11. SEÑALIZACIÓN CELULAR EN MOLUSCOS
Resumen
La capacidad de las células para recibir y actuar frente a señales o estímulos externos es fundamental para la vida. La conversión de estos estímulos en un cambio químico, llamada transducción de señal, es una propiedad universal de todas las células. Una amplia variedad de estímulos, incluyendo citoquinas, hormonas, neurotransmisores y factores de crecimiento, actúan a través de proteínas receptoras específicas en la membrana plasmática. En invertebrados tales como moluscos, insectos, anélidos, equinodermos y tunicados se ha detectado la presencia de moléculas similares a las citoquinas descritas en vertebrados; al igual que en éstos, están presentes en diferentes tejidos y órganos.
Las citoquinas son moléculas funcionalmente conservadas, que durante el proceso evolutivo han mantenido su pleiotropicidad, su redundancia en el modo de acción y una alta promiscuidad de sus receptores, además intervienen y modulan los principales fenómenos inmunes, incluyendo proliferación, diferenciación y muerte celular, apoptosis, citotoxicidad, etc. Las células eucariotas tienen diversos mecanismos de señalización: canales iónicos, receptores, proteínas de membrana que actúan a través de proteínas G, receptores nucleares que se unen a su ligando específico y actúan como factores de transcripción y proteínas de membrana que atraen y activan proteínas quinasas. Los hemocitos de invertebrados son capaces de responder a diversos estímulos extracelulares tales como interleuquinas, corticotropinas, factores de crecimiento y lipopolisacáridos bacterianos, activando diferentes caminos de trasmisión de señales. Estos caminos implican la activación de proteínas tirosina-quinasas (PTK), proteínas Ras, Raf, proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPKs), factores de transcripción Stat, etc,
que desencadenan distintas respuestas celulares. Estudios avanzados sobre la internalización de diferentes señales podrían esclarecer nuestra visión actual de los mecanismos de transducción generados por diferentes inductores.
1. INTRODUCCIÓN
En el ámbito biológico, se ha extendido el uso de la expresión señalización celular como traducción literal del inglés, cell signalling, al referirse a la comunicación mediante compuestos (señales) que generan respuestas determinadas en células diana. La evolución ha provisto a las células de todos los organismos vivos de mecanismos de señalización que les permite percibir estímulos ambientales y responder adecuadamente a ellos. El éxito de estos mecanismos asegura que el organismo sobreviva a sus cambiantes circunstancias ambientales.
Además, en los organismos multicelulares estos mecanismos forman redes de comunicación más complejas, que garantizan que cada célula funcione y responda a una diversidad aún mayor de estímulos y que lo haga coordinadamente con las otras células del organismo. Es gracias a esta comunicación entre células que el organismo mantiene una funcionalidad como entidad unitaria. De esta red de comunicación dependen funciones tan importantes como el desarrollo embrionario, la proliferación y diferenciación celular, las respuestas al estrés, la percepción sensorial, el movimiento, la respuesta inmune, la regulación metabólica, etc. (Jiménez y Merchant 2003).
La capacidad de las células para recibir y actuar en respuesta a señales que provienen más allá de la membrana plasmática es fundamental para la vida. La señal representa información que es detectada por un receptor específico y se convierte en una respuesta celular en la que siempre interviene un proceso químico. Esta conversión de información en cambio químico, llamada transducción de señal, es una propiedad universal de las células. A pesar de que el número de señales biológicas es grande, como lo es la variedad de respuestas biológicas a dichas señales, los organismos usan sólo unos pocos mecanismos conservados evolutivamente para detectar las señales extracelulares y transducirlas en cambios intracelulares (Nelson et al. 2006).
Cada organismo tiene la capacidad de distinguir entre lo propio y lo extraño. Esta capacidad está determinada genéticamente y las bases de los mecanismos de reconocimiento y respuesta varían según los niveles biológicos de organización. Los invertebrados están dotados de un sistema inmune innato que incluye componentes humorales y celulares (Nappi y Vass 1993, 2001; Carton y Nappi 1997; Nappi y Ottaviani 2000).
El sistema inmune en todos los animales comprende elementos celulares y humorales que interaccionan para proteger al organismo de potenciales patógenos, parásitos o células neoplásicas. El componente celular de la inmunidad en los invertebrados está mediado por células sanguíneas (hemocitos) que participan en varios mecanismos internos de defensa (Ratcliffe et al. 1985; Smith 1991).
En moluscos bivalvos, las respuestas celulares son llevadas a cabo por hemocitos circulantes, los cuales representan la primera línea de defensa contra infecciones bacterianas. Aunque estas respuestas han sido ampliamente estudiadas, se conoce poco acerca de los mecanismos de transducción implicados en la respuesta de defensa de estas células (Renwrantz 1990).
Las transducciones de señal son específicas y altamente sensibles. La especificidad se consigue por complementariedad molecular precisa entre las moléculas señal y receptor, en la que intervienen el mismo tipo de fuerzas débiles que tienen lugar en las interacciones enzimasustrato y antígeno-anticuerpo. Los organismos multicelulares tienen un nivel de especificidad adicional ya que los receptores para una señal determinada, o las dianas intracelulares de una determinada señal, solo están presentes en ciertos tipos de células.
Tres factores explican la extraordinaria sensibilidad de los transductores de señal: la elevada afinidad de los receptores por las moléculas señal, la cooperatividad en la interacción entre el ligando y el receptor y la amplificación de la señal por cascadas enzimáticas. La afinidad entre la señal (ligando) y el receptor puede expresarse como la constante de disociación Kd, a menudo 10-10 M o menos, lo que quiere decir que el receptor puede detectar concentraciones picomolares de una molécula señal.
La cooperatividad en las interacciones entre el ligando y el receptor acarrea grandes cambios en la actividad del receptor con pequeños cambios en la concentración del ligando.​
La amplificación por cascadas enzimáticas tiene lugar cuando un enzima asociado con un receptor de señal se activa, y a su vez, cataliza la activación de muchas moléculas de un segundo enzima, cada una de las cuales activa muchas moléculas de un tercer enzima, y así sucesivamente. Estas cascadas dan lugar a amplificaciones de varios órdenes de magnitud en milisegundos.
La sensibilidad de los sistemas de receptores está sujeta a modificación. Cuando una señal está presente continuamente, se produce una desensibilización del sistema receptor; cuando el estímulo disminuye por debajo de un determinado umbral, el sistema se vuelve sensible de nuevo.
Un último rasgo notable de los sistemas de transducción de señal es la integración, la capacidad del sistema para recibir múltiples señales y producir una respuesta unificada apropiada para las necesidades de la célula o del organismo. Diferentes vías de señalización conversan entre ellas a diferentes niveles, originando una abundancia de interacciones que mantienen la homeostasis en la célula y el organismo. El desencadenante es diferente para cada sistema pero las características generales de la transducción de señal son comunes a todos: una señal interactúa con un receptor; el receptor activado interactúa con la maquinaria celular produciendo una segunda señal o cambio en la actividad de una proteína celular, la actividad metabólica de la célula diana experimenta un cambio y finalmente el fenómeno de transducción se acaba y la célula vuelve al estado anterior del estímulo.
Se han descrito seis mecanismos básicos de señalización:
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Los canales iónicos de la membrana plasmática que se abren y se cierran en respuesta a la unión de ligandos químicos o cambios en el potencial transmembrana. Éstos son los transductores de señal más sencillos.
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Enzimas receptores, es decir receptores de membrana plasmática que son también enzimas. Cuando uno de estos receptores es activado por su ligando extracelular, cataliza la producción de un segundo mensajero intracelular.
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Proteínas receptoras que activan indirectamente (a través de proteínas que unen GTP, o proteínas G) enzimas que producen segundos mensajeros intracelulares.
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Receptores nucleares que, cuando se unen a su ligando específico, alteran la velocidad a la que genes específicos son transcritos y traducidos en proteínas celulares.
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Receptores que carecen de actividad enzimática pero atraen y activan enzimas citoplasmáticos que actúan sobre proteínas más alejadas en la vía, bien convirtiéndolas directamente en proteínas reguladoras de genes, bien activando una cascada de enzimas que finalmente activan un gen regulador.
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Los receptores que interaccionan con componentes macromoleculares de la matriz extracelular y llevan al sistema citoesquelético instrucciones sobre migración celular o adherencia a la matriz (Nelson et al. 2006).
En diversas especies eucariotas, desde insectos a seres humanos, los lipopolisacáridos bacterianos (LPS) estimulan la inmunidad innata (Ulevitch y Tobía 1995), activando diferentes caminos de transducción de señal en macrófagos. Estos caminos implican la activación de proteínas-G, tirosina-quinasas, fosfolipasa C, proteína quinasa A (PKA), proteína quinasa C (PKC) y la cascada de quinasas MAP (Sweet y Hume 1996; Fujihara et al. 1994; Liu et al. 1994; Shapira et al. 1994; Haziot et al. 1996).
2. CITOQUINAS EN LA RESPUESTA INMUNE
Las respuestas inmunes son el resultado de una compleja interacción entre una gran variedad de células. Además hay una continua interacción entre los sistemas inmune, nervioso y endocrino. Moléculas como las hormonas, neuropéptidos y citoquinas están implicadas en la transmisión de señales. Estas últimas se han clasificado según su origen o función. Hoy en día, el término general de «citoquina» se usa para todas estas moléculas señal y sus principales características son las siguientes: (1) son producidas por células del sistema inmune (Nisticò 1993), (2) son glucoproteínas de pequeño peso molecular (10-20 kDa) y la mayoría son sintetizadas de nuevo por células activadas durante la fase eferente de la respuesta inmune, (3) el principal papel de las citoquinas es funcionar como mediadores y moduladores de la respuesta inmune y la inflamación (Nisticò 1993; Blalock 1994), (4) desde el punto de vista funcional, las citoquinas se caracterizan por ser pleiotrópicas y redundantes –la misma citoquina puede tener diferentes blancos celulares y diferentes citoquinas pueden realizar una misma función; (5) actúan sobre blancos celulares por mecanismos autocrinos, paracrinos y endocrinos; las citoquinas se unen a receptores específicos de la membrana plasmática, los cuales muestran un cierto grado de promiscuidad (Kishimoto et al. 1994; Ottaviani et al. 1994, 1995), (6) en varios tipos celulares, las citoquinas actúan como factores de crecimiento regulando la proliferación e inhibición de la apoptosis (Manfredini et al. 1993; Kroener 1995).
Las citoquinas están presentes en prácticamente todos los organismos y tejidos del cuerpo, incluyendo además del sistema nervioso, la piel, los intestinos, etc. De este modo, las citoquinas parecen ser más moléculas señal que mediadores inmunes y juegan un papel principal en fenómenos fisiológicos y patológicos (Brozek y Ley 1991).
Por otra parte, se ha detectado la presencia de moléculas similares a citoquinas en invertebrados tales como moluscos, insectos, anélidos, equinodermos y tunicados. Al igual que en vertebrados estas moléculas están presentes en diferentes tejidos y órganos. Moléculas similares a IL-1a, IL-1b, IL-2, IL-6 y TNF-a se han encontrado en hemocitos y en la hemolinfa (Hughes et al. 1990, 1991, 1992; Stefa no et al. 1991; Ottaviani et al. 1993; Granath et al. 1994; Ouwe-Missi-Oukem-Boyer et al. 1994).
2.1. Estructura del receptor de citoquinas y transducción de señales
En general, un receptor funcional se puede dividir en varios componentes: una unidad de unión, un transductor, un efector y una unidad reguladora.
Un receptor hormonal complejo se compone de un receptor de hormonas (con 7 segmentos transmembranales), una proteína G heterotrimérica (subunidades a, b, g) como transductor, y un efector que genera señales intracelulares (Benovic et al. 1988).
En otros casos, los receptores de factores de crecimiento como EGF, PDGF y FGF, están constituidos por una cadena polipeptídica sencilla con motivos estructurales comunes: con un gran dominio extracelular de unión del ligando, un dominio sencillo situado dentro de la membrana, y un gran dominio citosólico con actividad quinasa (Ullrich y Schelessinger 1990).
Es importante señalar que una misma citoquina puede actuar tanto como señal positiva como negativa, dependiendo del tipo y del estado de desarrollo de la célula blanco (Arai et al. 1990). Igualmente, diferentes citoquinas mediante diferentes receptores dan lugar a aparentemente idénticas respuestas biológicas.
La interacción de las citoquinas con su receptor específico en la superficie celular desencadena la activación de caminos de señalización intracelulares que desencadenan respuestas celulares. Las quinasas Janus (JAKs) son mediadores centrales en la transducción de la señal y fosforilan residuos de tirosina dentro de dominios intracelulares del receptor, creando lugares cercanos para el reclutamiento de componentes adicionales en la señalización, incluyendo el dominio SH2 que contiene transductores de señales y activadores de factores de transcripción (STAT). Un gran número de citoquinas, factores de crecimiento y hormonas activan el camino JAK/STAT. Este camino puede ser regulado por múltiples mecanismos; hay tres principales reguladores negativos en la señalización a través de JAK/STAT; SHP-1, una tirosina fosfatasa, la cual actúa provocando una regulación por degradación proteolítica de la actividad JAK seguida de una autoactivación; proteínas inhibidoras de STATs activadas (PIAS), las cuales se unen a STATs activadas e inhiben su actividad transcripcional; y las proteínas supresoras de la señalización de citoquinas (SOCS), las cuales son blancos transcripcionales en las STATs y funcionan como retroalimentación negativa para atenuar la señalización a través de JAK/STAT (Fig. 1) (Kile et al. 2000).
La activación de las quinasas JAK tiene lugar mediante la fosforilación de residuos de tirosina en los receptores a los que se asocian. Estas fosfotirosinas pueden servir como lugares de anclaje para moléculas de señalización incluidas las proteínas STAT (Greenlund et al. 1995). Después de la dimerización del receptor y de la activación de las JAKs, los factores de transcripción STAT son reclutados, activados y translocados al núcleo donde estimulan la transcripción de genes que afectan a la respuesta biológica (Darnell et al. 1994; Darnell 1997; Horva th et al. 1997).
FIGURA 1. Reguladores negativos en el camino de señalización a través de JAK/STAT. Las líneas en forma de T representan inhibición y las flechas representan activación.
2.2. Mecanismos moleculares de trasmisión de señales mediadas por IL-2
Se tiene muy poca información acerca de cuáles son los mecanismos que transmiten las señales mediadas por la IL-2 desde la superficie celular al núcleo.
Cuando la IL-2 se une a su receptor de alta afinidad este complejo se internaliza rápidamente (Kumar et al. 1987). La internalización es un paso necesario pero no suficiente en el proceso de proliferación mediada por IL-2, lo que parece indicar que probablemente esta molécula no interacciona de una forma directa con las vías de transmisión de señales (Kono et al. 1990).
Para ejercer su efecto biológico, la IL-2 interacciona con su receptor específico en la superficie celular. Este receptor está formado por tres subunidades denominadas en función de su peso molecular: p55 (subunidad a), p70 (subunidad b) y p64 (subunidad g), que al combinarse forman el receptor de baja afinidad
(p55, Kd 10-8M), afinidad media (p70/p64, Kd 10-9M) y alta afinidad (p55/p70/p64, Kd 10-11M) (Fig. 2) (Leonard et al. 1984; Nikaido et al. 1984; Hatakeyama et al. 1989a).
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La interacción de la IL-2 con su receptor desencadena varios sucesos de señalización intracelular, incluyendo la fosforilación de proteínas en restos de tirosina y la subsiguiente inducción de varios protooncogenes críticos para la proliferación celular (Minami et al. 1993a; Minami et al. 1993b; Kono et al. 1993).
​La IL-2 desencadena la activación de proteína tirosina-quinasas (PTK) e induce la fosforilación en tirosina de una proteína adaptadora denominada Shc. La fosforilación de Shc crea una región consenso para el dominio SH2 de otra proteína adaptadora, Grb2, la cual está compuesta por un dominio SH2 flanqueado a ambos lados por dominios SH3, esta proteína adaptadora interacciona con SOS, un factor de intercambio de nucleótidos de guanina. Por un mecanismo desconocido, se forma el complejo trimolecular Shc-Grb2-SOS que desencadena la transformación de GDP en GTP provocando la activación de la proteína Ras. La forma activa de Ras desencadena la cascada de serina/treonina quinasas. Aunque la interacción de Ras-Raf es necesaria para la activación de Raf, la interacción no activa la actividad catalítica de Raf. Después de la activación de esta proteína tiene lugar la fosforilación y activación de MEK el cual finalmente fosforila a proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK). Estas fosforilaciones activan a MAPK, la cual retransmite la señal a sistemas efectores por fosforilación de múltiples sustratos citoplasmáticos, incluyendo otras serina/treonina quinasas. Además MAPK se transloca al núcleo y fosforila ciertos factores de transcripción.
FIGURA 2. Representación esquemática del receptor de IL-2.
Por otra parte, Jak también transduce señales directamente al núcleo por fosforilación de Stat3 y/o Stat5. La fosforilación induce la dimerización de STAT, que desencadena la posterior translocación al núcleo (Fig. 3) (Karnitz y Abraham 1996).
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Además de estas proteínas quinasas, la IL-2 provoca la activación de PI3-quinasa (Augustine et al. 1991; Merida et al. 1991; Remillard et al. 1991; Karnitz et al. 1994). Una vez activada, esta quinasa fosforila al fosfoinositol (PI) 4,5-P2 para producir un segundo mensajero lipídico, PI-3,4,5-P3 el cual activa a otros efectores (Karnitz y Abraham 1996).
En la hemolinfa de Mytilus galloprovincialis se ha detectado un péptido de características inmunógenas similares a la IL-2, mientras que en hemocitos se ha identificado la presencia de un receptor para IL-2, este receptor es similar estructuralmente al de las células de vertebrados; está constituido por tres subunidades (a,b, g) cuyas masas moleculares son del mismo orden de magnitud que las encontradas en vertebrados (Barcia et al. 1999).
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Una misma citoquina puede dar lugar a diferentes respuestas (pleitropicidad), dependiendo del tipo y del estado de desarrollo de la célula blanco (Arai et al. 1990). En hemocitos de M. galloprovincialis cada citoquina interacciona con un receptor específico generando diversas respuestas. Igualmente, diferentes citoquinas mediante diferentes efectores dan lugar a aparentemente idénticas respuestas biológicas (redundancia) (Cao 2002). Parece ser, por tanto, que las citoquinas son moléculas funcionalmente conservadas, que durante el proceso evolutivo han mantenido su pleiotropicidad, su redundancia en el modo de acción y una alta promiscuidad de sus receptores (Ottaviani et al. 1995; Cao 2002).
3. REGULACIÓN INTRACELULAR DE LAS RESPUESTAS CELULARES
3.1. Corticotropinas y estrógenos
El factor liberador de corticotropinas (CRF) parece ser una molécula señal potencialmente importante en procesos autoinmunoreguladores y neuroinmunes de vertebrados e invertebrados (Smith et al. 1992a).
Ciertos neuropéptidos participan en procesos reguladores en el sistema inmune de vertebrados e invertebrados (Van Epp s 1984; Fisher y Falke 1986; Stefa no et al. 1989). Además varios neuropéptidos endógenos, estimulan la adherencia, cambios conformacionales, y actividad locomotora en humanos y en inmunocitos de invertebrados (moluscos, insectos) (Stefa no 1989). Por otra parte el CRF parece inducir inmunosupresión celular a través de su propio receptor (Smith et al. 1992b).
Los hemocitos de invertebrados son capaces de responder a CRF y a fragmentos de ACTH (hormona adrenocorticotrópica) proporcionando evidencias de una complejidad en la señalización intracelular dentro del sistema inmune en animales relativamente primitivos (Genedani et al. 1994).
FIGURA 3. La IL-2 induce la activación de Ras y Stat.
En hemocitos de M. galloprovincialis mantenidos en cultivo, la incubación con CRF provoca la expresión de la cadena a del receptor de IL-2 y la liberación de catecolaminas (Cao et al. 2004). Del mismo modo, en hemocitos no cultivados de los caracoles Vivíparus ater y Plarnobarius Corneus, la estimulación con CRF también provoca la liberación de aminas biógenas (Ottaviani et al. 1994).
Los glucocorticoides y las catecolaminas inducen respuestas secundarias, incluyendo incrementos en los niveles de oxígeno, movilización de sustratos y relocalización de energía ajena a la requerida en los procesos fisiológicos, tales como crecimiento, reproducción y determinadas funciones inmunes (Wendelaar Bonga 1997).
La ACTH debería de ser considerada un importante inmunoregulador que forma parte del complejo mosaico de relaciones entre el sistema inmune y el neuroendocrino. Esta molécula es capaz de neutralizar directa o indirectamente agentes que pueden perturbar la homeostasis del cuerpo. El efecto de la ACTH en las células inmunes es complejo y está influenciado por varios factores, tales como su concentración, presencia de citoquinas, etc. Este efector puede ejercer efectos directos o indirectos a varios niveles, modulando la transducción de señales en la membrana plasmática o alterando la producción de factores de crecimiento y la diferenciación celular, ej: TNF-a (Hughes y Smith 1989).
La hormona adrenocorticotrópica (ACTH) induce cambios en la forma de los inmunocitos de moluscos por la vía adenilato ciclasa/AMPc /PKA y también provoca la activación de la PKC. Sin embargo estos efectos desaparecen al añadir inhibidores de las proteínas G, de la adenilato ciclasa, o de la PKA. Además se ha demostrado que ACTH induce movilidad en hemocitos fagocíticos de Vivíparus ater por modificación de componentes del citoesqueleto, también induce la secreción de glucocorticoides adrenales y puede afectar a diferentes sistemas y comportamientos. En concreto está implicada en las funciones del sistema cardiovascular de células inmunocompetentes y juega un papel importante en la inflamación, termorregulación, alimentación y en el comportamiento social y sexual. De este modo, ACTH, puede tener una importancia central en el mantenimiento de la homeostasis del organismo (Ottaviani et al. 1999).
Los estrógenos no son simplemente hormonas reproductoras, influyen en el funcionamiento de tejidos no reproductivos y en el sistema inmune (Haynes et al. 2000; Mendelsohn 2000; Razandi et al. 2000; Guo et al. 2002; Stefa no y Peter 2001).
En hemocitos de mejillón Mytilus galloprovincialis, el 17b-estradiol (E2) induce «in vitro» cambios en la forma celular, en la desestabilización de la membrana lisosomal, en la liberación de enzimas hidrolíticos y en la estimulación de la actividad bacteriana a través de la activación de caminos de transducción de señal mediadas por tirosina-quinasas (Canesi et al. 2004), en particular, p38 MAPK y STAT. La activación de estas proteínas juegan un papel clave en la respuesta de defensa de hemocitos de mejillón a infecciones bacterianas (Canesi et al. 2002 a,b).
MAPKs son una familia de serina-treonina proteína quinasas que se expresan en todas las células eucariotas y que se activan en respuesta a una variedad de estímulos extracelulares (Caffrey et al. 1999; Ichijo 1999; Martín-Blanco 2000). Las MAPKs están reguladas por mitógenos y factores de crecimiento a través del camino dependiente de Ras implicado en la activación secuencial de MAPKKK y MAPKK (Ichijo 1999).
Las proteínas STAT son activadas por diferentes estímulos extracelulares (citoquinas, factores de crecimiento, hormonas) y están implicadas en determinados procesos fisiológicos, incluyendo apoptosis y proliferación celular (Calò et al. 2003). Además son los únicos factores de transcripción conocidos que se activan por fosforilación en tirosina, una vez fosforilado, se dimeriza y se trasloca del citosol al núcleo, la fosforilación en serina es también necesaria para una máxima actividad transcripcional (Horva th et al. 2000).
Canesi et al. (2005), han encontrado en hemocitos de mejillón que E2 induce una rápida y transitoria fosforilación en tirosina de proteínas de la familia STAT: STAT3 y STAT5, modulando la actividad de estos factores de transcripción.
3.2. Factores de crecimiento
3.2.1. Factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF)
Factores de crecimiento, factores de diferenciación y hormonas son componentes importantes en el sistema regulador que coordina el desarrollo de organismos multicelulares. Algunos de estos factores median sus acciones pleiotrópicas por la unión y activación de receptores de la superficie celular con proteínas intrínsecas que presentan actividad tirosina quinasa (Ullrich y Schlessinger 1990).
Los factores de crecimiento desencadenan una serie de respuestas celulares. Estas incluyen estimulación de intercambio Na+/H+, afluencia de Ca2+, activación de fosfolipasa C–g y estimulación del transporte de glucosa y aminoácidos. La estimulación de la fosfolipasa C–g permite la generación de metabolitos de fosfatidilinositol, tales como inositol 1,4,5-trifosfato, el cual provoca la liberación de Ca²+ desde compartimentos intracelulares y la generación de diacilglicerol, un activador natural de la PKC (Fig. 4) (Nishizuka 1988).
La fosfatidilinositol 3-quinasa (Varticovski et al. 1989) y las proteínas ras (Molloy et al. 1989) son sustratos directos de algunos receptores que presentan actividad tirosina quinasa (Morrison et al. 1989).
FIGURA 4. Mecanismo de activación del fosfatidilinositol por receptores de tirosina quinasas. Abreviaturas: PMA, forbol 12-miristoato 13-acetato; PIP2, fosfatidilinositol 4,5-bifosfato, DG, diacilglicerol; IP3, inositol 1,4,5-trifosfato, IP3 R, receptor de IP3.
El factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF) está formado por dos tipos de cadenas: una cadena A y una cadena B. En su forma activa el PDGF es un dímero de dos monómeros que puede presentar todas las combinaciones posibles (ej: PDGF-AA, PDGF-BB, PDGF-AB) (Fig. 5) (Bowen-Pope et al. 1989; Hart et al. 1990; Claesson-Welsh 1994).
Tanto en vertebrados como en invertebrados, el PDGF-AB provoca cambios en la forma de las células e induce a los hemocitos a migrar de una manera quimiotáctil (Ottaviani et al. 1997).
En hemocitos cultivados de M. galloprovincialis, el PDGF induce un incremento en la expresión de la cadena a del receptor de IL-2 y provoca la liberación de Dopamina y Noradrenalina cuyas concentraciones disminuyen al tratar los hemocitos con bisindolamina (BSM), H-89 o suramina, inhibidores de la PKC, PKA y proteínas G respectivamente, indicando que el efecto del PDGF en hemocitos de mejillón podría estar mediado a través de diferentes caminos de señalización celular (Cao et al. 2004).​
El PDGF inicia un camino definido de transducción de la señal. La unión del ligando a cualquiera de las subunidades induce la autofosforilación del receptor (EK and Heldin 1982). A su vez, la estimulación del receptor de PDGF activa una cascada de enzimas como PKC, Ras, Raf, MAPK y finalmente desencadena la división celular (Bornfeldt et al. 1995; Hart et al. 1995).
​La activación de la cascada Ras-Raf-MAPK induce la proliferación celular (Bornfeldt et al. 1995) (Fig. 6). De este modo, MAPK juega un papel crítico en el control del crecimiento y diferenciación celular.
Un camino alternativo para estimular la actividad MAPK es a través de la PKC (Sözei et al. 1992; Kolch et al. 1993; Li et al. 1995).
Cuando el PDGF se une a un receptor, rápidamente estimula un grupo de respuestas «tempranas» que ocurren en minutos. Esto incluye la activación de tirosinas-quinasas, hidrólisis de fosfatidilinositol (PI), alteraciones en el pH celular, incremento en los niveles de calcio citosólico, incremento en la expresión de determinados genes e internalización y degradación del receptor (Lewis 1989). El factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) estimula la transcripción de c-fos y c-myc a través de al menos dos caminos, uno de ellos está mediado por la proteína quinasa C y el otro no. Los mecanismos moleculares de estos caminos no han sido aclarados, pero parece que ambos culminan en la modificación covalente de una proteína. Los pasos que intervienen pueden consistir en una cascada de reacciones quinasa en las que estarían implicadas tirosina, serina y treonina quinasas (Lewis 1989).
FIGURA 5. Interacción del PDGF con su receptor.
3.2.2. Factor de crecimiento transformante b (TGF-b) y factor de crecimiento epidérmico (EGF)
El TGF-b1 está implicado en la respuesta inmune y en la reparación de procesos deteriorados, tanto en vertebrados como en invertebrados (Tettamanti et al., 2006), existiendo una fuerte conexión entre este factor y la liberación de catecolaminas (Cao et al. 2007).
Miembros de la familia del factor de crecimiento transformante b (TGF-b) se unen a receptores serina/ treonina quinasas del tipo II y tipo I, los cuales inician señales intracelulares a través de la activación de proteínas Smad. Las funciones de Smads son reguladas por otros caminos de señalización, tales como MAPK. Además, estas proteínas interaccionan y modulan varios factores de transcripción que son blancos de otros caminos de señalización (Miyazoho et al. 2000).
El factor de crecimiento epidérmico (EGF) es una llave reguladora del crecimiento y diferenciación celular en algunas células de mamíferos (Carpenter 1987). En células de mejillón, péptidos similares a factores de crecimiento pueden actuar como reguladores fisiológicos del crecimiento celular y del metabolismo, además la señalización celular está
FIGURA 6. Caminos de transducción de señales iniciados por PDGF.
​íntimamente relacionada con el balance redox e indica que esta relación podría generalizarse a otros grupos (Canesi et al. 2000).
Los pasos en la transducción de señales, parecen ser similares en diferentes células: la unión de EGF a su receptor induce la dimerización de éste y la activación de su actividad tirosina-quinasa, la cual es esencial para la transducción de la señal (Ullrich y Schlessinger 1990; Sdhlessinger y Ullrich 1992). Como consecuencia de la activación de EGFR, se desencadenan una variedad de cambios iónicos incluyendo una hiperpolarización pasajera de la membrana, la alcalinización citoplasmática y un incremento en la concentración del calcio citosólico (Hesketh et al. 1985; Moolenar 1986; Solthoff y Cantley 1988; Peppelenbosh et al. 1991).
3.3. Lipopolisacáridos bacterianos
Los lipopolisacáridos bacterianos (LPS) son los principales componentes de la pared de la mayoría de las bacterias Gramnegativas y actúan como fuertes estimuladores de la inmunidad innata o natural en diversas especies eucarióticas desde insectos a humanos.
El LPS activa macrófagos e induce la secreción de metabolitos de ácido araquidónico, intermediarios del nitrógeno y citoquinas tales con TNF-a, IL-1 e IL-6 (Adams et al. 1984; Morrison et al. 1987), las cuales juegan un papel importante en la respuesta inmune.
En macrófagos, el LPS desencadena la activación de varios caminos de transducción de señales en los que están implicados proteínas G, tirosina-quinasas, fosfolipasa C (PLC), proteína quinasa A (PKA) y proteína quinasa C (PKC) (Sweet et al. 1996; Fujihara et al. 1994; Liu et al. 1994, Shapira et al. 1994)
EL LPS también activa diferentes cascadas de proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK), incluyendo las proteínas quinasas reguladas por señales extracelulares (ERK) (Reimann et al. 1994; Weinstein et al. 1992). Para la actividad de MAPK es necesaria la fosforilación de residuos de tirosina y treonina (Boulton et al. 1991). ERK activa fosforila y regula varias proteínas quinasas adicionales, componentes del citoesqueleto, fosfolipasa A2, y factores de transcripción nuclear (c-Jun) (Treisman 1996).
MAPK fosfatasa–1 (MKP-1) es un miembro inducible de doble especificidad (Charles et al. 1993; Keyse et al. 1992; Noguchi et al. 1993). MKP-1 desfosforila residuos de tirosina y treonina en ERK1/2 (Alesi et al. 1993; Sun et al. 1993), de este modo permite la inactivación de estas quinasas. MKP-1 desfosforila e inactiva los genes c-Jun y p 38 (Chun et al. 1996). La expresión de MKP-1 no es dependiente de la activación de MAPKs y ERK 1/2 en respuesta al LPS. En cambio, la inducción de esta fosfatasa necesita la activación de tirosina quinasas y de la isoforma e de la PKC. Esto sugiere que, en macrófagos, la PKCe juega un papel importante en el control negativo de la actividad de MAPK a través de la inducción de la fosfatasa MKP-1 (Fig. 7) (Valledor et al. 2000).
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La PKC puede interaccionar con varios sistemas de señalización incluyendo el camino a través de Ras-Raf-MAP y el dependiente de calcio-calmodulina y puede regular de forma positiva o negativamente la disponibilidad de sus propios cofactores lipídicos. (Keenan et al. 1997).
FIGURA 7. Control negativo de la actividad de MAPK a través de la inducción de la fosfatasa MKP-1. Las líneas sólidas representan interacción directa y las discontínuas representan la presencia de pasos intermedios. Las líneas en forma de T representan inhibición. Los círculos representan formas activas y los cuadrados formas inactivas.
FIGURA 8. Activación de células diferenciadas e indiferenciadas a través de PKC.
La hidrólisis de fosfolípidos de membrana es un mecanismo común para la transducción de varias señales extracelulares en la célula como hormonas, neurotransmisores, antígenos y algunos factores de crecimiento. La fosfolipasa C está implicada en la hidrólisis de fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2) que produce dos segundos mensajeros: inositol 1,4,5-trifosfato (IP3), el cual libera calcio de depósitos intracelulares, (Berridge e Irvine 1984) y diacilglicerol (DAG) el cual activa la proteína quinasa C (Fig. 8).
La proteína quinasa C es una familia multigénica de serina-treonina-quinasas que se agrupa en tres secciones diferentes en base a características estructurales similares y a requisitos de activación (Tabla 1).
Se han asignado algunas funciones fisiológicas a la PKC incluyendo su implicación en la secreción y exocitosis, contracción del músculo liso, expresión de genes y proliferación celular, además la PKC ejerce un control negativo en varias etapas del proceso de señalización celular (Nishizuka 1992).
El LPS también induce la activación de varios caminos de transducción de señales en los que está implicada la proteína quinasa A. El complejo LPS-LBP se une a su receptor de membrana, esta asociación induce la expresión de COX-2 (ciclooxigenasa-2), la posterior formación de PGE2 (prostaglandina E2), la producción de AMPc y la activación de la PKA (Fig. 9) (Chen et al. 1999).
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​La proteína quinasa dependiente de AMPc (proteína quinasa A, PKA; E.C. 2.7.1.37) fue descubierta por el grupo de Krebs, durante el estudio de la regulación de la glucógeno fosforilasa (Walsh et al. 1968; Krebs 1993a, 1993b).
En su estado inactivo, la enzima es un tetrámero formado por dos subunidades reguladoras (R) y dos subunidades catalíticas (C). La unión de AMPc a las primeras promueve la disociación de la holoenzima en un dímero de subunidades reguladoras y dos subunidades catalíticas monoméricas y activas que pueden fosforilar restos de serina o treonina de un amplio espectro de proteínas, dependiendo del tipo de célula y de su estado de diferenciación, lo que se traduce en numerosos efectos biológicos (Zetterquist et al. 1990).
En relación a los caminos de transducción de señales se ha observado que la IL-1b y TNF-a pueden activar la PKC o la PKA, vía fosfolipasa C y adenilato ciclasa respectivamente (Dinarello 1991; Vilcek y Lee 1991). La activación o inhibición de la adenilato ciclasa es una de las funciones mejor estudiadas en cuanto a la modulación de efectores a través de receptores hormonales acoplados a proteínas G (Fig. 10) (Herrera 1993).
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TABLA 1. Clasificación de las isoenzimas de la familia PKC.
FIGURA 9. Representación esquemática de la activación de la PKA inducida por LPS. Abreviaturas: LPS, lipopolisacáridos; LBP, proteína que se une al LPS; COX-2, ciclooxigenasa 2; PGE2, prostaglandina E2; AMPc, adenosín monofosfato cíclico; PKA, proteína quinasa A; mCD14, complejo diferenaciado de membrana.
La implicación de la PKC en el control del crecimiento y diferenciación es evidente, pues varios efectores de crecimiento incluyendo el factor de crecimiento derivado de plaquetas y en algunos casos EGF pueden involucrar a la PKC en su proceso de transducción de señal (Kanashiro y Khalil 1998).
FIGURA 10. Sistemas de la adenilato ciclasa y del fosfatidilinositol en la respuesta hormonal. Abreviaturas: PKA y PKC, proteína quinasa A y C; PDE, fosfodiesterasa de fosfatidilinositol; PI, PIP, PIP2 , fosfatidilinositol, fosfatidilinositol 4-fosfato y fosfatidilinositol 4.5- bisfosfato; IP3,inositol-1,4,5 trifosfato; DG, diacilglicerol; AC, adenilato ciclasa.
En el manto de Mytilus galloprovincialis se ha purificado una proteína de 105 kDa (p105) que presenta actividad quinasa dependiente de fosfatidil L-serina y PMA, e independiente de Ca2+. Los inductores LPS e IL-2 provocan cambios en la expresión de p105, pero no de la subunidad reguladora de la PKA (Cao et al. 2007).
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Los parámetros cinéticos de esta proteína p105 la asemejan a isoformas de nPKC de mamíferos. Además el Ca2+ ejerce una inhibición de tipo mixto sobre la enzima purificada.
La proteína p105 es capaz de autofosforilarse, en condiciones de ensayo, sin mediar la presencia de cofactores lipídicos. Esta proteína también se encuentra presente en manto, branquias, pie, músculo aductor, hepatopáncreas y hemocitos de M. galloprovincialis. La estimulación de hemocitos con PMA induce la translocación de p105 a la membrana plasmática y se regula por degradación (Down-Regulation) en función del tiempo de exposición. Esta enzima fosforilada contiene residuos de P-Ser. Por otra parte, se obtuvieron anticuerpos policlonales que reconocen específicamente p105 (Mercado 2001).
También se ha caracterizado la proteína quinasa dependiente de AMPc procedente del mejillón Mytilus galloprovincialis. Al igual que ocurre con su homóloga de mamíferos, la enzima del molusco está constituida por dos tipos de subunidades: catalítica y reguladora, que fueron purificadas de forma independiente mediante procesos diferentes.
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La subunidad catalítica de la PKA de mejillón mostró unas propiedades tanto físicas como cinéticas y un mecanismo de regulación, esencialmente idénticos a los descritos para la proteína homóloga de mamíferos, lo que sugiere un elevado grado de conservación estructural entre ambas proteínas a pesar de las diferencias en la escala evolutiva.
En extractos de manto de mejillón, se identificaron tres proteínas que unen específicamente AMPc, con masas moleculares de 54 kDa, 42 kDa y 37 kDa, que posteriormente fueron purificadas mediante cromatografía de afinidad a través de AMPc-agarosa. Sin embargo, de las tres proteínas, solamente la de 54 kDa fue capaz de reasociarse con la subunidad catalítica de la PKA e inhibir su actividad quinasa, en ausencia de AMPc, lo que indica que únicamente esta proteína puede actuar como subunidad reguladora de la proteína quinasa A del molusco.
En relación a las proteínas que unen AMPc de 42 kDa y 37 kDa, incapaces de inhibir la subunidad catalítica de la PKA, probablemente son fragmentos proteolíticos procedentes de la subunidad reguladora, tal como indica el hecho de que sean reconocidas por un anticuerpo generado frente a la proteína de 54 kDa (Cao, 1996).
Todavía queda mucho por hacer hasta que se identifiquen los componentes implicados en la transducción de señales de moluscos y su relación con diversas rutas de señalización intracelular.