatoria empieza tras una lesión tisular que en ocasiones se encuentra acompañada de la entrada de un agente extraño cuya naturaleza puede ser diversa (biológica, física o química). Este proceso puede terminar con la destrucción del tejido dañado, el aislamiento del organismo invasor o la completa reparación del tejido (Feng 1988).
Las primeras barreras que deben de atravesar los patógenos para acceder al interior de un organismo, son las fisicoquímicas. En el caso de los moluscos bivalvos estas barreras se encuentran formadas por la concha y el mucus que posee enzimas con actividad bactericida (Glinski y Jarros 1997; Ratcliffe et al. 1985). Una vez superadas las barreras fisicoquímicas, son los componentes celulares y humorales los que participan en la eliminación del agente exógeno. Los hemocitos juegan un papel protagonista en la reparación tisular que se lleva a cabo, según algunos autores, siguiendo seis etapas (Des Voigne y Spa rks 1968; 1969; Ruddell 1971). La primera de ellas consiste en una migración de los hemocitos hasta el lugar de la herida (Fisher 1986; Lauckner 1983). En la segunda se lleva a cabo la formación de un tapón tras la agregación hemocitaria; en la tercera de las etapas se reemplaza el tejido dañado mediante el traslado de los hemocitos desde el interior de la lesión hacia el sitio de la herida; en cuarto lugar se produce una deposición de colágeno por parte de los fibroblastos (Ruddell 1971), en quinto lugar se eliminan los restos celulares mediante la acción fagocítica de los granulocitos y ya finalmente, en una sexta etapa se reestructura la arquitectura tisular (Ratcliffe et al. 1985; Fisher 1986; Spa rks y Morado 1988).
Fagocitosis
El término fagocitosis fue definido por primera vez por Metchnikoff (1891) como un mecanismo por el cual las células tienen la capacidad de absorber partículas alimenticias. Los organismos unicelulares más primitivos utilizan este sistema como método de ingestión de nutrientes y también está presente en procesos inflamatorios en vertebrados superiores. Se puede afirmar, por lo tanto, que la fagocitosis es un proceso conservado a lo largo de la evolución que se da de manera universal en todo el reino animal desde protozoos hasta animales superiores (Feng 1988). En moluscos bivalvos, la fagocitosis se ha detectado en diferentes especies como la vieira europea, Pecten maximus, (Mortensen y Glette 1996), la almeja fina y americana, Ruditapes decussatus y Mercenaria mercenaria (López et al. 1997; Tripp 1992) y también en el mejillón del Mediterráneo, Mytilus galloprovincialis (Carballal et al. 1997).
Este proceso puede dividirse en cinco etapas que consisten en el reconocimiento de la partícula no propia, adhesión, ingestión, destrucción y eliminación. Las dos primeras se pueden dar por el encuentro al azar entre la célula fagocítica y la partícula extraña o bien activamente mediante quimiotaxis. Los mecanismos por los cuales los hemocitos se ven atraídos hacia partículas no propias parecen estar mediados por pequeñas moléculas de naturaleza peptídica liberadas por los organismos patógenos o bien por componentes de la pared celular (Howland y Cheng 1982; Fawcett y Tripp 1994). El reconocimiento de las partículas extrañas se produce a través de la interacción entre el hemocito (probablemente receptores celulares) y diversos PAMPs (Fawcett y Tripp 1994; Feng 1988). Los procesos de adhesión constituyen la siguiente etapa del proceso fagocítico. En este paso juegan un papel primordial proteínas presentes en el suero, como las aglutininas que median la unión del agente extraño a los posibles receptores presentes en la superficie celular de los hemocitos. Sin embargo, no son los únicos factores humorales descritos en invertebrados que pueden llevar a cabo esta función (Ratcliffe et al. 1985). Tras la actuación de los mecanismos de adhesión se produce la ingestión de las partículas extrañas por parte de los hemocitos. Estos procesos de adhesión se pueden llevar a cabo mediante diferentes vías. Normalmente los hemocitos emiten pseudópodos englobando y atrapando a los microorganismos (Ratcliffe et al. 1985). A veces no se emiten pseudópodos pero sí se producen invaginaciones de la membrana plasmática para la internalización de las partículas (Ratcliffe et al. 1985; Fisher 1986; López et al. 1997). La inhibición de la polimerización de la actina reveló que el citoesqueleto juega un papel primordial en los procesos de internalización (Cheng y Howland 1982). Los últimos pasos del proceso fagocítico vienen determinados por la destrucción y digestión del patógeno. Independientemente del mecanismo de internalización utilizado, se producen vacuolas fagocíticas conocidas como fagosomas que interaccionan con los lisosomas presentes en los hemocitos (Fisher 1986). El interior del lisosoma está repleto de enzimas hidrolíticas ácidas que atacan a las vacuolas recién formadas liberando su contenido al interior de estas y destruyendo al agente patógeno (Ratcliffe et al. 1985; Fisher 1986; Carballal et al. 1997; López et al. 1997). Tras la destrucción intracelular de un patógeno se forman gránulos de glucógeno que o bien son utilizados en procesos metabólicos del hemocito o bien se liberan al suero (Fisher 1986). En ocasiones las bacterias se pueden destruir en el medio extracelular utilizando enzimas y productos intracelulares que son liberados al plasma. La liberación de estas moléculas viene determinada por los procesos de degranulación donde la lisozima y otros productos acumulados en gránulos en el citoplasma se liberan al medio mediante procesos de exocitosis (Fisher 1986).
Agregación
La agregación o formación de nódulos no es un proceso aislado, sino que aparece asociado a los mecanismos de fagocitosis. Suele ocurrir cuando la hemolinfa se encuentra invadida por un elevado número de agentes extraños y la fagocitosis por sí sola no puede eliminarlos (Ratcliffe et al. 1985). Los hemocitos, junto con otras células no fagocíticas se unen por sus filopodios que, posteriormente, se acortan para formar una maraña tisular donde quedan atrapadas las partículas no propias (Drew 1910). El proceso termina con la eliminación del patógeno y el posterior depósito de melanina. No se conocen exactamente los mecanismos por los cuales estos nódulos son capaces de combatir a los microorganismos patógenos pero se cree que la inanición que sufren dentro de los propios agregados, la producción de la melanina y de sus precursores, altamente tóxicos, junto con la liberación de enzimas intracelulares como la lisozima, pueden ser los responsables (Ratcliffe et al. 1985).
Encapsulación
Cuando un agente exógeno es capaz de superar las barreras de fagocitosis y agregación, los invertebrados ponen en marcha el proceso de encapsulación para paralizar la entrada de microorganismos (Fisher 1986; Feng 1988). Aquellas partículas cuyo tamaño supera en exceso al de un hemocito y, por lo tanto, no pueden ser fagocitadas, se ven rodeadas de hemocitos produciéndose posteriormente un depósito de fibroblastos (Tripp 1961). Se constituyen una serie de capas concéntricas donde las más internas están formadas por fibroblastos y residuos mucopolisacarídicos, y las más externas están constituidas por materiales fibrosos formando un retículo en asociación con glicoproteínas (Cheng y Rifk in 1970). La actividad primera del hemocito se centra en intentar fagocitar a la partícula extraña. Tan sólo cuando este mecanismo fracasa se produce el depósito de fibroblastos (Fisher 1986).
Liberación de radicales tóxicos
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Radicales de oxígeno:
En los procesos de fagocitosis se produce una elevada producción de radicales de oxígeno que se conoce como “estallido respiratorio y que no está asociado a la cadena mitocondrial ya que el uso de inhibidores de esta como la azida sódica o el cianuro, no consiguen reducirlo. Este consumo de oxígeno se debe a la acción del complejo multiproteico conocido como NADPH-oxidasa, que es capaz de transferir electrones desde el NADPH al oxígeno molecular. Tras el contacto de un hemocito con una partícula no propia se producen pequeñas perturbaciones en la membrana celular que hacen que los componentes del sistema NADPH oxidasa se ensamblen para formar el complejo funcional que forma el sistema enzimáticamente activo (Torreilles et al. 1996). La enzima reduce el oxígeno molecular a intermediarios de oxígeno reactivos (ROIs) como el peróxido de hidrógeno (Hâ‚‚Oâ‚‚), radical hidroxilo (OH–), el anión superóxido (Oâ‚‚–), el ácido hipocloroso (HOCl) y el oxígeno simple (1Oâ‚‚–) (Fig. 1). Los ROIs son moléculas efectoras que pueden actuar por sí mismas o bien interaccionando con los enzimas hidrolíticos que se liberan en el proceso de fagocitosis (Adema et al. 1991). La detección de ROIs se puede llevar a cabo utilizando diferentes técnicas: mediante la oxidación del nitroblue tetrazolium (NBT) que mide la producción intracelular (Pipe 1992), mediante la reducción del citocromo C espectroscópicamente que mide la liberación de ROIs al exterior celular (Pipe et al. 1997) y mediante quimioluminiscencia (QL) que permite cuantificar al mismo tiempo ambos tipos de liberación.
FIGURA 1. Representación esquemática de un hemocito fagocitando a una partícula extraña y los mecanismos moleculares que explican el estallido respiratorio.
Los ROIs son moléculas que se encuentran en un estado excitado por haber recibido electrones, por lo tanto son inestables y tienden a regresar a su estado basal, proceso en el que se liberan los electrones sobrantes acompañados de una emisión de fotones. Sin embargo, esta emisión de luz es muy débil y se emplean determinadas moléculas como el luminol hidrazido cíclico (5-amino-2,3-dihidro-1,4-ftalazinediona) (Allen y Loose 1976) para amplificar la señal. El luminol se reduce al recibir los electrones liberados por los ROIs y cuando regresa a su estado basal emite nuevamente luz y fotones, pero en esta ocasión la señal luminosa es unas 1.000 veces más intensa y por lo tanto, detectable en un luminómetro (Fig. 2). Como el luminol tiene la capacidad de entrar en la célula se puede cuantificar tanto la producción intra como extracelular (ADEMA et al. 1991; NOËL et al. 1993).
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Actualmente se ha desarrollado una nueva técnica que también permite ambos tipos de medición y que se basa en la utilización de sondas fluorescentes debido a la presencia del compuesto 2,7-diclorodihidrofluoresceínadiacetato (DCFH-DA). Como el diacetato es un grupo apolar, estas sondas difunden fácilmente a través de la membrana plasmática. Una vez en el interior celular las esterasas del citosol hidrolizan el grupo acetato dejando libre la molécula de DCFH, que ahora presenta características polares.
Las especies reactivas de oxígeno pueden ser detectadas por la diclorofluoresceína que cuando reacciona con ellas se oxida convirtiéndose en un producto fluorescente, pasando de DCFH a 2,7-diclorofluoresceína (DCF). Esta fluorescencia se puede cuantificar mediante diferentes técnicas como la citometría de flujo (Lambert et al. 2003; Goedken y De Guise 2004; Buggé et al. 2007). La producción de ROIs se ha detectado en varias especies de moluscos bivalvos como en la ostra americana (Crassostrea virginica) (Anderson 1994; Austin y Paynter 1995), la ostra japonesa (Crassostrea gigas) y la ostra plana (Ostrea edulis) (Bachère et al. 1991), la vieira europea (Pecten maximus) (Le Gall et al. 1991), la almeja americana (Mercenaria mercenaria) (Buggé et al. 2007), el mejillón azul (Mytilus edulis) (Pipe 1992) y en el mejillón del Mediterráneo (Mytilus galloprovincialis) (Torreilles et al. 1996; Ordás et al. 2000).
FIGURA 2. Representación esquemática del proceso de quimiolumiscencia.
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Radicales de nitrógeno:
La mayoría de los organismos son capaces de producir pequeñas cantidades de óxido nítrico (NO) a partir del aminoácido arginina. En esta reacción catalizada por la Óxido Nítrico Sintasa (NOS) se genera un intermediario inestable que es el NG-hidroxiarginina, que da lugar a los dos productos finales: la citrulina y el NO (Fig. 3) (Nathan y Xie 1994). Sin embargo, el NO es un gas inestable que se transforma rápidamente en nitrito (NOâ‚‚–) y nitrato (NO₃–), que constituyen los productos estables de la reacción. Existen tres isoformas de la NOS, dos de ellas se consideran constitutivas y dependientes del calcio (cNOS): la endotelial y la neuronal, las cuales sintetizan NO en condiciones basales.
La tercera de ellas es inducible e independiente del calcio (iNOS) y no se expresa o lo hace muy débilmente en condiciones fisiológicas (Förstermann et al. 1991).
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Entre los ROIs generados tras el proceso del estallido respiratorio se encuentra el Oâ‚‚– tal y como se ha descrito en el apartado anterior.
FIGURA 3. Representación de la reacción enzimática mediada por la NOS.
Este radical presenta una potente actividad bactericida ya de por sí pero además puede combinarse con el óxido nítrico (NO) para generar peroxinitrito (ONOO–), un radical de nitrógeno con un elevado poder oxidante así como una gran actividad citotóxica (Rosen et al. 1995) contra bacterias como Escherichia coli (Hurst y Lymar 1997), parásitos como Trypanosoma cruzi (Denicola et al. 1996) o incluso hongos como Candida albicans (Vázquez-Torres et al. 1996).
En moluscos se ha demostrado la presencia de actividad de sintasas de óxido nítrico y la liberación de NOâ‚‚– y NO₃– en hemocitos de diferentes especies como Crassostrea gigas (Torreilles y Romestand 2001; Nakayama y Maruyama 1998), Crassostrea virginica (Villamil et al. 2007), Ruditapes decussatus (Tafalla et al. 2003), Mytilus edulis (Ottaviani et al. 1993) y Mytilus galloprovincialis (Arumugam et al. 2000; Gourdon et al. 2001; Torreilles y Romestand 2001; Tafalla et al. 2002; Nova s et al. 2004). En la mayoría de los casos, los radicales de nitrógeno se generan y liberan tras la estimulación de los hemocitos con diferentes partículas tanto solubles como no solubles entre las que destacan el forbol-miristato-acetato (PMA) (Nakayama y Murayama 1998; Tafalla et al. 2002), la laminarina (Arumugam et al. 2000), el lipopolisacárido (LPS) (Ottaviani et al. 1993) o el zimosán (Tafalla et al. 2003). Aunque la mayoría de estas moléculas son consideradas como PAMPs por tratarse de constituyentes estructurales de microorganismos, son todas ellas partículas inertes. La producción de radicales de nitrógeno no sólo se ha relacionado con la estimulación de esta clase de partículas sino que también existen datos que confirman que la liberación de NO puede verse modulada por organismos vivos como el protozoo Perkinsus marinus en la ostra americana, Crassostrea virginica (Villamil et al. 2007).​
​Existen varias técnicas para la medición de la producción de NO en hemocitos de moluscos. Como ya hemos indicado previamente, el NO puede combinarse con el Oâ‚‚– para formar ONOO–.Este peroxinitrito es un radical inestable que tiende a regresar a su estado basal. Al igual que ocurría en el caso de los ROIs se puede utilizar la quimioluminiscencia mediada por luminol para detectar esta producción (Radi et al. 1993; Gourdon et al. 2001), siguiendo el mismo esquema mostrado en la Figura 2. La determinación de radicales de nitrógeno también se puede medir utilizando una reacción colorimétrica conocida como reacción de Griess (Green et al. 1982). Durante este proceso los NO₃– formados como consecuencia de la transformación del NO reaccionan con la sulfanilamida (añadida durante el proceso) dando lugar a una sal de diazonio. Esta sal puede acoplarse a otro de los compuestos empleados en la reacción (naftil-etilenediamina) para dar lugar a un producto con un determinado espectro de absorción. Es una reacción indirecta donde la cantidad de color obtenida (calculada mediante una recta patrón) es proporcional a la cantidad de NO producido (Tafalla et al. 2002). Las técnicas inmunológicas basadas en el inmunoensayo acoplado a enzimas (ELISA) también se han empleado utilizando anticuerpos que reconocen a la nitrotirosina, molécula que se forma tras la reacción entre el NO y residuos de tirosina de las proteínas celulares (Torreilles y Romestand 2001). Además de los métodos previamente descritos se han llevado a cabo técnicas basadas en la fluorescencia para estudiar la producción de radicales de nitrógeno. Algunas de ellas emplean la reacción de Misko (1993) que se basa en la formación de un compuesto fluorescente, el 2,3-diamino-naftotriazol a partir del NOâ‚‚–, pudiendo ser medido mediante un lector (Arumugam et al. 2000; Nakayama y Maruyama 1998), o bien aquellas técnicas que usan sondas como la diaminofluoresceína-diacetato (DAF-DA). Al igual que ocurría con la DCF-DA, estas sondas pueden acceder al interior de la célula y una vez dentro, el grupo diacetato se pierde formándose DAF. La transformación en fluorescentes se produce cuando las diaminas aromáticas que forman parte de su estructura reaccionan con el NO en presencia de oxígeno (Kojima et al. 1998). Esta fluorescencia puede ser cuantificada mediante técnicas como la citometría de flujo (García-García et al. 2008).
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3. COMPONENTES DEL SISTEMA INMUNE DE LOS MOLUSCOS
3.1. Lisozima
La lisosozima es una proteína hidrolítica que rompe el enlace glicosídico de los peptidoglucanos de la pared celular de bacterias. Las enzimas lisosomales son elementos importantes de defensa y digestión en moluscos bivalvos. Estas enzimas participan en la destrucción y degradación de microorganismos dentro y fuera de los hemocitos. Modifican la conformación molecular de la superficie del patógeno y favorecen su reconocimiento por las células fagocíticas. Las enzimas lisosomales se acumulan en lisosomas en los granulocitos fagocíticos (Rodrick y Cheng 1974). Los lisosomas se fusionan con los fagosomas donde se produce la degradación de las partículas fagocitadas. A su vez, asociado al proceso de fagocitosis, se produce la liberación de enzimas lisosomales (arilsulfatasa, β-glucoronidasa y lisozima) por los granulocitos por el proceso denominado degranulación que no implica rotura de la membrana plasmática de la célula (Pipe 1990). Las enzimas hidrolíticas están también presentes en el estilo cristalino y en diversículos digestivos dentro de la célula (Luna-González et al. 2004). Hasta hace poco se creía que la lisozima podría estar implicada tanto en procesos de defensa como de digestión; sin embargo, recientemente se han descrito lisozimas implicadas únicamente en procesos de digestión en C. virginica (Xue et al. 2007) y C. gigas (Itoh y Takahashi 2007) cuyas secuencias nucleótidicas tienen gran similitud con las descritas anteriormente implicadas en defensa. Tradicionalmente la presencia de enzimas lisosomales se ha demostrado mediante técnicas colorimétricas y de determinación de actividad enzimática tanto en hemocitos como en plasma. Así se ha descrito actividad lisozima en numerosos bivalvos: C. virginica (McDade y Tripp 1967), Mercenaria mercenaria (Cheng et al. 1975), Mya arenaria (Cheng y Rodrick 1974), Ostrea edulis (Cronin et al. 2001), C. gigas (Luna-González et al. 2004), Mytilus galloprovincialis (Carballal et al. 1997), M. edulis (McHenery y Birkbeck 1982) y Ruditapes decussatus (López et al. 1997). Las enzimas hidrolíticas se encuentran tanto en el suero de la hemolinfa como en el extracto celular, en unos organismos aparece mayor concentración de lisozima en las células que en el suero pero se sabe que la producción de esta enzima se ve regulada por la edad, es altamente variable entre individuos (Cronin et al. 2001) y su liberación está asociada a los cambios fisiológicos, al estrés (López et al. 1997) y a la infección frente a bacterias (Li et al. 2008).
3.2. Lectinas, hemaglutininas y opsoninas
Las lectinas son proteínas que reconocen carbohidratos y aparecen en fluidos corporales, tejidos y células. Basándose en su estructura y sus propiedades de unión han sido clasificadas en varias familias, las tipo C, P, F e I, ficolinas, pentraxinas y galectinas y se encuentran muy ampliamente distribuidas en el reino animal (Vasta et al. 2004).
En un principio las proteínas que hoy conocemos como lectinas en bivalvos, se designaron hemaglutininas, término que hacía referencia a la capacidad funcional de la proteína de aglutinar eritrocitos. Las hemaglutininas son glicoproteínas con receptores multivalentes para ciertos carbohidratos específicos. Tenían además una estructura con subunidades de peso molecular muy similar. Las hemaglutininas se inhiben con la presencia de ciertos oligosacáridos como N-acetil D glucosamina, D-glucosamina (Arimoto y Tripp 1977), se inactivan con calor a partir de 65 ºC y necesitan iones de calcio para la termoestabilización y una eficaz aglutinación de partículas extrañas. Desde finales de la década de los 60 se identificaron proteínas en el plasma de moluscos bivalvos con capacidad de aglutinar eritrocitos en Mytilus edulis (Brown et al. 1968 y Hardy et al. 1976), Crassostrea virginica (Tripp 1966) y en Crassostrea gigas (Hardy et al. 1977). Más tarde se demostró que tanto en este organismo como en otros bivalvos, la almeja Mercenaria mercenaria (Arimoto y Tripp 1977) y la ostra Crassotrea virginica, estas proteínas aglutinantes tenían capacidad de aglutinar no sólo eritrocitos sino también otro tipo de células como algas y bacterias (aglutininas de bacterias). En 1980, fue Lackie quien introdujo la idea de que las hemaglutininas caracterizadas hasta el momento parecían ser lectinas (Lackie 1980), ya que eran proteínas de unión divalente o multivalente a carbohidratos y aglutinan células y otras superficies. Y sugirió que las lectinas en invertebrados podrían actuar como moléculas de reconocimiento del sistema inmune, de forma que para que sean funcionalmente efectivas deben al menos, inactivar bacterias invasoras por aglutinación, actuar como opsoninas reconociendo a la vez la partícula extraña y el fagocito o formar parte de la superficie de células inmunes como molécula de reconocimiento de membrana. Cualquiera de los dos últimos mecanismos favorecen la fagocitosis de partículas extrañas, creando un efecto opsonizante del plasma (Chu 1988). La principal función inmune de las aglutininas, según Vasta, es el reconocimiento de partículas extrañas como bacterias y parásitos que entran en contacto con la hemolinfa y median su fagocitosis, melanización y encapsulación. No sólo aparecen en forma soluble en la hemolinfa, también se han descrito lectinas de membrana en Crassostrea virginica (Vasta et al. 1982 y 1984).
Aunque los términos lectina, aglutinina y opsonina son diferentes por definición, hasta que se identificaron las características específicas de cada proteína, la terminología utilizada creaba confusión en su identificación y funcionalidad. Finalmente, Chu en 1988, ante la imposibilidad de poder distinguir aglutinina de lectina llegó a la conclusión de que las aglutininas de invertebrados parecían ser lectinas y los términos aglutinina y opsonina parecían acuñar características funcionales de una misma proteína (Chu 1988).
Se han descrito procesos de aglutinación de bacterias en C. virginica (Fisher y Dinuzzo 1991), en C. gigas (Olfa sen 1995), Calyptogena magnifica (Fisher y Dinuzzo 1991), Modiolus modiolus (Tunkijjanuij et al. 1997), Mytilus galloprovincialis (Canesi et al. 2002), Mercenaria mercenaria (Tripp 1992), Pinctada maxima (Flower 1985) y en M. edulis (Mullainadhan 1986). Y existen también claras evidencias de efectos opsonizantes en la hemolinfa de moluscos bivalvos en C. gigas (Olafsen 1995), Modiolus modiolus (Tunkijjanuij et al. 1998), M. edulis (Kumazawa et al. 1993) y M. galloprovincialis (Canesi et al. 2001).
La presencia de lectinas en bivalvos se ha confirmado mediante la identificación de la proteína purificada en Saxidomus purpuratus (Tatsumi et al. 1982), en la almeja Anadara granosa (Dam et al. 1994), en la almeja gigante Hippopus hippopus (Puanglarp et al. 1995) y en el mejillón Modiolus modiolus (Tunkijjanukij et al. 1997) y mediante la caracterización de la proteína o dominios con homología a aquellos presentes en lectinas. Hasta el momento se han secuenciado y caracterizado dominios distintivos de lectinas en los siguientes bivalvos: en la ostra Ostrea chilensis (Minamikawa 2004), en la almeja R. philippinarum (Bulgakov et al. 2004; Kang et al. 2006; Kim et al. 2008; Takahashi et al. 2008), en la ostra Pteria penguin (Naganuma et al. 2006), en Argopecten irradians irradians (Song et al. 2006), en la almeja tropical Codakia orbicularis (Gourdine y Smith-Rav in 2007), en Chlamys farreri (Wang et al. 2007), y en C. virginica (Tasumi et al. 2007).
3.3. Hemolisinas
La lisis de eritrocitos por moléculas liberadas por hemocitos, molécula denominada hemolisina, se detectó en Mercenaria mercenaria (Anderson 1981), en Mytilus edulis (Hardy et al. 1976; Wittke y Renwrantz 1984), en Corbicula fluminea (Yoshino y Tuan 1985). La hemolisina se inactiva a 47 ºC, es dependiente de la concentración de iones de calcio e inducible tras una infección (Anderson 1981). Varios autores coinciden en afirmar que la molécula causante de la lisis de eritrocitos es liberada por los hemocitos (Wittke y Renwrantz 1984) y se trata de un potente mecanismo de defensa que junto con las aglutininas colabora en la encapsulación y eliminación de patógenos (Leippe 1988).
3.4. Sistema de complemento
El sistema de complemento está formado por más de 30 proteínas solubles del plasma autorregulables y que colaboran en reconocimiento de partículas extrañas. El componente central del sistema de complemento es el C3 que se activa proteolíticamente por una C3 convertasa a través de las rutas clásica, de las lectinas y la alternativa en vertebrados (Nonaka y Yoshizaki 2004). En la ruta de activación clásica las inmunoglobulinas son reconocidas por la proteína C1 y la ruta de las lectinas comienza con el reconocimiento de carbohidratos de membrana por las lectinas de unión a manosa y ficolinas (Nonaka y Kimura 2006). Estas dos rutas comparten los siguientes componentes de la cascada el C2 y el C4, que finalmente activan el C3. Sin embargo, la ruta de activación alternativa se activa espontáneamente por hidrólisis mediante unión covalente a superficies cercanas sin distinción de lo propio (Smith 1999). En la vía alternativa es necesaria la presencia de factores que regulen la función del C3, como son el factor B que activa más C3 sobre superficies de partículas extrañas y los factores H e I que inactivan el C3 cuando reconoce los propios tejidos (Dodds 2002).
Una vez que el C3 es activado la proteolisis libera dos péptidos, el C3a y el C3b cuyas funciones son la eliminación directa del patógeno o la facilitación de la respuesta inmune. Estos mecanismos incluyen fagocitosis de partículas opsonizadas (Zakardis et al. 2001), inflamación y lisis de membrana celular del patógeno mediante activación del componente C5 y las proteínas terminales del complemento que forman el complejo de ataque a la membrana (MAC) (Boshra y Sunyer 2006).
El origen de la subfamilia del C3 en deuteróstomos se consideró que era una alfa2-macroglobulina sin función inmune (Nonaka 2001) que tras evolución gradual dio lugar a las proteínas del complemento con función inmune (Bartl et al. 2003). El C3 parece que se perdió varias veces en la evolución de los organismos protóstomos ya que tras la revisión total de los genomas de la mosca de la fruta Drosophila melanogaster y del nematodo Caenorhabditis elegans no apareció ningún gen relacionado con el sistema del complemento (Nonaka 2006).
Los bivalvos poseen mecanismos de defensa como lisis celular y aglutinación-opsonización que se engloban dentro de funciones de complemento. En 1988 Chu introdujo ya la idea de la posible analogía de la hemolisina del suero con un rudimentario sistema de complemento en mejillón (Chu 1988). Estos procesos pueden ser igualmente atribuibles a otros factores humorales sin implicación de un sistema de complemento. Sin embargo, en los últimos años con el desarrollo de nuevas técnicas moleculares se han descrito nuevas proteínas relacionadas con el sistema de complemento, como la adiponectina con dominio C1q en la almeja Ruditapes decussatus (Prado-Álvarez et al. 2009a), la C-lectina con función inmune y proteínas pertenecientes a la superfamilia las TEP (proteína con enlace tioester) en la vieira Chlamys farreri (Wang et al. 2007) (Ma et al. 2005; Zhang et al. 2007)...
No obstante, la certeza de que los bivalvos poseen un sistema de complemento se confirmó con la descripción del componente central C3 y de la proteína reguladora, factor B en la almeja fina Ruditapes decussatus (Prado-Álvarez et al. 2009b). El C3 de la almeja fina posee 3 cadenas al igual que el C3 de otros organismos invertebrados y se incluye dentro del grupo de los proto-C3, ancestro común de los 3 componentes de la subfamilia de las proteínas del complemento C3, C4 y C5 (Nonaka y Yoshizaki 2004).
El factor B de almeja posee la característica distintiva de poseer una estructura de dominios en mosaico diferente a cualquier otro organismo descrito hasta la fecha. A pesar de que existe gran diversidad en la disposición de los dominios en el factor B de invertebrados, todos ellos se consideran un grupo ortólogo al grupo de factor B y C2 de mamíferos (Nonaka y Kimura 2006). La presencia del componente central del complemento C3 y de la proteína reguladora de factor B es suficiente para que este sistema de complemento arcaico sea funcional (Lachmann y Hobart 1979). La efectividad del sistema de complemento de la almeja fina se demostró en estudios de inhibición del C3 en ensayos de lisis de eritrocitos y de opsonización. Los resultados obtenidos demostraron la implicación de esta proteína en dichos procesos y permiten afirmar la existencia de un primitivo y efectivo sistema de complemento en moluscos. (Prado-Álvarez et al. 2009).
3.5. Receptores Toll-like (TLRs)
Los TLRs son una familia de proteínas de membrana que actúan como receptores de patrones de reconocimiento (PRRs) al estar implicados en el reconocimiento de diferentes PAMPs (Medzhitov et al. 1997). Son moléculas transmembrana que poseen un dominio extracelular con motivos ricos en repeticiones de leucina (LRR), un motivo flanqueante de cisteína, un dominio transmembrana (TM) y un dominio intracelular conocido como receptor Toll/IL-1 (TIR) (Abbas y Lichtman 2000) (Fig. 4). Hasta la fecha, se han descrito 10 tipos de TLRs en mamíferos (Takeda y Akira 2001) donde cada uno de ellos reconoce una determinada estructura patrón presente en los microorganismos.
La unión de un determinado ligando al motivo LRR desencadena una cascada de transducción de señales que, en último término, activa a factores de transcripción que dan lugar a la expresión de genes implicados en respuesta inmune (Takeda y Akira 2004; Aderem y Ulevitch 2000). En moluscos bivalvos, se han identificado varias ESTs con homología a TLR en la ostra americana, Crassostrea gigas (Tanguy et al. 2004) y en la vieira Argopencten irradians (Song et al. 2006). Además, en la vieira de Alaska, Chlamys farreri, se ha llevado a cabo la caracterización molecular completa de un receptor con homología al Toll de Drosophila y denominado CfToll-1 cuya expresión se ve modulada por LPS (Qiu et al. 2007).
FIGURA 4. Representación esquemática de la estructura de un TLR.
3.6. Sistema profenol-oxidasa (proPO)
La fenoloxidasa (PO) es una enzima dependiente de cobre, que cataliza la reacción que convierte sustancias fenólicas como la 3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA) a quinonas inestables como la dopaquinona. Esta última puede polimerizar para formar melanina mediante una reacción no enzimática (Söderhall 1982; Söderhall y Smith 1986). Existen al menos dos tipos de enzimas PO: la O-difenoloxidasa (E.C.1.10.3.1) y la tirosinasa (E.C.1.14.18.1). La enzima se presenta inicialmente inactiva en su forma de pro-enzima (proPO) y pasa a su estado activo tras la activación mediante una serie de estímulos, entre los que destacan componentes de la pared celular de levaduras y bacterias como los β-glucanos, el LPS o los peptidoglicanos (Söderhall y Hall 1984; Söderhall y Smith 1986; Ratcliffe et al. 1991).
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El paso del precursor proPO a la forma activa requiere una cascada de señales mediadas por serín proteasas. Finalmente, se produce una reacción proteolítica mediada por la enzima activadora de la proPO (ppA) que da lugar a la
PO en su forma enzimáticamente funcional mediante un proceso muy similar a lo que ocurre en la cascada del complemento (Söderhall 1982; Söderhall y Smith 1986).
La existencia del sistema proPO se ha demostrado en varios tipos celulares pertenecientes a diferentes especies y su principal papel se centra en los procesos de melanización y en la síntesis de adrenalina (Coles y Pipe 1994). Además de estas implicaciones, la PO puede activar diferentes procesos inmunes como la fagocitosis y la encapsulación (Söderhall y Smith 1986). La presencia de esta enzima se ha demostrado en diferentes especies de moluscos, como en la ostra japonesa, Crassostrea gigas, (Hellio et al. 2007), en la ostra neozelandesa, Saccostrea glomerata, (Aladaileh et al. 2007), en la almeja japonesa, Ruditapes phillipinarum, (Cong et al. 2005), en el mejillón verde, Perna viridis, (Asokan et al. 1997) y en el mejillón azul (Coles y Pipe 1994). En todas estas especies, la presencia de la proPO se ha detectado tanto en la hemolinfa como en el interior de los hemocitos (Ashida et al. 1983; Saul et al. 1987; Hernández-López et al. 1996). Además, la expresión de la proPO se puede modular por estímulos como bacterias o parásitos (Hong et al. 2006; Muñoz et al., 2006; Bezemer et al. 2006).
3.7. Proteasas e inhibidores de proteasas
Las proteasas son enzimas que se encuentran en la mayoría de los organismos vivos. Poseen funciones reguladoras en diferentes procesos fisiológicos, como la coagulación (Takada et al. 1994), el desarrollo (Konrad et al. 1998), la embriogénesis (Hong y Hashimoto 1995), la digestión (Neurath 1984), la inflamación (Hiemstra 2002) y la respuesta inmune (Gorman et al. 2000). Sin embargo, una actividad exagerada de estas enzimas puede ser fatal para las células y para el organismo en su conjunto. Las proteasas, también están presentes en los organismos patógenos y son utilizadas por ellos como herramientas para combatir los mecanismos de defensa presentes en el hospedador (McKerrow 1989; Oliver et al. 1999; La Peyre y Faisal 1995; Brown y Reece 2003; Ordás et al. 2001). Estas proteínas facilitan la invasión del patógeno entre los tejidos del hospedador y pueden llegar a reducir la actividad lisozima y aglutinante del hemocito (La Peyre et al. 1996) así como a causar alteraciones en la permeabilidad de la membrana celular (Paynter et al. 1995). Debido a la presencia de estas proteasas exógenas y a la necesidad de un control de la actividad de las endógenas, multitud de organismos han desarrollado unas enzimas inhibidoras conocidas como Inhibidoras de Proteasas (PI) (Laskowski y Kato 1980). Con respecto al sistema inmune, la característica principal de las PI, se centra en la lucha contra microorganismos patógenos para evitar su propagación (Ellis 1987; Calkins y Sloane 1995; Freedman 1991). La presencia de proteínas PI se ha demostrado en varios moluscos como el caracol, Biomphalaria glabrata, (Bender y Bayne 1996) y el pulpo, Octopus vulgaris, (Thøgersen et al. 1992) por citar algunos ejemplos. Concretamente, en moluscos bivalvos, se ha detectado la presencia de estas enzimas en las ostras Crassostrea gigas y Crassotrea virginica (Faisal et al. 1998; Oliver et al. 1999; Montagnani et al. 2001; Xue et al. 2006) y en la vieira de Argopencten irradians (Zhu et al. 2006).
3.8. Péptidos antimicrobianos (AMPs)
Los AMPs son pequeñas moléculas proteicas altamente conservadas en la evolución, que están presentes desde los organismos más primitivos como los protozoos y procariotas (Leippe 1999; Pag y Sahl 2002; Nes et al. 2002) hasta los más evolucionados como los mamíferos (Jenssen et al. 2006), donde curiosamente han sido de los últimos en descubrirse. Actualmente se conocen casi 800 tipos de AMPs distribuidos por todo el reino animal, según la base de datos de AMP (APD) (http://aps.unmc.edu/AP/main.php). El descubrimiento de estas moléculas se produjo en las décadas de los 80-90 mediante dos líneas de investigación independientes: estudiando los factores antimicrobianos presentes en la hemolinfa de insectos estimulados y mediante el análisis de la fagocitosis en mamíferos (Boman 1995; 1996; 2000). Normalmente estos péptidos poseen bajo peso molecular que ronda los 10 kDa y suelen ser catiónicos por su elevado contenido en aminoácidos básicos como lisina y arginina. Poseen características anfipáticas que les permite tener estabilidad tanto en medios hidrofóbicos como acuosos. Algunos de ellos presentan modificaciones postraduccionales como glicosilaciones o amidaciones (Boman 1995; Nissen-Meyer y Nes 1997). La clasificación de los AMPs suele hacerse en función de su estructura, así se dividen en ricos en cisteínas, en α-hélices y en prolina o glicina (Bulet et al. 1999). El mecanismo de acción comienza con la unión de los AMPs a las membranas plasmáticas de los microorganismos mediante fuerzas electrostáticas de manera que las cargas positivas de los AMPs atraen a las cargas negativas presentes en las cabezas fosfolipídicas de las membranas celulares. La inserción de los AMPs en la membrana altera la permeabilidad de está provocando incluso la lisis celular mediada por la poración (Huang 2000; Matsuzaki 1998; Nissen-Meyer y Nes 1997).
Son varios los moluscos bivalvos donde se han caracterizado a nivel molecular varios AMPs. En el caso de la ostra, los AMPs identificados han sido varios tipos de defensinas conocidos como Cg-def (Gueguen et al. 2006), Cg-Defh1 y Cg-Defh2 (González et al. 2007). En la almeja fina se han identificado tres isoformas con similitud a las miticinas descritas en el mejillón mediterráneo y que se han descrito con el nombre de clam myticin 1, 2 y 3, y un AMP parecido a mitilina conocido como clam-mytilin (Gestal et al. 2007). En el caso de la vieira, Argopecten irradians, se ha descrito un tipo de defensina conocida como AiBD (Zhao et al. 2007). Pese a la caracterización molecular de AMPs en varias especies de bivalvos, es en el mejillón, Mytilus galloprovincialis, donde se han llevado a cabo más estudios. En este caso, los AMPs descritos son todos ricos en cisteínas y se pueden dividir en tres grupos en función del número y posición de estos residuos aminoacídicos. El primero de ellos está formado por dos moléculas con una gran homología a las defensinas descritas previamente en artrópodos (Bulet et al. 1999), de ahí que el nombre adoptado haya sido Mytilus galloprovincialis Defensin (MGD-1 y MGD-2) para las dos isoformas detectadas (Mitta et al. 1999b). El segundo de los grupos está constituido por las mitilinas y está formado por 4 isoformas diferentes (B, C, D y G1) (Mitta et al. 2000a) ya que la forma A se ha detectado en M. edulis pero no en M. galloprovincialis (Charlet et al. 1996). El tercer y último grupo está compuesto por tres isoformas de miticina: miticina A, B y C (Mitta et al. 1999a; Pallavicini et al. 2008). Las miticinas A y B y las defensinas son esencialmente activas contra bacterias Grampositivas (Mitta et al. 1999a; Mitta et al. 1999b) incluyendo algunos patógenos asociados a invertebrados marinos (Johnson 1981; Friedman et al. 1991). Sin embargo, las mitilinas tienen una actividad más diversificada ya que su rango de acción abarca desde actividades antifúngicas hasta acciones microbicidas contra bacterias Gramnegativas (Mitta et al. 2000a; 2000b). Sin embargo, la expresión de los péptidos antimicrobianos no parece verse incrementada tan sólo tras una estimulación bacteriana, ya que se ha visto que estímulos físicos o de estrés térmico son capaces de aumentar la expresión de las defensinas (Mitta et al. 2000b). A pesar de que el papel microbicida de la miticina C no ha sido determinado hasta la fecha, la elevada presencia de transcritos diferencialmente expresados tras estimulaciones de diversa naturaleza, junto con su expresión ubicua y temprana en el desarrollo (Pallavicini et al. 2008), sugieren que la miticina C debe de jugar un papel clave dentro del sistema inmune de estos organismos. Además se ha encontrado una elevada variabilidad de formas que parecen ser exclusivas e inherentes a cada individuo, siendo compartidas solamente en el caso de mejillones hermanos (Costa et al. 2009). Pese a que se han encontrado AMPs en otras especies de bivalvos, incluso algunos con similitud a miticina o a mitilina, los niveles de polimorfismos encontrados en el caso del mejillón son significativamente más elevados (Pallavicini et al. 2008; Padhi y Verghese 2008), sugiriendo que, al igual que ocurre con otros genes relacionados con el sistema inmune, la miticina C se ha visto sometida a elevadas presiones selectivas que le han hecho mutar hasta generar el enorme repertorio de formas diferentes que existen. Quizá este elevado abanico de isoformas pueda ser el responsable de que el mejillón del Mediterráneo sea una especie tan altamente resistente a la manifestación de enfermedades.
El mecanismo de acción de los AMPs parece estar mediado por la permeabilización de la membrana plasmática de los microorganismos a los que atacan (Kagan et al. 1990; Cociancich et al. 1993). Sin embargo, esta permeabilización requiere un paso inicial de unión entre el péptido y el agente patógeno, previa a la despolarización de la membrana celular. Se cree que estas moléculas son sintetizadas y almacenadas en el interior de los hemocitos granulares y tras recibir un estímulo se liberan al plasma para ejercer su función (Mitta et al. 1999b; 2000c) tal y como se indica en la Figura 5.
4. GENÓMICA DE LA RESPUESTA INMUNE EN LOS MOLUSCOS
A pesar de que la aplicación de métodos genómicos en los moluscos está en sus comienzos, la importancia de estos organismos en la acuicultura hace que se avance de forma rápida.
Numerosas especies de moluscos están siendo objeto de proyectos orientados a la obtención de genotecas de cDNAs y colecciones de ESTs «Expressed sequence tags». Entre ellas, la ostra japonesa (C. gigas) y el mejillón Mytilus galloprovincialis. Existen bases de datos específicas en las que se almacenan las secuencias producidas por proyectos, como la GigasBase de ostra en Francia (http://www.ifremer.fr/GigasBase) o la base de datos Marine Genomics americana (www.marinegenomics.com). En breve estarán disponibles más de 9.000 ESTs de las almejas fina (Ruditapes decussatus) y japonesa (R. philippinarum), producidas a través de la colaboración de varios centros de investigación europeos en el marco de la red Marine Genomics Europe (http://www.marine-genomics-europe.org). Esta red también está contribuyendo a incrementar las colecciones de ESTs de mejillón y de ostra japonesa (Saav edra y Bachere 2006; Saav edra et al. 2007).
FIGURA 5. Representación esquemática de la liberación de AMPs tras una estimulación bacteriana.
La secuenciación de ESTs de librerías génicas substractivas está considerada como una técnica robusta y relativamente barata empleada hoy en día para la identificación de proteínas codificadas por genes que se encuentran expresados en diferentes tejidos. En el caso de moluscos bivalvos, actualmente hay más de 50.000 ESTs depositadas en bases de datos públicas, y su número continúa creciendo diariamente. Los primeros datos fueron de la ostra C. virginica, con la que se construyeron dos librerías de ESTs, una de hemocitos de un único individuo (de la que se obtuvieron 363 singletons o secuencias diferentes), y otra a partir de un grupo de 200.000 embriones (de la que se obtuvieron 286 singletons) (Jenny et al. 2002). Solamente un 5% de estos genes resultaron relacionados con funciones inmunes. Entre los 710 singletons, 20 de ellos podrían estar implicados en funciones inmunes (Gueguen et al. 2003). Un estudio de genes expresados en respuesta a una infección por Perkinsus marinus llevada a cabo en C. virginica y C. gigas, dio como resultados un total de 500 ESTs singletons, de las cuales 19 pudieron ser caracterizadas como involucradas en inmunidad y comunicación celular, como receptores toll-like, proteínas de unión a metales y proteínas asociadas al receptor de TNF entre otras (Tanguy et al. 2004). Las ESTs identificadas en C. gigas afectada por mortalidades de verano proporcionaron un 16% de ESTs relacionadas con funciones inmunes (Huvert et al. 2004). La tecnología de ESTs aplicada al manto de C. gigas permitió la identificación del primer péptido antimicrobiano en ostra, perteneciente a la familia de las defensinas (Gueguen et al. 2006). Se han construido librerías génicas a partir de extractos de distintos de tejidos. En el caso del mejillón, se utilizaron hemolinfa, branquias, glándula digestiva, pie, músculo aductor y manto de un grupo de mejillones no estresados para construir una librería de ESTs. Los resultados permitieron la identificación de péptidos antimicrobianos de la familia de las miticinas, metalotioneinas, y proteínas de choque térmico, entre un total de 426 singletons (Venier et al. 2003). En otro trabajo, las secuencias de ESTs obtenidas de branquia y gónada de un grupo de ostras adultas (C. virginica) dio como resultado un total de 1.916 singletons, incluyendo secuencias que codifican para varias proteínas de choque térmico, proteínas inducidas por estrés y péptidos antimicrobianos de la familia de las defensinas (Peatman et al. 2004).Las EST obtenidas a partir del tejido de un individuo completo de vieira A. irradians irradians, excepto tracto digestivo e intestino, permitió la identificación de 2.779 secuencias únicas, incluyendo 131 genes relacionados con la defensa del hospedador, como lectinas, defensinas, proteasas, inhibidores de proteasas, proteínas de choque térmico, antioxidantes y receptores tipo Toll (Song et al. 2006b). También se ha aplicado esta tecnología de SSH para el estudio de genes expresados en almeja Ruditapes decussatus frente a distintos patógenos, como bacterias (Gestal et al. 2007), y parásitos como Perkinsus olseni (Prado-Álvarez et al. 2009). La utilización de ambas técnicas, SSH y librerías de cDNA permitió la identificación de importantes genes sobreexpresados en mejillón M. galloprovincialis y su comparación tras una infección por bacterias y tras una infección por poly I:C (simulando una infección vírica) (Pallavicini et al. 2008). En este mismo trabajo, se describe una nueva clase de péptido antimicrobiano denominado Miticina C, demostrándose su importante papel como gen relacionado con la respuesta inmune. También se han publicado trabajos con esta metodología relacionados con la presencia de contaminantes. Por ejemplo, tras la exposición experimental a varios contaminantes, se encontraron sobre expresados un total de 242 genes de mejillón cebra, Dreissena polymorpha (Bultelle et al. 2002) y 258 genes de la ostra, C. gigas (Boutet et al. 2004). Todas estas observaciones indican que es necesaria una tecnología de mayor eficiencia, y en este sentido, se están haciendo importantes avances en lo referente a proteómica en bivalvos.
Además, los distintos factores ambientales pueden afectar al sistema hospedador-patógeno, y así, por ejemplo, la presencia de contaminantes, junto con otros factores de estrés, pueden ser en parte responsables de la disminución de los mecanismos de defensa y por lo tanto del incremento de la susceptibilidad a enfermedades. Algunos estudios llegan incluso a encontrar un nexo de unión entre presencia de contaminantes ó factores estresantes, y susceptibilidad a enfermedades en bivalvos (Chou et al. 1998; Chu et al. 2002).
Actualmente se pueden llevar a cabo grandes cantidades de secuenciación mediante la pirosecuenciación. Recientemente se ha publicado un trabajo donde se describe una de estas técnicas de secuenciación en ostra pacífica (C. gigas), generándose 8.6 millones de secuencias (Hedgecock et al. 2007).
La tecnología de microarray de DNA es un método cerrado que es capaz de identificar un elevado número de secuencias o genes predeterminados ya conocidos. En la tecnología de microarrays, las moléculas de DNA (desde oligonucleótidos hasta cDNAs completos) representan transcritos específicos que son fijados en un soporte sólido. De este modo se puede analizar la expresión simultánea de un importante número de genes.
Los mejillones, por su condición de filtradores intermareales, acumulan componentes xenobióticos, y por lo tanto se emplean como biosensores de contaminación costera. Recientemente, Venier et al. (2006) han producido el primer microarray de cDNA de mejillón M. galloprovincialis (MytArray 1.0) que contiene un total de 1800 sondas diferentes, obtenidas de distintos tejidos. La hibridación de los clones impresos en el microarray con cDNA de mejillón expuesto a diferentes metales y contaminantes orgánicos permitió la identificación de 27 genes potencialmente marcadores de contaminantes orgánicos, y 16 genes potencialmente marcadores de metales pesados. Además, Dondero et al. (2006) produjeron también un microarray de oligonucleótidos de baja densidad (48 oligonucleótidos), denominado (Mytox-chip), para estudio de genes candidatos a marcadores de contaminación y genes relacionados con la respuesta al estrés producida por la acción de xenobióticos.