12. PROBIÓTICOS EN CULTIVOS LARVARIOS DE MOLUSCOS BIVALVOS EN CRIADERO
Resumen
El uso de bacterias probióticas es desde hace algunos años la alternativa más prometedora en acuicultura para la mejora del desarrollo de los cultivos, evitando así los perjuicios derivados de los antibióticos y otros medios de control, que además no han demostrado ser suficientemente eficaces.
En este capítulo se analizan las ventajas de su aplicación concreta en el caso de los criaderos de moluscos bivalvos, en relación con las particularidades de este tipo de cultivos. La necesidad de su utilización viene justificada por los inconvenientes de los diferentes sistemas de control de las enfermedades utilizados habitualmente, como los tratamientos del agua y la quimioterapia. Se profundiza en la definición de ‘probiótico’ en acuicultura, término sobre el cual todavía no se ha llegado a un acuerdo, describiendo cuáles deben ser sus características ideales. Se indican además, las diferentes especies bacterianas que se han sugeridos como potenciales probióticos para cultivos larvarios de bivalvos, sus orígenes, la forma en que han sido seleccionadas, los modos de acción y sus posibles aplicaciones en los criaderos.
1. INTRODUCCIÓN
El cultivo de moluscos bivalvos en criadero, como ya se ha referido en otros capítulos, está afectado frecuentemente por episodios de mortalidades graves, que en muchas ocasiones pueden relacionarse con infecciones microbiológicas, principalmente bacterianas. La consecuencia a gran escala es la pérdida de lotes completos de producción, que implica no sólo problemas económicos sino también una falta de regularidad en el suministro de semilla para el cultivo exterior.
La falta de estudios sistemáticos y rigurosos acerca de los poblaciones bacterianas asociadas a estos cultivos y, por tanto, su desconocimiento, han llevado a la búsqueda de soluciones siempre orientadas a la eliminación total de la microbiota en el punto de control más factible, el agua de cultivo. Los diferentes métodos empleados, desde los tratamientos del agua hasta la quimioterapia, han demostrado no ser suficientes para evitar los episodios de mortalidades. Este hecho, junto con los múltiples inconvenientes que presentan, obligó a la apertura de vías alternativas entre las que destaca claramente el uso de bacterias probióticas. El enfoque cambia hacia la obtención de una población bacteriana equilibrada con capacidad de autorregulación.
2. MÉTODOS CLÁSICOS DE CONTROL DE PATÓGENOS
2.1. Tratamiento del agua
La influencia del medio en los cultivos en criadero es muy importante. Hay que tener en cuenta que las larvas de bivalvos son liberadas en estadios ontogénicos tempranos, especialmente sensibles a potenciales infecciones, que se ven, además, favorecidas por la alimentación filtradora, que conlleva un flujo constante del agua de cultivo a través de su organismo. Otros factores que aumentan los riesgos son la permanencia en circuito cerrado, en una misma agua de cultivo durante períodos de 2-3 días, y el aporte regular al medio de materia orgánica y bacterias a través del alimento. Todo ello ha llevado a que la calidad microbiológica del agua de cultivo sea el principal punto de control para evitar enfermedades bacterianas.
Es habitual que el agua utilizada en los criaderos sea sometida a algún proceso con el objetivo de reducir la población bacteriana asociada. En general suele haber un primer paso de decantación del agua natural bombeada desde el mar. Una vez eliminadas buena parte de las partículas sólidas en suspensión se procede a la filtración, un tratamiento caro, cuyo coste se incrementa en función del volumen de agua que se filtre y el grado de filtración que se quiera alcanzar. Este primer inconveniente hace que sólo se llegue al máximo tratamiento en lo que se consideran las secciones más sensibles del criadero, correspondientes en general a los cultivos larvarios y los cultivos de fitoplancton que se mantienen a menor volumen.
La filtración reduce el número de bacterias viables, pero su eficiencia en relación con el número total de bacterias es menos regular (Jeathon et al. 1988). Sus estudios con cultivos en criadero de Pecten maximus muestran un incremento del recuento de heterótrofas viables en los días siguientes a la filtración, probablemente asociado al aporte diario de fitoplancton. De cualquier manera, resulta una práctica recomendable para reducir los contenidos tanto bacterianos como de materia orgánica, que ofrece mejores resultados que otros sistemas, como la pasteurización. En un estudio realizado por Lewis et al. (1988) en un criadero de Crassostrea gigas, comparando ambos tipos de tratamiento para el agua empleada para los cultivos de microalgas que sirven de alimento a las larvas, la filtración ofrece mejores resultados. El principal inconveniente de la pasteurización es que en este sistema el largo circuito de tuberías junto con el tiempo que es necesario esperar hasta que el agua enfría, facilitan la contaminación por microorganismos antes de que se lleguen a inocular los cultivos algales.
El filtro de carbón es otra de las opciones aplicadas en algunos casos, pero Brown (1983) comprueba que aunque se puede ver un efecto inicial positivo en los cultivos de C. virginica, al cabo de tres semanas resulta perjudicial si no se cambia a diario el agua. La desinfección por lejía (cloración) también ha sido utilizada, pero presenta grandes problemas entre los que destaca la interferencia en el mecanismo de bombeo, como recogen Vasconcelos y Lee (1972) para cultivos larvarios de C. gigas. Hay algunos estudios que sugieren que reacciones entre la lejía y el nitrógeno orgánico en el agua pueden producir residuos tóxicos para organismos marinos (Jorquera et al. 2002). También se ha utilizado ozono, pero se ha descrito la presencia en el agua de residuos, productos de altas dosis de este tratamiento, que son tóxicos para peces y bivalvos (Jorquera et al. 2002).
Junto con la filtración, el sistema de esterilización más habitual es el tratamiento del agua con radiación ultravioleta (UV), con un indiscutible poder letal sobre las bacterias. Sin embargo, existen discrepancias respecto a sus efectos reales cuando se aplica en el agua de cultivo de criaderos. Vasconcelos y Lee (1972) encuentran ventajas en su uso, ya que tras el tratamiento del agua con UV disminuyen diferentes poblaciones bacterianas, como Pseudomonas, Vibrio, coliformes y cocos Gram positivos, entre las que se encuentran algunos potenciales patógenos. De la microbiota estudiada por estos autores, sólo hay un aumento del grupo Acinetobacter-Moraxella. Otros autores, como Murchelano et al. (1975) encuentran importantes variaciones entre diferentes muestras de cultivos larvarios de C. virginica, aunque en general haya una reducción significativa del número de bacterias. Con respecto a la composición de la población bacteriana, hay una disminución de Vibrio, Achromobacter y Flavobacterium, pero en este caso se registra un aumento del número de Pseudomonas (dominantes también en el agua sin tratar)
En general observan una menor diversidad en el agua tratada y una reducción en la proporción de bacterias pigmentadas. Lodeiros et al. (1987) observan la disminución de la población de vibrios en cultivos larvarios de Ostrea edulis. Sin embargo, Brown (1981) encuentra que el mismo tratamiento con UV es efectivo frente a una de las dos cepas de Vibrio spp. Patógenas que ensaya, mientras que la otra cepa se recupera después de una inhibición inicial.
Por tanto, no sólo el efecto del tratamiento por UV no parece ser homogéneo para todas las poblaciones bacterianas, sino que otros factores como la dosis empleada, el flujo de agua y la eficiencia individual de la unidad de irradiación, añaden variabilidad a los resultados. Brown y Russo (1979) muestran el efecto positivo del tratamiento por UV del agua en que se eclosionan larvas de C. virginica, agua que previamente ha sido filtrada e inoculada con bacterias patógenas de los géneros Vibrio y Pseudomonas. Pero, junto con la disminución de los efectos de los patógenos y de la posibilidad de episodios de mortalidades, apuntan el grave riesgo que supone el que el mismo tratamiento pueda ser bacteriostático en lugar de bactericida, si la dosis empleada no es la adecuada. Este riesgo de una inhibición temporal, con el simple retraso del crecimiento de algunas bacterias, es apuntada en trabajos posteriores (Brown 1983). Liltved et al. (1995) observan una vez más resultados en esta misma línea, con la necesidad de diferentes dosis para la inactivación de patógenos distintos. La eficiencia del tratamiento puede verse menguada también por el contenido orgánico del agua, por aquellas pequeñas partículas a las que se puedan encontrar unidas bacterias (Liltved y Cripps 1999). En general, estas grandes diferencias de efectividad pueden llevar a la selección de poblaciones no deseadas, dentro de aquellas resistentes al tratamiento, que se encontrarían con un nicho ecológico favorable para su rápido desarrollo. Junto con todo lo expuesto, el UV presenta otros inconvenientes como su elevado coste económico y la imposibilidad del tratamiento de grandes volúmenes de agua.
2.2. Quimioterapia
El uso de antibióticos es un método muy extendido en los criaderos de bivalvos, desde que Dav is y Chanley (1956) demostraran que su utilización puede reducir las mortalidades larvarias de Mercenaria mercenaria. Sin embargo, en paralelo con los trabajos que confirman sus efectos beneficiosos sobre los cultivos larvarios de bivalvos, se han descrito otros efectos tóxicos, así como casos de falta de efectividad o inconsistencia de los resultados obtenidos (ver revisiones D’agostino 1975; Le Pennec y Prieur 1977; Prado 2006).
Entre los estudios que ponen de manifiesto los graves riesgos que implica el uso de antibióticos en cultivos larvarios de bivalvos está el trabajo de Jeffries (1982), que observa que el tratamiento con cloranfenicol consigue una ligera recuperación de un cultivo larvario de C. gigas, pero que al mismo tiempo causa un cese de la natación larvaria, es decir, de la alimentación. En experimentos con Mytilus edulis (Hily 1974), el tratamiento con cloranfenicol conlleva una buena supervivencia pero con un desarrollo lento, efecto contrario al uso de la combinación ampicilina-estreptomicina, con desarrollo excelente y baja supervivencia. Hay ejemplos también de un mismo antibiótico que puede tener un efecto variable, tóxico o beneficioso, sobre cultivos de una misma especie, como es el caso de la polimixina B en C. virginica (Brown 1983). Para esta misma ostra, la eritromicina resulta tóxica a la dosis efectiva (Brown y Tetelbach 1988); mientras que los resultados obtenidos con este antibiótico para Pecten maximus son inconsistentes (Robert et al. 1996). La rifampina, aunque obtiene buenas supervivencias iniciales, causa deformaciones en cultivos de Tridacna derasa (Fitt et al. 1992).
Es interesante el trabajo de Hidu y Tubiash (1963), con cultivos larvarios de M. mercenaria y C. virginica, cuya tasa de crecimiento mejora al ser tratados con Combistrep (dihidroestreptomicina+estreptomicina sulfato). Observan una relación entre la carga bacteriana inicial y el efecto obtenido. En agua de mar que presenta recuentos iniciales altos, la mejora del crecimiento es mayor que en agua con contenidos iniciales bajos. Es más, en cultivos sin bacterias el antibiótico no tiene un efecto favorable. Cuando analizan los cambios producidos en las poblaciones bacterianas presentes en el agua, se encuentran con que el número de bacterias aumenta en relación directa con la dosis de antibiótico. Se sugiere, por tanto, que el antibiótico selecciona una determinada población bacteriana que es la que realmente tiene un efecto positivo sobre el crecimiento larvario, quizá por inhibición de otras especies productoras de toxinas.
A la falta de efectividad o la inconsistencia de los resultados obtenidos, hay que unir otros inconvenientes a la hora de utilizar antibióticos en criaderos de bivalvos derivados de las características de las propias sustancias, como la rápida degradación de la tetraciclina y la penicilina por pH elevado como el del agua del mar, el favorecimiento de la aparición de resistencias por el uso de estreptomicina o la toxicidad para muchos invertebrados de la neomicina a dosis altas (estable en agua de mar y lenta en el desarrollo de resistencias). El cloranfenicol, el antibiótico de uso más extendido en criaderos de bivalvos, aunque tiene una vida media larga, es extremadamente tóxico, pudiendo causar deformidades larvarias y con conocidos riesgos para el ser humano, además de favorecer el desarrollo de resistencias.
Otro gran problema es el coste económico de los tratamientos con antibióticos, que en acuicultura puede igualar al coste del stock (Baticados et al. 1990). Así, la utilización simultánea de combinaciones de antibióticos estables y de amplio espectro, que sería la mejor opción, es inaplicable en cultivos larvarios de bivalvos (Walne 1958; Fitt et al. 1992).
Mención especial merece la aparición de resistencias. La resistencia a un antibiótico es un fenómeno por el que cultivos bacterianos inicialmente sensibles a él dejan de serlo, pudiendo incluso multiplicarse en su presencia. Los plásmidos R, presentes de forma natural en diferentes bacterias marinas (incluyendo vibrios patógenos), confieren resistencia a un amplio espectro de agentes antibacterianos, implicando un riesgo de infección por este tipo de bacterias incluso para criaderos que no utilicen antibióticos (Jeffries 1982; Brown y Tettelbach 1988). La aparición de resistencias está favorecida por el uso de los antibióticos como tratamiento rutinario preventivo (Le Pennec y Prieur 1977), al ser las mortalidades larvarias fulminantes e imposibles de tratar una vez se detectan. Una consecuencia inmediata es la aparición y persistencia de enfermedades que no pueden ser tratadas de forma eficiente (Mcphearson et al. 1991; Spanggaard et al. 1993; Karunasagar et al. 1994).
Existe también la posibilidad de transferencia de factores de resistencia a potenciales patógenos humanos, con el consiguiente riesgo para los trabajadores de los criaderos (Jeffries 1982; Mcphearson et al. 1991; Spanggaard et al. 1993). Además, mediante el intercambio de agua que hay entre el criadero y el medio natural, se pueden propagar las bacterias resistentes (Mcphearson et al. 1991) e incluso depositar en sedimentos marinos, de los que pueden ser liberadas posteriormente (Nygaard et al. 1992).
Por último, la legislación es cada vez más restrictiva con el uso de antibióticos. Es el caso del cloranfenicol, cuyo uso ha sido prohibido en cualquier animal susceptible de ser destinado al consumo humano (Anexo IV del Reglamento de la CEE 2377/90/EEC), debido tanto a sus potenciales efectos tóxicos para humanos como a la imposibilidad de determinar niveles seguros de residuos.
En general, todos los tratamientos expuestos (filtración, ultravioleta, quimioterapia, etc.) buscan la eliminación de la microbiota asociada al agua de los cultivos. Este objetivo no parece razonable, ya que la población bacteriana, o al menos parte de ella, tiene un efecto beneficioso en el desarrollo larvario. Hidu y Tubiash (1963) relacionan el crecimiento larvario con el número y especies de bacterias existentes en el cultivo, sugiriendo su papel como fuente de nutrientes. Parecen satisfacer requerimientos metabólicos, aportando vitaminas u otros factores de crecimiento (Prieur et al. 1990). También la producción de enzimas extracelulares puede ayudar en el aprovechamiento del alimento, los procesos digestivos o la eliminación de residuos tóxicos (Douillet y Langdon 1993). De hecho, estudios de supervivencia larvaria de Argopecten purpuratus en agua de mar con diferentes grados de filtración muestran que esta es máxima en el agua menos filtrada (5,0 mm), en la que se pueden ver agregados bacterianos, que pueden ser ingeridos y servir como promotores del crecimiento (Riquelme et al. 1997).
Hay que considerar además que la eliminación total de la microbiota facilita la colonización del medio por poblaciones bacterianas que pueden no ser las deseadas. La competencia natural que lleva al equilibrio desaparece, dejando vacío un nicho ecológico muy apetecible, a lo que hay que sumar el aporte regular de materia orgánica y las condiciones de cultivo. Y aunque se elimine la población del agua, las bacterias siguen incorporándose al sistema a través del alimento y asociadas a las propias larvas. En conjunto es un medio de cultivo idóneo para la proliferación de bacterias con rápidas tasas de crecimiento, como es el caso de los patógenos oportunistas más frecuentes en cultivos larvarios de bivalvos, pertenecientes al género Vibrio.
El objetivo a perseguir ha de ser la obtención de una población bacteriana equilibrada y con capacidad para el control de la proliferación de los potenciales patógenos oportunistas asociados al sistema de forma natural.
La vacunación, una alternativa que ha obtenido excelentes resultados en el cultivo de peces (Toranzo et al. 1996; Romalde et al. 2003), no es aplicable a los moluscos, ya que carecen de un verdadero sistema inmunológico.
Por todo lo expuesto hasta el momento, es necesaria la búsqueda de nuevas soluciones para el control de enfermedades bacterianas en los cultivos de bivalvos en criadero.
3. PROBIÓTICOS
3.1. Definición
El término ‘probiótico’ se utiliza por primera vez en 1965, cuando Lilly y Stillwell lo definen como «sustancias producidas por un protozoo que estimulan el crecimiento de otro». Posteriormente, Parker (1974) define ‘probiótico’ como «organismos y sustancias que contribuyen al balance intestinal». Como esta definición incluiría a antibióticos o ácidos grasos de cadena corta, Fuller (1989) propone una definición más precisa: «un microorganismo vivo que como suplemento alimenticio beneficia al hospedador mejorando su balance microbiano intestinal». Tannock (1997) apunta entonces que el efecto en el balance microbiano intestinal no se ha demostrado en muchos casos, proponiendo «células microbianas vivas administradas como suplementos en la dieta con el objeto de mejorar la salud».
Todas estas definiciones responden a la utilización en homeotermos, pero al aplicar el término en acuicultura y considerar el tránsito de los microorganismos en el medio acuático se justificaría la extensión del concepto a aquellos preparados microbianos vivos utilizados para tratar los tanques de cultivo. Moriarty (1998) propone ampliar la definición a microorganismos añadidos al agua, pero esto haría muy vaga la definición de Tannock (1997).
En 1999, Gatesoupe da una definición alternativa para su uso en acuicultura, «células microbianas administradas de forma que penetren en el tracto gastrointestinal y permanezcan vivas, con el objeto de mejorar la salud del hospedador». Considera de este modo el tratamiento con probióticos como un método de ‘control biológico’ o ‘biocontrol’, término que se refiere a la limitación o eliminación de enfermedades mediante la introducción de organismos antagonistas de los agentes etiológicos, ya sean parásitos o patógenos específicos. De hecho, Maeda et al. (1997) proponen denominar como ‘biocontrol’ los métodos de tratamiento utilizando «el antagonismo entre microorganismos (...) por el que los patógenos pueden ser eliminados o reducidos en número en el medio ambiente de la acuicultura».
Gram et al. (1999) amplían la definición de ‘probiótico’ a «un suplemento microbiano vivo que beneficia al hospedador mejorando su balance microbiológico», eliminando la restricción de mejora del balance intestinal. Gómez-Gil et al. (2000) apoyan esta definición, diferenciando el término del de ‘control biológico’ ya que un probiótico no necesariamente ataca de forma directa a un patógeno, pudiendo simplemente prevenir los daños causados por este, impedir su unión al hospedador, inhibir su crecimiento, etc. Separan también el concepto del de ‘promotor del crecimiento’, puesto que la acción del probiótico no se limita a la mejora del crecimiento, sino que está asociada a una mejora general de la salud.
Finalmente, Verschuere et al. (2000) dan una definición de ‘probiótico’ que recoge la estrecha interacción en la acuicultura del animal con el medio que le rodea, y que resulta la más apropiada para su aplicación a los cultivos larvarios de bivalvos. Un ‘probiótico’ se definiría como un «aditivo microbiano vivo que tiene un efecto beneficioso sobre el hospedador, modificando la microbiota asociada al hospedador o al ambiente, asegurando un uso óptimo del alimento o mejorando su valor nutricional, mejorando la respuesta del hospedador frente a la enfermedad, o mejorando la calidad de su medio ambiente.»
De cualquier manera, la polémica no está resuelta y continúa la publicación de trabajos acerca de la definición de ‘probiótico’ en relación con su aplicación en acuicultura. Así, Irianto y Austin (2002) proponen la definición «un microorganismo entero o un componente(s) que sean beneficiosos para la salud del hospedador», retomando características postuladas anteriormente, como su efectividad en rangos de temperatura y salinidad extremas. Además, diferencian ‘probiótico’ como aditivo aportado por alimento, frente a ‘vacuna’, que se referiría a productos veterinarios aplicados por inyección o inmersión. Con ello vuelven las complicaciones para la aplicación del término a la acuicultura de bivalvos, ya que no se puede hablar del establecimiento de una población bacteriana en las larvas diferente a aquella existente en el agua de cultivo (Jorquera et al. 2001), además de no poder determinarse las diferencias que sugieren entre vacunación y probiótico. Vine et al. (2006) retoman la definición de Gatesoupe (1999), utilizándola en su revisión de probióticos en larvicultura marina, aunque a pesar de su título se limita a los cultivos larvarios de peces. En una nueva revisión (Kesarcodi-Watson et al. 2008) se apoya la definición de Irianto y Austin (2002), señalando que al no ser preciso que se trate de un cultivo vivo se permite la inclusión de sustancias, derivados bacterianos, que parecen presentar propiedades inmunoestimulantes. Por otro lado, eliminan como requisito la actuación en el tracto gastrointestinal, apuntando que los efectos deseados, como competición por nutrientes o producción de sustancias inhibidoras, pueden darse en el agua de cultivo.
Considerando todas las definiciones propuestas hasta el momento para su aplicación en acuicultura, y concretamente en cultivos larvarios de bivalvos, la más apropiada sigue siendo la propuesta por Verschuere et al. (2000). Incluye la condición de que se trate de un microorganismo vivo, importante ya que es lo que posibilita la obtención de un equilibrio por la propia regulación del sistema, evitando los problemas derivados del uso de sustancias, aunque sean de origen bacteriano, como es el caso de los antibióticos. Además, recoge las particularidades de los cultivos larvarios, tanto en lo que respecta a su estrecha interacción con el medio, como a su falta de un verdadero sistema inmunitario.
3.2. Modos de acción
En la bibliografía son numerosas las referencias a los diferentes modos de acción mediante los que los probióticos consiguen tener un efecto beneficioso sobre los organismos diana, considerados estos como objetivos finales de este beneficio. Este efecto se puede alcanzar a través de diferentes mecanismos: complemento nutricional, mejora del aprovechamiento del alimento, mejora de la respuesta inmunitaria, actividad antibacteriana, competencia por sustancias, energía o espacio de adhesión, estimulación de procesos y mejora de la calidad del agua.
En el caso específico de los cultivos de bivalvos en criadero, los modos de acción recogidos en la bibliografía son sólo algunos de los mencionados (Tabla 1). Pueden actuar como complemento nutricional (Douillet y Langdon 1994) o tener un papel como estimulantes de procesos concretos como la fijación o la metamorfosis (Fitt et al. 1990; Szewzyk et al. 1991; Tritar et al. 1992; Leitz y Wagner 1993; Walch et al. 1999), de gran importancia en bivalvos. De cualquier manera, dado que las larvas son liberadas al medio externo en estadios ontogénicos tempranos, estando expuestas a desórdenes asociados a la microbiota cuando su desarrollo no es completo, parece que el modo de acción más interesante para su aplicación en este tipo de cultivos es la actividad antibacteriana, extendida entre bacterias marinas (Dopazo et al. 1988; Barja et al. 1989; Lodeiros et al. 1989; Lemos et al. 1991; Riquelme et al. 1996; Riquelme et al. 1997; Gibson et al. 1998; Jorquera et al. 1999; Naka mura et al. 1999; Ruiz-Ponte et al. 1999; Riquelme et al. 2001; Prado 2006);. De esta forma se mejora la calidad del agua, en lo que respecta a la composición de la población bacteriana y el control de especies potencialmente patógenas, a través de la búsqueda de un equilibrio dependiente de las interacciones dentro de la propia microbiota, y evitando los riesgos conocidos del uso de agentes quimioterápicos (Tabla 2, Fig. 1).
Las características deseables de un probiótico, además de su condición de microorganismo vivo, adaptadas para su aplicación en acuicultura de bivalvos, serían:
a) Origen en el medio en que va a ser utilizado, es decir, una bacteria marina en este caso preferiblemente autóctona de criaderos (Riquelme et al. 1996; Verschuere et al. 2000), asegurando de esta manera su capacidad para desarrollarse en el ambiente y minimizando los riesgos por introducción de organismos alóctonos en el sistema.
TABLA 2. Resumen de los trabajos publicados acerca del espectro de actividad de bacterias marinas.
FIGURA 1. Métodos más utilizados para determinar la actividad antibacteriana de una cepa: acúmulos (izquierda) y doble capa (derecha).
b) Tener un efecto beneficioso sobre el organismo diana, mediante cualquiera de los modos de acción explicados.
c) No resultar patógeno ni tóxico, no sólo para el organismo diana sino también para otros organismos vivos presentes en el medio, como el fitoplancton. Además, no debe proliferar en el medio de forma que pueda llegar a serlo.
3.3. Aplicación de probióticos al cultivo de moluscos
Los trabajos acerca de probióticos en acuicultura corresponden mayoritariamente a estudios de peces y crustáceos, habiendo poca bibliografía disponible de este tipo de experimentos en moluscos bivalvos.
Lodeiros et al. (1989) publican un primer estudio acerca del efecto antibiótico de bacterias marinas en la supervivencia larvaria de la vieira Pecten ziczac. Comparan el efecto sobre los cultivos larvarios de tres cepas diferentes, Alteromonas sp. x24, Pseudomonas sp. P12 y Flavobacterium sp. P14, y de sus respectivos extractos antibióticos. Las dos primeras resultan tóxicas de cualquiera de las formas utilizadas, mientras que la tercera no sólo no lo es, sino que es capaz de combatir los efectos del patógeno Vibrio anguillarum EPp3. Resulta interesante que los mejores resultados se obtengan al añadir el cultivo bacteriano vivo.
Douillet y Langdon (1993) llevan a cabo una serie de experimentos con cultivos axénicos de larvas de ostra C. gigas, alimentados con una dieta monoalgal axénica e inoculados con diferentes bacterias marinas. De todos los aislados ensayados, la mayor parte tienen efecto adverso, neutral o variable, siendo sólo una, la cepa CA2 (Alteromonas sp.), la que muestra un efecto beneficioso y consistente en el crecimiento y la supervivencia larvaria. Como modo de acción general apuntan al aporte de suplementos nutricionales que una dieta monoalgal no es capaz de cubrir, ayudando a la fijación de nitrógeno, o en la digestión y asimilación de la microalga ingerida, gracias a la elevada proporción de cepas productoras de enzimas extracelulares en estos cultivos.
En experimentos posteriores con esta misma cepa en cultivos no axénicos (Douillet y Langdon 1994), encuentran que el efecto varía con la concentración bacteriana suministrada, siendo nociva a concentraciones de 10⁷ células/ml tanto para la supervivencia como para el crecimiento, mientras que valores de 10⁴-10⁶ células/ml no afectan a la supervivencia y mejoran el crecimiento larvario. La concentración óptima, 10⁵ células/ml, estaría dentro del rango normal de los cultivos de larvas de bivalvos, entre 10⁴ y 10⁶ células/ml (Jeanthon et al. 1988). Una vez más, sugieren como modo de acción el aporte de nutrientes esenciales no presentes en las microalgas o de enzimas que faciliten los procesos digestivos. Apuntan además al efecto beneficioso que se observa en el porcentaje de larvas que realizan la metamorfosis a semilla y en el tamaño de esta al cabo de 30 días, aunque no formulan ninguna hipótesis sobre el mecanismo de acción en este caso, pudiendo deberse a un efecto indirecto de los beneficios generales sobre el crecimiento y desarrollo.
Los trabajos más amplios sobre la aplicación de bacterias probióticas en cultivos larvarios de bivalvos son los desarrollados con larvas de Argopecten purpuratus, por el grupo de Riquelme y colaboradores. Abordan sus estudios ensayando los efectos de la cepa INH, Pseudoalteromonas haloplanktis (anteriormente Alteromonas haloplanktis), aislada de gónada de reproductores (Riquelme et al. 1996). En primer lugar, determinan in vitro su amplio espectro de inhibición frente a diferentes especies bacterianas, incluyendo miembros del género Vibrio. El componente(s) con actividad inhibidora, según se desprende de sus experimentos en medio líquido con un Vibrio anguillarumrelated (VAR) y V. alginolyticus, es producido por las células bacterianas vivas y probablemente esté contenido intracelularmente. Se trata de metabolito(s) secundario(s), excretado en la fase estacionaria de crecimiento. La incubación de las larvas en suspensiones de la cepa INH les confiere protección frente a una posterior infección por VAR a concentraciones moderadas (10³ células/ml). Esto apunta a su uso como medida profiláctica, frente a los niveles bajos en que se suelen hallar inicialmente los patógenos oportunistas en los sistemas de acuicultura. En un trabajo posterior utilizan por primera vez el término probiótico (Riquelme et al. 1997). Parten de una colección de 506 aislados relacionados con los cultivos larvarios de A. purpuratus, tanto en laboratorio como en criadero. Por los resultados de los ensayos de actividad antibacteriana en placa frente al patógeno VAR, combinados con experimentos de protección larvaria frente a este mismo patógeno por preincubación en suspensiones del potencial probiótico, seleccionan la cepa 11 (Pseudomonas sp.) como el mejor candidato para su uso en cultivos larvarios. Estudian también la utilización de cultivos microalgales axénicos (Isochrysis galbana) como vía de incorporación al sistema de bacterias con actividad inhibidora (Avendaño y Riquelme 1999). Como resultado de sus experimentos, seleccionan la cepa C33, Vibrio sp., por su capacidad de crecimiento en presencia de productos extracelulares microalgales, su capacidad de inhibición del patógeno VAR en un medio con este tipo de productos como únicos nutrientes, su estimulación del crecimiento del cultivo de fitoplancton, su conservación de la capacidad inhibidora después de múltiples transferencias del cultivo microalgal, y su ingestión eficiente y significativa por las larvas de A. purpuratus al ser inoculada junto con la microalga. Sin embargo, cuando estudian la incorporación del cultivo bacteriano puro, encuentran que no hay siquiera ingestión por parte de las larvas (Riquelme et al. 2000), aunque sí en adultos (Avendaño-Herrera et al. 2001). Analizan también el espectro de actividad antimicrobiana y la producción de sustancias bactericidas de esta cepa C33 (Jorquera et al. 1999). Completan los estudios con trabajos de adición de bacterias productoras de sustancias inhibidoras a cultivos larvarios masivos (Riquelme et al. 2001). Así, inoculan regularmente mezclas de las cepas Vibrio sp. C33, Pseudomonas sp. 11 y Bacillus sp. B2 (esta última sólo en algunos ensayos), resultando que mediante este tratamiento se puede completar la fase larvaria sin adición de antibiótico. Demuestran además que aunque los antibióticos reducen las bacterias totales en el agua, no impiden su proliferación dentro de las larvas, mientras que es posible una modificación de la microbiota asociada a las larvas mediante la incorporación de las bacterias seleccionadas.
El término probiótico lo emplean también Gibson et al. (1998) en su trabajo acerca de la protección ejercida por la cepa A199 (Aeromonas media) sobre larvas de C. gigas frente a la infección por V. tubiashii. La cepa A199 muestra un amplio espectro de inhibición in vitro, incluyendo diferentes patógenos de acuicultura. El acondicionamiento de los cultivos larvarios con la cepa probiótica (10⁴ unidades formadoras de colonia [ufc]/ml) permite la supervivencia de los cultivos inoculados con el patógeno (10², 10³ y 10⁵ ufc/ml). También Nakamura et al. (1999) consiguen la protección de larvas de C. gigas frente a la infección por vibrios, en este caso V. alginolyticus, mediante el inóculo de la cepa S21. Seleccionan esta cepa, aislada de agua de mar, por su capacidad de inhibición en medio sólido de vibrios patógenos (Vibrio sp. ATCC 19107, V. alginolyticus ATCC 19108 y V. tubiashii ATCC 19109). Confirman esta actividad inhibidora mediante cultivos en agua de mar de la cepa S21 y el patógeno V. alginolyticus. Finalmente, demuestran que la inoculación del probiótico (10⁴ y 10⁵ ufc/ml) inmediatamente después del patógeno (10⁵ ufc/ml) reduce las mortalidades larvarias de un 91,6% al 53,1 y 78,0%, respectivamente.
Basándose en los mismos mecanismos de acción, hay otros estudios con larvas de Pecten maximus. Longeon et al. (2004) aíslan una bacteria de origen marino, Pseudoalteromonas sp. X153, con amplio espectro de actividad inhibidora in vitro. Purifican el componente antimicrobiano, P-153, pero la inestabilidad de esta proteína y la dificultad de obtener una cantidad suficiente impiden la realización de ensayos directos con cultivos larvarios. Intentan entonces el uso de la bacteria viva como probiótico. En primer lugar, descartan su toxicidad, a concentraciones de hasta 10⁷ células/ml, en un experimento a corto plazo con larvas de Ruditapes philippinarum. En otro experimento de larga duración, comparan la evolución de cultivos larvarios de P. maximus, bien inoculando la cepa X153, bien añadiendo cloranfenicol o sin aditivo alguno. Los resultados muestran que la supervivencia es mejor en los cultivos inoculados con la bacteria respecto al control, aunque ligeramente peor que con el antibiótico. Sin embargo, la tasa de crecimiento de las larvas inoculadas es menor que en los otros dos casos. También con cultivos larvarios de vieira son los experimentos realizados por Ruiz-Ponte et al. (1999). Una vez más aíslan una bacteria marina, Roseobacter gallaeciensis BS107 (actualmente Phaeobacter gallaeciensis), con capacidad in vitro de inhibición de un amplio número de cepas, incluyendo patógenos de acuicultura como V. pectenicida A496. Los ensayos en medio líquido demuestran, según estos autores, que la cepa BS107 sólo tiene actividad antibacteriana en presencia de otra bacteria, que liberaría una molécula de naturaleza proteica que actuaría como efectora para inducir la actividad antibacteriana de la cepa BS107. Es necesario comentar aquí que estos experimentos se refieren exclusivamente a la actividad del sobrenadante de cultivos puros o mixtos de la cepa BS107 con vibrios patógenos, considerando que la capacidad de inhibición implica obligatoriamente la liberación masiva de un compuesto al medio. Esto conduce a estudios de utilización de una sustancia, más que de aplicación de una bacteria probiótica propiamente dicha. En los experimentos de supervivencia larvaria la adición de células vivas de R. gallaeciensis no sólo no es capaz de reducir las mortalidades por V. pectenicida, sino que muestra peores resultados si se compara con cultivos sin inóculo alguno o con adición de cloranfenicol. Sin embargo, el uso de extractos celulares es tan efectivo, a niveles de supervivencia larvaria, como el tratamiento con cloranfenicol, aunque no confiere protección alguna frente al inóculo de V. pectenicida.
Prado (2006) realiza un estudio integral de la microbiota asociada a criaderos de bivalvos. Siguiendo los mismo pasos que otros trabajos mencionados anteriormente, en primer lugar selecciona la cepa 154 (Phaeobacter gallaeciensis) de entre una amplia colección de aislados de criaderos de bivalvos. Esta cepa es el candidato idóneo para su empleo como probiótico tanto por mostrar la máxima capacidad de inhibición in vitro frente a patógenos conocidos en acuicultura, como por su amplio espectro de actividad. Los resultados de espectro de actividad obtenidos en medio sólido se confirman en agua de mar (Fig. 2), demostrando la inhibición del crecimiento de dos vibrios patógenos de larvas de bivalvos (Prado et al. 2005). En ambos casos se sigue un mismo patrón, es necesario que la cepa 154 se incorpore al sistema previa o simultáneamente a la entrada de los patógenos, no resultando efectiva cuando el patógeno coloniza el medio con anterioridad. Además, con estos experimentos se extrapola la capacidad demostrada anteriormente en medio sólido a aquel medio en que se va a aplicar, el agua de mar. Ensayos in vivo permiten establecer la reducción de las poblaciones de vibrios presentes en el agua de cultivos larvarios de Ostrea edulis, así como en cultivos de fitoplancton utilizados como alimento en criadero (Fig. 3). Además, demuestran la efectividad para reducir las mortalidades causadas por infecciones naturales, tanto en larvas de O. edulis como R. philippinarum, cuando la cepa 154 se inocula en el agua de cultivo antes de que aparezcan los primeros signos de enfermedad. Finalmente, la cepa 154 resulta igualmente eficaz para controlar vibriosis inducidas en laboratorio siempre que se cumpla la condición de su presencia en el sistema simultánea o previamente a la del patógeno, siendo los resultados mejores en este último caso. Todo apunta por tanto a su uso potencial como medida de control, permitiendo su actuación antes de que los patógenos alcancen concentraciones elevadas.
3.4. Fijación larvaria y metamorfosis
Mención aparte merece la fijación, proceso irreversible de adherencia al sustrato con que finaliza la fase larvaria. Es un momento del desarrollo muy delicado, en el que es frecuente que se registren mortalidades importantes. Está seguida por la metamorfosis, con la adquisición de las estructuras adultas y el paso a la vida bentónica.
FIGURA 2. Crecimiento del patógeno V. neptunius 145.98 en monocultivo (control) y en los experimentos con acondicionamiento previo del agua de mar con la cepa 154 (cultivo mixto). Temperatura: (a) 17 ± 1 ºC, (b) 23 ± 1 ºC.
La implicación de bacterias en los procesos de fijación y metamorfosis en invertebrados marinos es sobradamente conocida. En la mayor parte de los casos hay una inducción mediada por películas bacterianas naturales o incluso películas monoespecíficas. Dentro de este campo, y en relación con bivalvos, los estudios más completos comienzan con la publicación de Weiner y Colwell (1982), en la que demuestran que las biopelículas del aislado LST, una bacteria marina pigmentada (Weiner et al. 1985), estimulan la fijación larvaria de C. virginica. La cepa produce además un exopolisacárido hidrosoluble (Abu et al. 1986), Tipo PAVE («polysaccharide adhesive viscous exopolymer »), promotor de la adhesión de microorganismos a superficies (Zobell 1943). La bacteria, inductora de la fijación también en C. gigas, fue descrita como Alteromonas colwelliana (Weiner et al. 1989) y reclasificada posteriormente como Shewanella colwelliana (Coyne et al. 1989). El pigmento es del tipo melanina, producto final de la actividad tirosinasa (intermediada por DOPA). Al hacer crecer las células en glucosa, inhibidora de la actividad tirosinasa, y por tanto de la producción de DOPA y melanina, se inhibe la fijación larvaria. Posteriores trabajos demostraron que la fijación se podía inducir también con el sobrenadante de Sh. colwelliana, u otras bacterias como V. cholerae, tanto salvaje como un mutante pigmentado, V. cholerae HTX (Fitt et al. 1989), apuntando a una sustancia soluble. El comportamiento de fijación se da como respuesta al sobrenadante de cultivos en el final de la fase logarítmica, posteriormente puede verse inhibido por la liberación de compuestos nocivos relacionados con la lisis celular o la formación del pigmento.
FIGURA 3. Reducción de la población de vibrios, estimada por el crecimiento en medio TCBS, de cultivos de mezcla de especies de fitoplancton inoculados con la cepa 154 (izquierda) o sin adición bacteriana (derecha).
Otros trabajos de este grupo demostraron que las biopelículas de Sh. colwelliana inducían también la fijación en larvas de Ostrea edulis, pero no de Pecten maximus, aunque quizá puedan influir las diferentes temperaturas a que se mantienen los cultivos (Tritar et al. 1992). Finalmente, demostraron la efectividad del sobrenadante de Sh. colwelliana para inducir la fijación larvaria en criadero de C. gigas y C. virginica, a gran escala (Walch et al. 1999).
La fijación es muy variable tanto en laboratorio como en criadero (Weiner y Colwell 1982, Weiner et al. 1989). Tritar et al. (1992), en sus ensayos
de la efectividad de biopelículas de un mutante de Sh. colwelliana de elevada producción de melanina, para la inducción de la fijación en O. edulis obtienen resultados muy positivos en un grupo de experimentos, mientras en otra serie de ensayos la fijación en los controles es considerablemente mejor.
Son muchas las variables que pueden afectar al proceso de fijación en un sustrato determinado, desde cambios en las condiciones físicas de las larvas a la propia fisiología bacteriana (Tritar et al. 1992). La producción de un inductor se puede ver alterada también por el medio en que se cultive la bacteria, la cantidad de pigmento liberado y la disponibilidad de oxígeno (Fritt et al. 1989).
Esta variabilidad hace que la inducción de estos procesos y la mejora de los porcentajes de fijación mediante bacterias deba ser tenida en cuenta como un modo de probiosis de especial relevancia en el caso de los cultivos larvarios de bivalvos.
Prado (2006) ensaya el efecto de la cepa Ph. gallaeciensis 154, productora de un pigmento difusible, en la fijación de larvas de O. edulis. En los experimentos de fijación en colectores acondicionados en suspensiones de esta cepa, no hay una mejoría significativa. Sí se observa un favorecimiento de la fijación larvaria con la inoculación directa de la bacteria en el agua de cultivo, siempre que la concentración esté por encima de 105 ufc/ml. Además, los datos obtenidos muestran un aumento de la supervivencia, incluso con aquellas concentraciones de la cepa que no favorecen la fijación.
4. CONSIDERACIONES FINALES
En los criaderos de bivalvos hay una entrada constante de bacterias a través de los diferentes compartimentos (reproductores, agua de cultivo, fitoplancton, larvas y tanques de cultivo), lo que se traduce en múltiples vías de incorporación de potenciales patógenos al sistema.
El medio, es decir, el agua de mar en que se mantienen los cultivos larvarios, condiciona en gran medida su microbiota. Son animales filtradores, con un flujo constante de agua a través de su organismo, lo que dificulta el establecimiento de una población bacteriana en el digestivo. Por ello, la colonización del tracto digestivo de los individuos, uno de los requisitos en la mayor parte de las definiciones de probiótico, no parece un factor importante en el caso de las larvas de bivalvos, ya que además, por esto mismo, los problemas no suelen ir ligados al balance de la microbiota del digestivo. La colonización de los patógenos se puede dar en cualquier parte del organismo, incluyendo la concha, y extenderse fácilmente. Resulta por tanto más aconsejable un control de la microbiota del medio, manteniéndola con una composición beneficiosa para el desarrollo y la supervivencia larvarios, o al menos, impidiendo la proliferación de patógenos oportunistas.
Las bacterias potencialmente perjudiciales se pueden incorporar en cualquier momento al cultivo, pero lo suelen hacer a concentraciones bajas, proliferando sólo en condiciones favorables. La presencia de una bacteria, perteneciente al mismo nicho ecológico y capaz de inhibir la proliferación de estos microorganismos, permite un control de la calidad microbiológica del agua sin intrusión de una especie alóctona. Este mecanismo evita recurrir a los tratamientos con agentes quimioterápicos, eludiendo los riesgos de posibles efectos perjudiciales para las larvas y de aparición de resistencias que se puedan transmitir a otras bacterias, además de no eliminar de forma completa e indiscriminada la carga bacteriana asociada a los cultivos. Hay que tener en cuenta que las infecciones en los cultivos larvarios de bivalvos suelen ser fulminantes, de forma que no permiten un tratamiento «curativo» y mucho menos, la identificación del agente etiológico para seleccionar el antibiótico que permita combatir el brote. Además, las larvas de bivalvos precisan de alguna manera la población bacteriana. Los múltiples mecanismos por los que esta puede ayudar en el desarrollo constituyen la base de los probióticos para estos cultivos, siendo la mejor alternativa en estos momentos.
Es necesario profundizar en los estudios de probiosis en cultivos larvarios de bivalvos, estudiando en todos los casos la interacción de las bacterias con otros organismos vivos presentes (fitoplancton), estableciendo su capacidad para mantenerse en el sistema y la dosis necesaria para su máxima efectividad, así como hallando un método que facilite su conservación, almacenamiento y manipulación en los criaderos. Además del control de la población de potenciales patógenos, no hay que descartar nuevas aproximaciones, buscando beneficios a través de diferentes mecanismos de acción y considerando distintas vías de incorporación de las bacterias al sistema.