5. LA ENFERMEDAD DEL ANILLO MARRÓN
Resumen
La enfermedad del anillo marrón (BRD), considerada como la primera patología de demostrada etiología bacteriana en bivalvos adultos, es uno de los principales factores limitantes del cultivo de almejas en Europa, asociado a graves pérdidas económicas en el sector. La enfermedad se describió por primera vez en Ruditapes philippinarum en 1987, y se caracteriza por la presencia de un depósito orgánico marrón (conchiolina) en la superficie interna de las valvas. El agente etiológico de esta enfermedad, aislado en 1990, se caracterizó como una nueva especie del género Vibrio, a la que se denominó V. tapetis.
Nuestra intención en el presente capítulo es mostrar una visión del conocimiento actual a cerca de este patógeno bacteriano y de la patogénesis de la enfermedad que ocasiona. También se revisan algunas cuestiones importantes relacionadas con la caracterización del patógeno, sus posibles mecanismos de virulencia y su papel en la relación patógeno-hospedador, así como la epidemiología de la enfermedad del anillo marrón. Además, se discuten los nuevos métodos moleculares utilizados en el diagnóstico de la enfermedad y su posible aplicación tanto a la detección como a la clasificación intraespecífica de este patógeno.
1. INTRODUCCIÓN
La mayoría de los estudios relacionados con enfermedades de origen microbiano en moluscos se han centrado en patologías de estadios larvarios, postlarvarios o juveniles de especies de interés comercial, cultivadas en condiciones controladas.
Las descripciones de enfermedades bacterianas en bivalvos adultos son esporádicas y en muchos casos no existen evidencias suficientes que corroboren la etiología de la enfermedad. Sin embargo, se han descrito patologías con carácter epizoótico donde se ha podido demostrar su etiología bacteriana mediante aislamiento del agente patógeno e inducción experimental de la enfermedad. La primera corresponde con episodios de mortalidades masivas de Pinctada maxima en Australia, debidas a Vibrio harveyi (Pass et al. 1987), y la segunda es la nocardiosis de la ostra pacífica en el noroeste de USA y Canadá (Friedman y Hedrick 1991), aunque en estos casos ha quedado demostrado el carácter oportunista del agente causal bacteriano. La enfermedad del anillo marrón (BRD) puede considerarse como la primera enfermedad de etiología bacteriana demostrada en bivalvos adultos.
La enfermedad del anillo marrón apareció por primera vez en el verano de 1987 en los cultivos de almeja japonesa (Ruditapes philippinarum) en la Bretaña francesa, asociada a mortalidades masivas en distintos parques venerícolas de Brouennou (Finisterre, Francia) (Flassch 1987). La enfermedad se caracteriza por la presencia de un depósito orgánico marrón oscuro en la superficie interna de las valvas, generalmente localizado entre la línea paleal y el borde de la concha, y que frecuentemente invade por completo el seno paleal (Fig. 1).
Debido a los signos de la enfermedad, esta patología se denominó «enfermedad del anillo marrón» (Paillard y Maes 1989).
FIGURA 1. Concha de Ruditapes philippinarum afectado por la enfermedad del anillo marrón. En la superficie interna de las valvas aparece el depósito orgánico de color marrón oscuro característico, localizado entre la línea paleal (flechas) y el borde de la concha. X 2.
La enfermedad del anillo marrón puede considerarse como una verdadera epizootía, ya que se han descrito mortalidades superiores al 50% en almejas cultivadas en Brouennou (Paillard et al. 1989), y del 10 al 67% en otras zonas del litoral atlántico francés (Flassch 1989). En años sucesivos, la enfermedad alcanzó zonas de poblaciones naturales de almejas a lo largo de la costa atlántica francesa (Landela, Albers, Bahía de Brest, Golfo de Morbihan, Arcachon, etc.) (Paillard 2004).
En la península Ibérica, esta enfermedad se detectó por primera vez en 1989 en diversos parques venerícolas de la provincia de Cádiz (Castro et al. 1990), y desde entonces la enfermedad ha sido descrita en otras zonas geográficas como Asturias, Cantabria, Galicia y norte de Portugal (Castro et al. 1992; Figueras et al. 1996; Novoa et al. 1998).
La falta de procedimientos legales europeos sobre la exportación de almejas ha hecho que la enfermedad se diseminara a otros países europeos, como Italia, Irlanda y Reino Unido (Paillard et al. 1994; Allam et al. 2000b). Recientemente, se han detectado síntomas de la enfermedad del anillo marrón en almejas japonesas cultivadas en el sur de Corea (Park et al. 2006).
El síntoma típico de la enfermedad del anillo marrón es la formación de un depósito anormal de conchiolina, sintetizado por el borde del manto y no sujeto a procesos de calcificación. A menudo pueden aparecer procesos de reparación de la concha consistentes en la superposición de concreciones calcificadas que cubren el depósito orgánico (Paillard y Maes 1994). Frecuentemente, las almejas afectadas presentan deformaciones en las conchas, lo que reduce su crecimiento (Paillard 1992).
En moluscos bivalvos es frecuente la descripción de malformaciones de las conchas y alteraciones en los procesos de biomineralización, asociados a efectos tóxicos presentes en el medio ambiente, a condiciones de estrés, o a la acción de diferentes agentes biológicos (para más información ver Castro et al. 1997c). La presencia de la enfermedad del anillo marrón en semillas de almeja japonesa observada en diferentes criaderos y su rápida dispersión geográfica a prácticamente todas las zonas venerícolas francesas, llevaron a pensar en la transmisibilidad de esta patología, descartándose un posible origen genético (Flassch 1989). Esta transmisibilidad fue comprobada por Paillard et al. (1989), quienes inocularon diferentes lotes de R. philippinarum, así como de otras especies relacionadas (R. decussatus, Venerupis aurea y Tapes pullastra), con sobrenadantes de homogenizados de almejas afectadas. La frecuencia de aparición de depósitos orgánicos marrones, similares a los observados en la enfermedad natural, en almejas japonesas inoculadas variaba entre un 19,6 y un 44,2%, mientras que el intervalo de incidencia en lotes inoculados con homogenizados de almejas sin síntomas era del 0 al 7,2%. La transmisión de los síntomas a otras especies fue elevada (media del 28,6%), aunque parecía existir una cierta resistencia interespecífica al agente inductor de la patología. Los síntomas de la enfermedad se suprimían completamente al filtrar los sobrenadantes de los homogenizados de almejas afectadas por membranas de 0,2 μm de tamaño de poro. Esta pérdida de infectividad de los sobrenadantes filtrados descartaba el origen vírico de la enfermedad. Desde 1990 se conoce que el anillo marrón está relacionado con la presencia de un agente bacteriano perteneciente al género Vibrio, al que previamente se le denominó Vibrio P1 por Paillard y Maes (1990), y que resultó ser una nueva especie de este género denominada V. tapetis (Borrego et al. 1996a). La inoculación de esta bacteria (con dosis de 10⁷ ufc/animal) en la cavidad paleal de almejas sanas inducía la sintomatología característica en más del 90% de la población inoculada.
La enfermedad del anillo marrón afecta a almejas de los géneros Ruditapes, Tapes y Venerupis, habiéndose detectado en poblaciones naturales y cultivadas de R. philippinarum, R. decussatus, V. aurea y T. rhomboides, donde ha sido posible aislar su agente causal (Paillard 2004). V. tapetis se ha aislado también de berberechos (Cerastoderma edule) sin sintomatología (Maes y Paillard 1992), y más recientemente de peces cultivados, asociándose en algunos casos a vibriosis (Jensen et al. 2003; Reid et al. 2003a).
2. CARACTERIZACIÓN DEL AGENTE ETIOLÓGICO DE LA ENFERMEDAD DEL ANILLO MARRÓN
2.1. Métodos de detección
V. tapetis se ha aislado a partir de agua intervalvar, homogenizados de tejidos y depósito orgánico de diversas especies de almejas que mostraban la sintomatología del anillo marrón, empleando métodos bacteriológicos estándares desarrollados por Maes (1992) y Castro (1994). Estos métodos utilizan el agar marino como medio primario de aislamiento, para posteriormente seleccionar las colonias presuntivas por su capacidad de crecer a 22 ºC y 4 ºC pero no a 30 ºC, y por no producir ácidos a partir de sacarosa ni manitol. No obstante, en algunas zonas geográficas el método bacteriológico estándar fracasa en la detección y aislamiento de V. tapetis a partir de almejas afectadas por la enfermedad del anillo marrón. Castro et al. (1997d; 2002) apuntaban tres razones que podrían explicar este fracaso:
1. Condiciones medioambientales adversas para V. tapetis.
2. Baja sensibilidad del método bacteriológico.
3. Inhibición de V. tapetis por la microbiota competidora presente en las muestras.
En estos casos hay que aplicar otras técnicas de detección, presentando las técnicas inmunológicas y moleculares mayor rapidez y sensibilidad. Castro et al. (1995) desarrollaron una técnica de inmunofluorescencia indirecta con anticuerpos policlonales que permitía la detección del patógeno en el agua intervalval, estimándose una concentración en estas muestras del orden de 10³ células/ml. Posteriormente, Noel et al. (1996) y Castro et al. (1997b) desarrollaron métodos basados en la técnica de ELISA, usando anticuerpos monoclonales y policlonales, respectivamente, para la detección rápida de V. tapetis a partir de fluidos extrapaleales y hemolinfa. No obstante, estos métodos serológicos presentaban límites de detección superiores a 5 X 10⁴ ufc/ml.
Recientemente se han desarrollado distintos métodos moleculares, utilizando la técnica de hibridación en dot-blot o bien basados en la técnica de la PCR, para la identificación rápida y específica de V. tapetis (Paillard et al. 2006; Romalde et al. 2007), que presentan límites de detección de aproximadamente 10² ufc/ml.
2.2. Caracterización de V. tapetis
2.2.1. Características fenotípicas
Mediante examen a microscopía electrónica, las células de V. tapetis muestran una morfología bacilar y curvada típica del género Vibrio, con una longitud entre 1,5-2,5 mm y un grosor de 0,4-0,6 mm. Estas células presentan un único flagelo polar con una longitud de 3,2 mm. En ocasiones, puede observarse que el flagelo está recubierto por una envuelta o vaina que engloba aproximadamente un tercio de la longitud de este.
Las características bioquímicas de las cepas de V. tapetis aisladas en diferentes localizaciones geográficas y épocas indican que todas las cepas constituyen un grupo muy homogéneo. Las características diferenciales son: crecimiento a 4 ºC, incapacidad de crecimiento a 30 ºC y al 6% de NaCl, ausencia de las enzimas arginina dihidrolasa, lisina descarboxilasa y ornitina descarboxilasa, y resultado negativo en las pruebas del Voges-Proskauer y en la fermentación de sacarosa, D-manitol, amigdalina y glicerol (Borrego et al. 1996a).
En cuanto a la utilización de un único sustrato como fuente de carbono y energía, el 90% de las cepas de V. tapetis son capaces de utilizar D-fructosa, D-galactosa, D-glucosa, maltosa, D-manosa, D-psicosa, propionato, succinato, N-acetilglucosamina y Tween-40.
Los primeros estudios de caracterización antigénica de V. tapetis indicaban que todas las cepas presentaban una elevada identidad serológica, sin la existencia de reacciones cruzadas con otras cepas de especies de Vibrio relacionadas (Castro et al. 1992). Así, el análisis electroforético de las proteínas de membrana externa de las cepas de V. tapetis mostró que todas las cepas presentaban un patrón de bandas idéntico, expresando proteínas de masas moleculares comprendidas entre 78 y 15 kDa, con una proteína mayoritaria de 35 kDa de masa molecular estimada. Además, todas las cepas de V. tapetis mostraban un patrón electroforético de lipopolisacáridos muy similar (Castro et al. 1996).
El aislamiento de nuevas cepas con diferentes orígenes ha permitido observar que existe cierta variabilidad antigénica entre aislados de V. tapetis (Luque 1997), pudiendo establecerse la existencia de tres grupos serológicos con cierto valor epidemiológico (Balboa et al. 2006). Así, el serotipo mayoritario incluye, además de la cepa tipo, los aislados obtenidos de R. phillipinarum, V. aurea y C. edule. Un segundo serotipo agrupa cepas gallegas aisladas de R. decussatus, mientras que el tercero incluye únicamente una cepa aislada de fletán (Hippoglosus hippoglossus) en el Reino Unido.
2.2.2. Características genotípicas
La temperatura de fusión o melting (Tm) del ADN genómico de las cepas de V. tapetis oscila entre 70,7 y 72 °C, con un valor medio de 71,4 ± 0,45 °C. El contenido de G+C del ADN de las cepas oscila entre 42,9 y 46,6 mol%, con un valor medio de 44,4 ± 1,03 mol% (Borrego et al. 1996a). Los análisis de hibridación ADN-ADN realizados indican una homología del 100% entre las cepas aisladas en Francia; sin embargo, las cepas procedentes de Galicia mostraban una homología con respecto a la cepa tipo V. tapetis CECT 4600T que variaba entre el 74 y 91% (Luque 1997).
Los análisis de restricción del ADN genómico utilizando electroforesis en campo pulsante y la enzima de restricción no permitían discriminar a las cepas de V. tapetis en 6 tipos, incluyéndose el 96,3% de las cepas en el tipo 1 (Castro et al. 1997a).
Sin embargo, no se ha podido establecer ningún tipo de relación entre los perfiles obtenidos y el origen de los aislados (Romalde et al. 2002).
Las cepas de V. tapetis, independientemente de la endonucleasa de restricción utilizada, pueden separarse en dos grupos o ribotipos en función del patrón de restricción del ADN genómico hibridado con una sonda complementaria a los genes codificadores del ARNr 16S y 23S.
El segundo de estos ribotipos está representado por una única cepa aislada de R. decussatus en Galicia (Castro et al. 1997a; Romalde et al. 2002).
El análisis plasmídico realizado por Castro et al. (1997a) mostró que todas las cepas de V. tapetis presentaban un único plásmido de aproximadamente 74,5 kb. No obstante, una cepa aislada de Galicia no mostraba la presencia de ningún plásmido. Más recientemente, Le Chevallier et al. (2003) han publicado la presencia en cepas de V. tapetis de una dotación de 2 a 4 plásmidos de alta masa molecular, oscilando entre 60 y 100 kb.
Recientemente, Rodriguez et al. (2006), utilizando tres técnicas moleculares basadas en la PCR (ERIC-PCR, REP-PCR y RAPD), han demostrado la existencia de tres grupos genéticos en V. tapetis, fuertemente correlacionados con el hospedador de origen (Fig. 2). El primer grupo de cepas de V. tapetis (aproximadamente el 90% de las cepas analizadas) estaba constituido por cepas aisladas de R. philippinarum, V. aurea y C. edule procedentes de Francia y España. El segundo grupo (aproximadamente 7%) estaba constituido por cepas procedentes de Galicia y que se habían aislado en R. decussatus. Por último, el tercer grupo estaba representado por solo una cepa que procedía de un aislamiento en peces cultivados (H. hippoglossus) en el Reino Unido.
FIGURA 2. Dendrogramas obtenidos mediante análisis UPGMA de los perfiles de RAPD (A) y ERIC-PCR (B) presentados por los aislados de Vibrio tapetis.
FIGURA 3. Electroforesis bidimensional de proteínas de las cepas CECT4600T y 6087 de V. tapetis, aisladas de R. philippinarum (A) y Hippoglosus hippoglossus (B). Aparecen marcadas las proteínas comunes (flechas negras) y especificas (fechas rojas).
Es interesante señalar que estos tres grupos genéticos coinciden con la distribución en serotipos mencionada anteriormente.
Los estudios de secuenciación de genes «housekeeping» como rpoA, atpA o recA entre otros, así como el análisis proteómico de cepas representativas de estos grupos apoyan la existencia de una variabilidad significativa entre aislados (Fig. 3) y sugieren que en un futuro podrían incluso diferenciarse subespecies dentro de la especie V. tapetis (Balboa et al. 2006; 2007).
3. PATOLOGÍA ASOCIADA A LA ENFERMEDAD DEL ANILLO MARRÓN
3.1. Descripción macroscópica
En la enfermedad del anillo marrón es posible diferenciar dos procesos, que generalmente se observan conjuntamente en ejemplares de R. philippinarum afectados por esta epizootía: la formación de un depósito orgánico, no mineralizado, sobre la superficie interna de la concha, y el recubrimiento del depósito por capas calcificadas de neoformación, similares al material que constituye el estrato homogéneo o concha interna (Castro 1994; Paillard y Maes 1994).
El depósito orgánico que constituye el síntoma característico de la enfermedad del anillo marrón presenta un aspecto muy heterogéneo debido, fundamentalmente, a su localización, extensión y grosor. En su forma más aparente, este depósito está constituido por numerosas láminas de naturaleza orgánica (Fig. 4A). Cuando el depósito presenta un grosor menor, éste aparece como una fina película orgánica ligeramente marrón (a veces plegada) adherida al borde interno de la concha, rodeada de pequeñas manchas puntiformes marrones (Figs. 4B,C). Estos puntos marrones constituyen los estadios iniciales de la formación del depósito orgánico, visibles en animales infectados experimentalmente con V. tapetis (Fig. 4D).
Diversas observaciones realizadas en ejemplares de R. philippinarum afectados por el anillo marrón indican que en el curso de la enfermedad puede existir un proceso de reparación de la concha, consistente en un recubrimiento gradual del depósito orgánico no calcificado por capas de material conquiolináceo mineralizado (Fig. 5). Al final de dicho proceso de reparación se restablece la continuidad del estrato interno de la concha, si bien en la mayoría de las almejas con conchas regeneradas éstas presentan ciertas características que permiten diagnosticar que el animal sufrió la enfermedad del anillo marrón. El recubrimiento progresivo del depósito orgánico suele conllevar un engrosamiento anormal de las zonas de la concha afectadas. Además, el relieve del depósito puede persistir en el estrato homogéneo de nueva formación, que frecuentemente presenta crestas o estrías perpendiculares al borde de la concha (Castro 1994; Paillard y Maes 1995b).
Los ejemplares de R. philippinarum afectados por la enfermedad del anillo marrón no presentan daños aparentes (a nivel macroscópico) en su masa corporal, en comparación con almejas sanas. La única característica diferencial detectada es una retracción del manto en las zonas adyacentes al depósito (Castro 1994; Paillard et al. 1994).
En algunas almejas afectadas por esta epizootía se han observado diversas deformidades externas en las conchas, que corresponden a una alteración del crecimiento de estas durante el período de tiempo en que el animal presenta la patología. Estas malformaciones generalmente incluyen la aparición de estrías de crecimiento anormalmente juntas o deformadas, la presencia de conchas «labiadas», la aparición de muescas o aperturas en el margen de la concha, o el
FIGURA 4. Detalle de los depósitos orgánicos en conchas de ejemplares de R. philippinarum afectados por la enfermedad del anillo marrón. Película orgánica adherida al borde interno de la concha (flecha). A, X 12; B, X 5; C, X 25; D, X 56.
FIGURA 5. Proceso de reparación en conchas de almejas japonesas enfermas. Los depósitos aparecen recubiertos por pequeñas concreciones a modo de escamas (A) y detalle (B). Estas concreciones aparecen como cristales calcáreos con patrones concéntricos de crecimiento (flecha) (C). Capa de material calcificado recubriendo el depósito (D). A, X 6; B, X 13; C, X 22; D, X 5.
crecimiento asimétrico de una de las valvas (para una mayor información ver Paillard y Maes 1995b; Castro et al. 1997c).
3.2. Estudios histológicos
El depósito marrón se localiza en el compartimento periférico de la superficie interna de las valvas de R. philippinarum afectadas por esta enfermedad. Este compartimento o cavidad extrapaleal, está constituido por tres elementos que lo delimitan: el borde paleal, el borde de la concha y el periostraco libre, denominado lámina periostracal por Paillard (1992). Estudios a nivel microscópico de animales con conchas descalcificadas han permitido establecer que las alteraciones histológicas típicas de animales enfermos se reducen a los componentes de la cavidad extrapaleal (Paillard 1992; Castro 1994), si bien en algunos casos se ha observado una degeneración en la glándula digestiva, limitada a almejas con depósitos marrones muy desarrollados (Plana y Le Pennec 1991).
La aparición de numerosos hemocitos en el tejido conjuntivo del manto es uno de los síntomas histopatológicos más frecuentemente detectados en animales con depósitos bien desarrollados no recubiertos (Fig. 6C). Estas acumulaciones de hemocitos se concentran en la zona subyacente al epitelio externo y en el conectivo de los lóbulos paleales medio y externo, localizaciones donde es posible detectar el patógeno mediante inmunohistoquímica (Castro 1994). La presencia de infiltraciones hemocitarias se ha descrito con frecuencia en ostras (Crassostrea virginica) afectadas por la denominada «Enfermedad de la ostras juveniles» (JOD), otra enfermedad de la concha similar al anillo marrón de etiología aún desconocida (Bricelj et al. 1992). En estos animales el manto en contacto con los depósitos muestra también otras lesiones, caracterizadas por una degeneración, más o menos severa, de su epitelio externo. Estas lesiones pueden manifestarse como una alteración de la capa epitelial, que presenta una desorganización tanto en la estructuración como en la ordenación de sus células (Paillard 1992; Castro 1994) (Fig. 6).
En algunas muestras también se observan pérdidas parciales del epitelio de los lóbulos paleales externo y medio, pudiendo afectarse las zonas media y superior del surco periostracal. En almejas donde el depósito orgánico compromete el seno paleal, se observan generalmente lesiones similares a las anteriormente descritas en los epitelios, tanto externo como interno, de los sifones (Castro 1994).
La secreción periostracal de almejas enfermas también presenta modificaciones características, que constituyen una cierta desviación de la estructura laminar y ordenada típica del periostraco. Estas modificaciones se detectan en toda su longitud, aunque son más evidentes y constantes en la lámina periostracal (Paillard y Maes 1995a; Castro et al. 1997c) (Fig. 7). En este periostraco libre se observa un incremento del grosor de la capa externa, mientras que la capa de matrices orgánicas conquiliares es muy fina, siendo difícil establecer la existencia de capas media e interna en esta lámina periostracal. Sobre la capa externa del periostraco libre se produce una acumulación de material basófilo, donde es posible diferenciar hemocitos y restos celulares. A microscopía electrónica de barrido puede apreciarse como el periostraco libre (desde la salida del surco periostracal hasta el borde de la concha o la zona de contacto con el depósito orgánico) aparece fuertemente colonizado por bacterias (Figs. 9C-E), identificadas como V. tapetis mediante inmunotinción (Castro et al. 1997c).
FIGURA 6. Secciones histológicas de R. philippinarum afectados por la enfermedad del anillo marrón. Desestructuración de la monocapa epitelial (A). Infiltración hemocitaria (fechas) dentro de la capa epitelial (B). Desestructuración (asterisco) y pérdida (cabeza de flecha) del epitelio externo del manto (C). Salida masiva de hemocitos al espacio extrapaleal (D). DO: depósito orgánico; E: espacio extrapaleal. HE. A y B, X 355; C, X 130; D, X 118.
En las almejas enfermas el periostraco libre no alcanza el borde de crecimiento de la concha, sino que queda relegado a posiciones más internas, estableciendo una continuidad estructural con el depósito orgánico (Fig. 8C). Las distintas capas que forman el depósito son claramente identificables como material periostracal, que se acumula sin sufrir los procesos de organización que dan lugar a la aparición de los distintos estratos de la concha. En algunas zonas es posible observar cómo el periostraco libre, plegándose sobre sí mismo, se deposita sobre el estrato homogéneo de la concha (o sobre la concha de neoformación), constituyendo así el inicio de un depósito orgánico (Figs. 8A,B).
FIGURA 7. Sección transversal del manto de una almeja enferme. Capa interna del periostraco rodeada de material basófilo granular (asteriscos) (A), con poca matriz fibrosa (cabeza de flecha) (B). Capa externa del periostraco condensada (cabeza de flecha), con matrices orgánicas conquiliares (flechas) de pequeño grosor (C). Hemocitos y restos celulares rodeando a la lámina periostracal (flechas) (D). LE: lóbulo externo del manto; LM1: lóbulo medio primario; LM2: lóbulo medo secundario; PL: lámina perisotracal; DO: depósito orgánico. HE. A y B, X 380; C, X 425 (óptica de Nomarski); D, X 280.
El depósito orgánico que constituye el síntoma típico de la enfermedad del anillo marrón aparece, en corte transversal, como una estructura multiestratificada de naturaleza heterogénea, localizada sobre la superficie interna de la concha (Fig. 8D). Esta heterogeneidad viene determinada por la presencia de distintas capas, dispuestas en muchas zonas de manera anárquica, con diversa consistencia y composición. Además, hay que considerar que estos depósitos pueden presentar una estructura muy compleja dependiendo de la presencia y extensión de fenómenos de recuperación. El depósito aparece fuertemente colonizado por bacterias, inmersas en la matriz orgánica del mismo o entre las distintas capas que lo constituyen (Figs. 9A, B).
En las almejas con depósitos recubiertos se observa una normalización de la secreción periostracal, que recupera su estructuración típica (Fig. 8E). Además, generalmente no aparecen lesiones degenerativas en el epitelio
FIGURA 8. Secciones de conchas descalcificadas. El periostraco libre (flecha), se deposita sobre la concha (asterisco), constituyendo el inicio del depósito orgánico (A). Almejas inoculadas con V. tapetis (B). La lámina periostracal (flechas) se deposita sobre el depósito orgánico (C). Estructura multiestratificada del depósito orgánico (asterisco) (D). Material organizado (estrella) del depósito orgánico que lo recubre totalmente (E). Acúmulos de hemocitos (flechas) y restos celulares, que contribuyen a la heterogeneidad de dicho depósito (F). A, Azul alciano (0,3 M de MgCl2), X 140 (óptica de Nomarski); B, D y E, Tricrómico de Mallory, X 260, X 118, X 235, respectivamente; C, Tinción de Weigert-Van Gieson, X 120. F, HE, X 390 (óptica de Nomarski).
externo del manto, aunque se aprecia un mayor número de hemocitos en el conectivo subyacente, en comparación con animales sanos. Entre las capas del depósito orgánico recubierto se observan restos celulares y células similares a hemocitos (Fig. 8F). Estos hechos podrían indicar que el proceso de recuperación de la enfermedad del anillo marrón no sólo supone una regeneración de la superficie interna de la concha, sino también una reparación de los daños tisulares y una restauración de la correcta funcionalidad del manto secretor del periostraco (Castro 1994; Castro et al. 1997c).
4. INTERACCIÓN HOSPEDADOR-PATÓGENO
4.1. Patogenicidad de V. tapetis
Mediante inmunohistoquímica se han detectado células de V. tapetis adheridas al epitelio externo del manto y a la lámina periostracal, así como en forma de acúmulos en el conectivo del borde del manto, espacio extrapaleal y depósito orgánico (Castro et al. 1997c; Allam et al. 2000b). La adhesión del patógeno a la lámina periostracal, y su posterior colonización, parece ser el primer evento en la patogénesis del anillo marrón. El proceso normal de síntesis y deposición de la lámina perisotracal se interrumpe, dando lugar a la acumulación desordenada de material conquiolar que constituye el depósito orgánico.
Posteriormente, la infección bacteriana progresa al epitelio externo del manto, probablemente precedida por la penetración de la bacteria en el espacio extrapaleal, como se ha comprobado a las 24 h de iniciarse los experimentos de infección (Castro et al. 1997c). Esta asociación del patógeno al epitelio del manto sería responsable de los daños observados en el mismo, permitiendo la entrada del patógeno al conectivo expuesto. Esta vía de penetración del patógeno ha sido también propuesta por Allam et al. (2002).
La enfermedad del anillo marrón constituye una epizootía relacionada con episodios de elevada mortalidad en cultivos de R. philippinarum. Sin embargo, las causas de esta mortalidad no se han establecido claramente. Aunque en infecciones experimentales realizadas con dosis muy elevadas del patógeno se ha constatado la aparición de infecciones sistémicas que producen la muerte del hospedador (Allam et al. 2002), en animales enfermos de forma natural, y a pesar de la presencia de depósitos orgánicos de considerable tamaño, no se detectan células del patógeno en tejidos internos (salvo en el conectivo del manto en zonas adyacentes a los depósitos), ni existen evidencias histológicas de daños sistémicos (Paillard 1992; Castro 1994).
Castro (1994) propuso que las alteraciones fisiológicas relacionadas con la formación y presencia de los depósitos orgánicos podrían ocasionar en casos severos el debilitamiento y muerte del animal.
FIGURA 9. Microfotografías electrónicas de barrido de ejemplares de almejas japonesas afectados por la enfermedad del anillo marrón. El depósito orgánico aparece fuertemente colonizado por bacterias (A) y algunas hifas de hongos (B). Colonización bacteriana en la superficie externa del periostraco libre (C, D, E). A, X 2100. B, X 3000. C, X 1025. D, X 2300. E, X 5300.
Este proceso comenzaría con la acumulación de material orgánico en la superficie interna de las valvas, lo que provocaría la imposibilidad del cierre hermético de la concha, facilitando la entrada de diversas partículas del sedimento en la cavidad paleal.
El material presente en la cavidad paleal produciría una agresión mecánica de los filamentos branquiales, a la vez que induciría un incremento en la síntesis y secreción de mucus, con la consiguiente extenuación de las reservas corporales del hospedador. En casos extremos, la contaminación de la cavidad paleal y la deficiencia de oxígeno forzarían al animal a la superficie del sedimento, donde se produciría su muerte. Además, la propia síntesis del depósito orgánico supone una desviación de la energía metabólica del hospedador, que conllevaría un cese del crecimiento y una disminución importante del índice de condición.
Plana et al. (1996) demostraron que los ejemplares de R. philippinarum infectados con V. tapetis sufrían descensos significativos de su índice de condición, lo que sugería que las masivas mortalidades debidas al anillo marrón podrían ser el resultado de una alteración de la actividad metabólica de las almejas.
Aunque los mecanismos de patogenicidad del agente causal de la enfermedad del anillo marrón permanecen completamente sin dilucidar, está claro que los factores de adhesión a células y/o tejidos y la síntesis de agresinas implicadas en la invasión tisular deben ser esenciales como factores de virulencia.
V. tapetis presenta en su superficie moléculas de adhesinas que le permiten la colonización y proliferación en los compartimentos periféricos del hospedador (Paillard y Maes 1995a). Por medio de estas adhesinas (hemaglutininas, pili, flagelos y proteínas de membrana externa), las cepas de V. tapetis muestran una mayor capacidad de adhesión 0a hemocitos y células de manto de almejas que a líneas celulares de peces (López-Cortés et al. 1999b), lo que sugiere la existencia de una especificidad a nivel de hospedador y de tejido.
Borrego et al. (1996b) demostraron que existen diferencias entre las cepas de V. tapetis en su capacidad de síntesis de productos exoenzimáticos (agresinas) responsables de sus factores invasivos. Así, las cepas de V. tapetis eran productoras y secretoras de fosfatasa alcalina, esterasa, esterasa-lipasa, leucína-arilamidasa, alfa-quimiotripsina, fosfatasa ácida, fosfohidrolasa, hemolisinas y N-acetil-ß-glucosaminidasa, pero las más virulentas presentaban además otras actividades exoenzimáticas como lipasa, valina-arialmidasa, cistina-arilamidasa, ß-glucuronidasa, alfa- y ß-glucosidasa, alfa-manosidasa y alfa-fucosidasa.
Las células de V. tapetis producen un efecto citotóxico in vitro sobre hemocitos de almejas, que se pone de manifiesto por la pérdida de los filópodos y el redondeamiento celular (Lane y Birbeck 2000). Choquet et al. (2003), utilizando la técnica de citometría de flujo, han demostrado también una reducción en las propiedades de adhesión de los hemocitos de almejas debidas a un factor citotóxico de V. tapetis, aunque aún no se han identificado ni caracterizado los genes implicados en esta citotoxicidad. Más recientemente, Allam y Ford (2006) han demostrado que tanto las células de V. tapetis como sus productos extracelulares causan daños fisiológicos e inactivación de los hemocitos de R. philippinarum, y en menor medida de otras especies de moluscos que no son afectadas por la enfermedad del anillo marrón. Estos autores proponen la implicación de un factor citotóxico termolábil que inhibiría el citoesqueleto de los hemocitos.
El papel de los plásmidos en los mecanismos de virulencia de cepas patógenas ha sido establecido en algunas especies bacterianas. El hecho de que todas las cepas de V. tapetis posean un plásmido podría indicar una relación con su poder patógeno. Para verificar esta hipótesis se tendrían que realizar experimentos de transferencia del plásmido entre cepas positivas y negativas, junto a experimentos de curación. En nuestro laboratorio se han realizado experimentos de curación utilizando compuestos intercalantes (anaranjado de acridina y bromuro de etidio) o transposones asesinos, pero los ensayos realizados no han tenido éxito (Borrego et al. 1996b). De igual forma, Le Chevallier et al. (2003) tampoco han conseguido cepas de V. tapetis curadas. Esto podría suponer que estos plásmidos de gran tamaño pueden cumplir funciones esenciales para la viabilidad de estas cepas, por lo que su contribución a las funciones del microorganismo hacen imposible el obtener cepas sin el plásmido.
4.2. Mecanismos de defensa del hospedador
En la enfermedad del anillo marrón la infección bacteriana queda restringida al espacio extrapaleal y al borde del manto, no extendiéndose a otros tejidos del hospedador. Además, en la mayoría de las infecciones experimentales donde el patógeno se inyecta en la cavidad paleal las almejas desarrollan síntomas clínicos de BRD pero raramente mueren (Paillard et al. 1994; Castro et al. 1997d; Allam et al. 2002). Esto podría explicarse por la actuación de los mecanismos de defensa presentes en los moluscos adultos. En este sentido, uno de los síntomas más frecuentemente observados en almejas enfermas es la presencia de infiltraciones de hemocitos en el conectivo del manto, en las mismas zonas en las que se detecta el patógeno, así como una movilización de estos hacia el espacio extrapaleal (Oubella et al. 1993; 1994; Castro 1994). Además, Allam y Paillard (1998) demostraron que los fluidos extrapaleales de R. philippinarum presentan altas concentraciones de hemocitos y de factores humorales (similares a la lisozima).
En algunas almejas afectadas por la enfermedad del anillo marrón puede existir un proceso de reparación de la concha, consistente en un recubrimiento gradual del depósito orgánico por capas de material conquiolináceo mineralizado. Esta reparación parece ser un proceso similar al de la formación de «blisters-ampollas», producidos en muchas especies de moluscos en respuesta a la presencia de partículas extrañas (tanto inertes como parásitos pluricelulares) en el espacio extrapaleal (Allam et al. 2000a).
En los moluscos la reacción inflamatoria puede provocar, además de la destrucción o aislamiento del agente patógeno, una reparación completa de los tejidos dañados. Por tanto, el proceso de curación de la enfermedad del anillo marrón implicaría dos mecanismos defensivos: una respuesta inflamatoria, que produciría una eliminación del patógeno y la reparación de los daños del epitelio del manto, y un recubrimiento del depósito orgánico que culminaría con la reparación de la superficie interna de la concha (Castro 1994).
Por otra parte, se ha observado que algunos depósitos de considerable grosor están constituidos por una alternancia de estratos heterogéneos (el depósito propiamente dicho), y por capas de matriz conquiliar de neoformación, lo que se ha interpretado como la existencia de una sucesión temporal de episodios de recuperación y de renovación de los depósitos orgánicos (Castro 1994; Paillard y Maes 1995a; 1995b). Esto podría explicarse por la existencia de episodios de recidivas del patógeno en el animal infectado, coincidentes con ciclos de inmunodepresión causados por extenuación de los mecanismos defensivos, o bien por disminución del estado fisiológico, como consecuencia de mecanismos naturales (por ejemplo, ciclo reproductivo) o agentes estresantes externos (fundamentalmente medioambientales). En este sentido, Reid et al. (2003b) y Paillard et al. (2004) han demostrado que la salinidad y la temperatura afectan significativamente el desarrollo de la enfermedad por influencia sobre los mecanismos de defensa de los bivalvos.
El sistema inmune de los moluscos bivalvos está formado fundamentalmente por hemocitos que desde la hemolinfa son capaces de migrar a los tejidos en respuesta a materiales extraños, incluyendo microorganismos patógenos. La primera estrategia de defensa de los moluscos implica un proceso de fagocitosis y encapsulación del material extraño, liberándose a continuación metabolitos oxidantes y enzimas degradativas, así como la secreción de moléculas citotóxicas y aglutinantes.
El proceso de fagocitosis realizado por los hemocitos de los moluscos bivalvos es esencial para la determinación de la capacidad de defensa del hospedador, ya que este proceso culmina con la eliminación del agente inductor de la respuesta inmune. De acuerdo con López et al. (1997), el proceso de fagocitosis en bivalvos se caracteriza por las siguientes etapas: 1) Activación quimiotáctica de los hemocitos; 2) adhesión de las partículas extrañas a la superficie de los fagocitos; 3) endocitosis de las partículas; y 4) digestión intracelular. Este proceso implica un proceso de migración quimiotáctica de los hemocitos debido a sustancias liberadas por el tejido dañado y/o por los microorganismos invasores.
En el caso de la enfermedad del anillo marrón, López-Cortés et al. (1999a) estudiaron las actividades fagocíticas y de respuesta quimiotáctica de los hemocitos frente a V. tapetis. Los resultados obtenidos por estos autores indicaban que los productos extracelulares de V. tapetis mostraban efectos quimiotácticos para los hemocitos; sin embargo, la fagocitosis era un proceso no específico, que no requería de proteínas solubles de la hemolinfa para el proceso de reconocimiento e internalización del microorganismo. Aunque la viabilidad del patógeno incrementaba la fagocitosis, su virulencia no parecía afectar a este proceso.
De acuerdo con Lane y Birbeck (2000), la especificidad patógenomolusco hospedador puede depender de la afinidad de interacción entre el patógeno y los hemocitos del hospedador. Para explicar la resistencia de R. decussatus a los síntomas de la enfermedad del anillo marrón, Allam et al. (2001) estudiaron los parámetros hemocitarios y el proceso de fagocitosis en esta especie en comparación con R. philippinarum. Estos autores concluyeron que la resistencia a la enfermedad del anillo marrón estaba relacionada con la concentración de los hemocitos granulares y con su actividad fagocítica.
5. PREVENCIÓN Y CONTROL DE LA ENFERMEDAD
El empleo de medidas terapéuticas en parques intermareales de cultivo es impracticable, debido a los elevados costes y a los riesgos ambientales que supondría el uso de cualquier agente quimioterápico en estas condiciones. Por ello, el criterio de prevención constituye en esencia el único mecanismo de control disponible en enfermedades que afectan a cultivos extensivos de moluscos (Alderman 1992). Los datos epizoóticos recogidos en Francia a raíz de la aparición y extensión de la enfermedad del anillo marrón llevaron a las autoridades francesas competentes a proponer diversas medidas zootécnicas tendentes a disminuir la incidencia de esta patología. Entre las medidas recomendadas, similares a las que se han demostrado efectivas en la profilaxis de otras enfermedades de bivalvos como la bonamiasis o la marteliasis en Ostrea edulis, se encontraban, además de un control estricto de los lotes de semillas, la reducción de la carga de siembra en las distintas fases del cultivo de almejas, y la planificación de estas fases con el fin de comenzar el engorde en una época que permitiese completar el crecimiento hasta talla comercial evitando el periodo de máxima incidencia de la enfermedad (Flassch 1987; Flassch y Grizel 1989).
Las características físicas del sedimento, así como los ciclos biogeoquímicos de la materia orgánica en este sustrato, influyen de manera notable sobre la fisiología y, por consiguiente, sobre la patología de las almejas cultivadas (Flassch 1987; Barillari et al. 1990). En este sentido, los estudios realizados en parques intermareales de cultivo localizados en la Bahía de Cádiz permitieron comprobar que en parcelas con sustrato natural tipo fangoso existe una mayor incidencia de anillo marrón y menor supervivencia en comparación con las presentadas por almejas de la misma procedencia sembradas en terrenos transformados con arena gravosa (Muñoz et al. 1993; Castro 1994; Martinez-Manzanares et al. 1998). Estos resultados concuerdan con las observaciones iniciales realizadas en la Bretaña francesa (Paillard 1992).
Otra variable importante en el cultivo de moluscos en zonas intermareales es el índice de cobertura mareal. En la Bahía de Cádiz, Muñoz et al. (1993) obtuvieron menores porcentajes de anillo marrón y de mortalidad en las parcelas con mayores coeficientes de emersión (índice de cobertura 1), si bien en estas zonas las almejas no alcanzaban la talla comercial tras 16 meses de engorde, por lo que estos autores sugerían coberturas mareales entre 0,4 y 0,8 como las más adecuadas para el cultivo de R. philippinarum.
Los estudios epizoóticos realizados en Francia mostraron también la existencia de una relación entre la densidad de cultivo y la incidencia de la enfermedad del anillo marrón (Flassch 1989). Sin embargo, en el litoral suratlántico español no se encontraron diferencias significativas en cuanto a la incidencia de anillo marrón en función de la densidad de siembra, tanto en cultivos intermareales (Muñoz et al. 1993) como en condiciones de preengorde suspendido (Castro 1994), al menos para valores de densidad dentro del rango normalmente utilizado en nuestra área geográfica.
Martinez-Manzanares et al. (1998) realizaron estudios de transmisión de la enfermedad del anillo marrón, concluyendo que la vía más probable de transmisión de su agente etiológico era por contacto directo con almejas infectadas. Maes (1992) apuntó a las heces como posible vehículo de transmisión en el medio.
Se han propuesto algunos tratamientos para el control de la enfermedad del anillo marrón a nivel de semillero, tales como la administración por baño de furazolidona (Noel et al. 1992), flumequina, nitrofurantoína o ácido oxolínico (Martinez-Manzanares et al. 1998), o el incremento de la temperatura por encima de 21 ºC (Paillard 2004), si bien ninguno de estos tratamientos ha sido ensayado a escala productiva.