6. PERKINSOSIS EN MOLUSCOS
Resumen
El género Perkinsus agrupa protozoos parásitos de moluscos marinos. El género está presente en América, África, Europa, Asia y Oceanía y algunas de sus especies ocasionan mortandades masivas. La proliferación del parásito en los tejidos del hospedador supone que un tipo celular, denominado trofozoíto, sufre divisiones binarias sucesivas, permaneciendo unidas las células hijas que se van produciendo hasta que se independizan y constituyen nuevos trofozoítos. Al morir el hospedador, los trofozoítos se transforman en hipnoesporas y éstas, cuando se transfieren al agua de mar, entran en un proceso de zooesporulación conducente a la liberación de zooesporas móviles. Trofozoítos, hipnoesporas y zooesporas son capaces de iniciar una infección en un hospedador sano. La posición taxonómica del género es controvertida aunque actualmente existe consenso en situarlo en los Alveolata, un grupo de protozoos que incluye a Ciliados, Apicomplexa y Dinoflagelados. Se consideran 7 especies válidas dentro del género: P. marinus, P. olseni, P. qugwadi, P. chesapeaki, P. mediterraneus, P. honshuensis y P. beihaiensis. Los métodos de diagnóstico disponibles incluyen técnicas histológicas, incubación de tejidos del hospedador en caldo de tioglicolato y técnicas moleculares para detectar secuencias de ADN (o proteínas) exclusivas del parásito. La dinámica de la perkinsosis está influida por la temperatura y la salinidad del agua, existiendo diferencias en los rangos óptimos de estas variables entre especies del género. La edad del hospedador influye positivamente en la probabilidad de infección. Se han desarrollado protocolos para cultivar in vitro 6 especies del género.
La respuesta inmunitaria ante la infección incluye la fagocitosis o la encapsulación del parásito por hemocitos, depende de la especie hospedadora que la reacción sea una u otra. Otros efectos de la infección sobre el sistema inmune de algunas especies hospedadoras son la disminución de la capacidad fagocítica de los hemocitos, inducción de lectinas específicas, inhibición de especies reactivas de oxígeno, inhibición de la apoptosis de los hemocitos e inducción de un polipéptido tóxico para el parásito. Se han detectado en algunas especies de Perkinsus mecanismos que les permiten proliferar superando al sistema inmunitario del hospedador, como son la actividad antioxidante para enfrentarse a las especies reactivas de oxígeno, liberación de proteasas que degradan los tejidos del hospedador, aunque éste trata de contrarrestarlo con la actividad antiproteasa de su hemolinfa, y rutas metabólicas particulares. Se están caracterizando genes del hospedador cuya expresión está modulada por la infección y genes del parásito implicados en su supervivencia y virulencia.​
​1. INTRODUCCIÓN
La perkinsosis, enfermedad causada por parásitos del género Perkinsus, se detectó por primera vez en el ámbito de las investigaciones iniciadas en 1946 para determinar la causa de mortandades masivas de la ostra Crassotrea virginica en la costa de Louisiana (EE.UU), cuya producción tenía una gran trascendencia socioeconómica. La industria petrolera financió dichas investigaciones pues el sector ostrícola presionaba responsabilizando de la mortalidad de la ostra a las operaciones de extracción de crudo (Ray 1996). La conclusión más relevante fue la detección de un patógeno desconocido, denominado entonces Dermocystidium marinum (Mackin et al. 1950) y actualmente conocido como Perkinsus marinus, como responsable de la mortalidad. Desde entonces, este parásito se ha detectado en ostras C. virginica a lo largo del litoral Atlántico de Norteamérica, desde Maine (EE.UU) (Ford 1996) hasta la península de Yucatán (México) (Gullian-Klanian et al. 2008). Recientemente se ha detectado en el litoral Pacífico de México (Cáceres-Martínez et al. 2008). Desde la primera detección de la perkinsosis hasta la actualidad se han descrito otras especies del género Perkinsus (Tabla 1), constatándose que esta enfermedad afecta a una amplia variedad de moluscos, tanto bivalvos (ostreidos, venéridos, pectínidos, ostras perlíferas, almejas gigantes, ...) como gasterópodos (orejas de mar). Se han detectado casos de perkinsosis en América (Norte y Sur), Europa, Asia, África y Oceanía, aunque en algunos casos no se ha identificado la especie del género Perkinsus en cuestión. Debido a su trascendencia económica, especialmente en los EE.UU, sumado a su amplia distribución geográfica, esta enfermedad ha sido objeto del mayor esfuerzo investigador entre las enfermedades de moluscos de todo el mundo. Varias revisiones minuciosas de la información disponible sobre esta enfermedad han precedido a la presente (Fisher 1996; Villalba et al. 2004; Villalba 2008).
2. CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS Y CICLO DE VIDA
En el ciclo de vida de las especies de Perkinsus se conocen diferentes estadios que corresponden a la proliferación en los tejidos del hospedador y a la etapa de vida libre. En los tejidos del hospedador, el estadio característico se denomina trofozoíto, con forma esférica u ovoide, contiene una vacuola que ocupa gran parte del volumen celular y presenta el núcleo en posición periférica, con nucleolo patente. El rango del tamaño del trofozoíto, en general entre 5 y 15 μm, varía en función de la especie, y en algunas de ellas es frecuente la presencia de una inclusión, denominada vacuoplasto, en la gran vacuola (Fig. 1).
La proliferación del parásito supone que los trofozoítos se multiplican por divisiones binarias sucesivas, de forma que las células hijas resultantes permanecen juntas durante un tiempo, dispuestas en forma de roseta, rodeadas por la pared original de la célula madre (Fig. 2), hasta que finalmente se independizan. Cada célula en división puede producir de 2 a aproximadamente 60 nuevas células. Las células hijas (trofozoítos inmaduros) aumentan progresivamente de tamaño y desarrollan la vacuola característica, convirtiéndose en trofozoítos (Goggin y Lester 1995; Perkins 1996; Blackbourn et al. 1998).
FIG. 1. Trofozoítos de Perkinsus spp. A. Corte histológico de las branquias de una almeja Ruditapes decussatus infectada por trofozoítos de Perkinsus olseni (flechas). B. Corte histológico de la masa visceral de una ostra plana Ostrea edulis mostrando un trofozoito de Perkinsus mediterraneus.
FIG. 2. Proliferación de Perkinsus spp. A. Corte histológico de las branquias de una almeja Ruditapes decussatus mostrando un estado de división de Perkinsus olseni (flecha) que contiene cuatro células. B. Corte histológico de la masa visceral de una ostra americana Crassostrea virginica mostrando diferentes etapas de división (flechas) de Perkinsus marinus C. Corte histológico de la masa visceral de una ostra plana Ostrea edulis mostrando un estado de división (flecha) de Perkinsus mediterraneus.
Una característica propia del género supone que cuando los tejidos del hospedador infectado se incuban en caldo de tioglicolato, en oscuridad y condiciones anaeróbicas, los trofozoítos aumentan su tamaño 2, 3 o más veces y se rodean de una pared gruesa, de naturaleza polisacarídica, lo que constituye el estadio denominado hipnoespora o prezooesporangio (Ray 1952) (Fig. 3). Esta transformación de los trofozoítos en hipnoesporas fue observada en hospedadores moribundos (Ray 1954; Mackin 1962, Perkins 1968; Valiulis y Mackin 1969) aunque esta característica del ciclo de Perkinsus se ha observado en raras ocasiones. Cuando las hipnoesporas se incuban en agua de mar, se desencadena el proceso de zooesporulación, por el que se transforman en zooesporangios en un proceso que culmina con la liberación de zooesporas biflageladas. Las hipnoesporas pueden sobrevivir durante periodos prolongados de condiciones adversas, manteniendo la capacidad de entrar en zooesporulación cuando las condiciones son favorables; por ello se consideran un estadio de resistencia en el ciclo de vida (Casas et al. 2002a), que se origina a partir de los trofozoítos cuando el hospedador muere y que, una vez en contacto con el agua de mar, cuando las condiciones ambientales son favorables entran en zooesporulación (Perkins 1968; Valiulis y Mackin 1969).
FIG. 3. Hipnoesporas de Perkinsus marinus, teñidas con colorante de Lugol, (micrografía derecha). Las hipnoesporas se producen por la transformación de los trofozoítos (micrografía izquierda, flechas) presentes en los tejidos del hospedador, cuando la vianda se incuba en caldo de tioglicolato.
FIG. 4. Progresión del proceso de zooesporulación de Perkinsus olseni. A. Zooesporangio en estado unicelular, mostrando el tubo de descarga (flecha) ligeramente desenfocado. B. Zooesporangio con 2 células. C. Zooesporangio con 4 células. D. Zooesporangio en división, correspondiente a la transición entre 4 y 8 células. E. Zooesporangio con 8 células. F. Zooesporangio con 16 células. G. Zooesporangio que encierra centenares de zooesporas móviles. H. Zooesporas liberadas moviéndose alrededor de un zooesporangio en fase de liberación de zooesporas.
Partiendo de la hipnoespora (prezoosporangio), el proceso de zooesporulación supone una sucesión de divisiones celulares binarias, manteniéndose la integridad de la pared de la hipnospora original a lo largo del proceso. Las células hijas resultantes se diferencian en zooesporas biflageladas. Así, la hipnoespora se convierte en un zooesporangio que alberga centenares de zooesporas «bullendo» en su interior hasta que se liberan al exterior a través de un tubo (a veces dos) de descarga (Perkins y Menzel 1966, 1967; Azevedo 1989; Auzoux-Bordenav e et al. 1995; McLaughlin et al. 2000; Casas et al. 2002a, 2004) (Fig. 4). Las zooesporas móviles, gracias a dos flagelos de inserción lateral, tienen forma elipsoidal, ovoidal o incluso son piriformes (Fig. 5).
Hay descripciones detalladas de la ultraestructura de las zooesporas de varias especies de Perkinsus pues tiene valor taxonómico (Perkins 1968, 1976; Azevedo 1989; McLaughlin et al. 2000; Coss et al. 2001a; Casas et al. 2002a, 2004).
La transmisión de la infección por especies de Perkinsus se produce directamente de molusco a molusco, sin la necesidad de hospedadores intermediarios (Ray 1954; Chu 1996; Goggin y Lester 1995; Blackbourn et al. 1998). ¿Cuál es el estadio que inicia la infección en un hospedador sano? De manera experimental se ha conseguido transmitir la infección utilizando trofozoítos, hipnoesporas, zooesporangios y zooesporas (Goggin et al. 1989; Volety y Chu 1994; Rodríguez et al. 1994; Chu 1996; Bushek et al. 1997; Chintala et al. 2002; Ford et al. 2002; Bushek et al. 2002b). Se ha constatado que, además de las hipnoesporas y zooesporas que se producen tras la muerte del hospedador, los moluscos vivos infectados también liberan células viables del parásito a través de las heces (Bushek et al. 1997; Scanlon et al. 1997; Bushek et al. 2002b) y posiblemente a través de los gonoductos (Moss et al. 2008) o por diapédesis a través del epitelio del manto o branquias. Ragone Calvo et al. (2003) informaron de que en el medio natural las tasas de transmisión máximas de P. marinus se producen cuando la mortalidad de la ostra C. virginica provocada por el parásito alcanza sus valores máximos, aunque la transmisión también se produce cuando la mortalidad es baja o nula, lo que sugiere que la muerte del hospedador no es un requisito indispensable para la transmisión.
FIG. 5. Zooesporas de Perkinsus olseni. A. Micrografía electrónica de transmisión de dos zooesporas in toto; micrografía cedida por el Prof. Carlos Azevedo. B. Corte ultrafino de una zooespora; micrografía electrónica de transmisión cedida por el Prof. Carlos Azevedo. AC: alvéolos corticales; M: mitocondria; N: núcleo; R: rhoptry; T: toxicisto; V: vacuola; VC: vesículas asociadas a cintas.
3. POSICIÓN TAXONÓMICA
La posición taxonómica del género Perkinsus es una cuestión controvertida desde su descubrimiento. Inicialmente a la especie tipo se le denominó Dermocystidium marinum (Mackin et al. 1950), por considerar que se trataba de un hongo. Tras diferentes asignaciones, las similitudes ultraestructurales de la zooespora de este parásito con los Apicomplexa (Perkins 1976), condujeron a crear el género Perkinsus, dentro del filo Apicomplexa (Levine 1978). Los primeros análisis taxonómicos basados en secuencias de ADN de la subunidad pequeña del gen del ARN ribosómico, sugirieron que el género Perkinsus es más cercano a los dinoflagelados que a los Apicomplexa (Fong et al. 1993; Goggin y Barker 1993).
El análisis resultante de la combinación de criterios morfológicos y de secuencias génicas correspondientes a la subunidad pequeña del ARN ribosómico y de la actina, confirmó la proximidad entre dinoflagelados y Perkinsus (Siddall et al. 1997).
En los últimos años se han acumulado evidencias de la existencia de plastos en las células de Perkinsus (Grauvogel et al. 2007; Stelter et al. 2007; Teles-Grilo et al. 2007, Venegas-Calerón et al. 2007, Matsuzaki et al. 2008). Actualmente parece existir consenso en situar al género Perkinsus dentro de los Alveolata, un grupo de protozoos que incluye a Ciliados, Apicomplexa y Dinoflagelados (Kuvardina et al. 2002; Saldarriaga et al. 2003; Cavalier-Smith y Chao 2004). Norén et al. (1999) propusieron la creación del phylum Perkinsozoa que incluiría Perkinsus y otros Alveolados que comparten caracteres con Apicomplexa y Dinoflagelados. Sin embargo, Cavalier-Smith y Chao (2004) propusieron agrupar Apicomplexa y Dinoflagelados junto con otros protozoos evolutivamente muy próximos en el phylum Myzozoa de forma que Perkinsus se incluiría también en dicho phylum como un linaje muy próximo evolutivamente a los Dinoflagelados, pero sin la consideración de Dinoflagelado; según esta clasificación, el género Perkinsus estaría incluido en el orden Perkinsida, clase Perkinsea, Infraphylum Protalveolata, Subphylum Dinozoa, phylum Myzozoa. El phylum Myzozoa junto con el phylum Ciliophora (los ciliados) se incluye dentro del infrareino Alveolata, subreino Biciliata, reino Protozoa (Cavalier-Smith 2004).
4. ESPECIES INCLUIDAS EN EL GÉNERO PERKINSUS
Hasta el momento se han descrito 10 especies del género Perkinsus, de las que 7 se consideran válidas actualmente (Tabla 1). Aunque en los primeros casos se utilizaron criterios morfológicos, de hospedador y geográficos para separar especies dentro del género, con el tiempo han cobrado una importancia prioritaria criterios moleculares, en concreto secuencias de ADN de varios loci. En cuanto a los criterios morfológicos, se han aducido diferencias entre especies en la morfología de la hipnoespora/zooesporangio, tales como el tamaño, la relación entre la longitud del tubo de descarga y el diámetro del zooesporangio, el número de tubos de descarga y la ultraestructura de la pared; en el caso de las zooesporas se han observado diferencias en el tamaño, el ángulo formado entre los dos flagelos en su inserción, la existencia de un cuerpo denso en el corpúsculo basal de los flagelos y la distribución de los alveolos corticales sobre la superficie. Por lo que se refiere al hospedador, hay solapamientos múltiples entre las especies de Perkinsus y los criterios geográficos son poco fiables debido a los numerosos movimientos de moluscos realizados consciente o inconscientemente por el hombre y a los solapamientos múltiples en el rango geográfico entre especies de Perkinsus. El criterio al que se le confiere mayor solvencia para discriminar entre especies del género se basa en las secuencias de ADN de varios loci, en concreto se han usado secuencias correspondientes a varias regiones del gen del ARN ribosómico (la subunidad grande LSU, el espaciador transcrito interno ITS y el espaciador no transcrito NTS dentro del espaciador intergénico IGS) y genes de actina (tipo I y tipo II). El análisis filogenético realizado usando secuencias de la subunidad grande y el espaciador transcrito interno el gen ribosómico y el gen de actina tipo I da soporte a la validez de las 7 especies del género Perkinsus incluidas en la Tabla 1 (Moss et al. 2008).
TABLA 1. Especies válidas del género Perkinsus y sus hospedadores
Tras la especie tipo, P. marinus, detectada en ostras Crassostrea virginica de los EE.UU, un parásito detectado en orejas de mar Haliotis ruber de Australia, fue considerado como una especie nueva, Perkinsus olseni, alegando las diferencias de hospedador y de localización geográfica (Lester y Davis 1981). Azevedo (1989), al describir por primera vez un parásito del género en Europa y en un hospedador nuevo, Ruditapes decussatus, propuso la nueva especie Perkinsus atlanticus. Sin embargo, el análisis posterior de la secuencia del NTS condujo a considerar esta especie como sinónimo de P. olseni (Murrell et al. 2002), con preferencia de uso de la denominación más antigua, P. olseni. En la actualidad el rango geográfico y el de hospedadores conocidos de esta especie son muy amplios (Tabla 1). En 1991 se propuso la especie nueva Perkinsus karlssoni para denominar a un parásito detectado en Argopecten irradians de Canadá (McGladdery et al. 1991), pero posteriormente se negó la validez de esta especie al constatarse que en la descripción se habían mezclado estadios de organismos diferentes (Goggin et al. 1996). Blackbourn et al. (1998) establecieron la especie nueva Perkinsus qugwadi para denominar a un parásito de vieiras Patinopecten yessoensis cultivadas
en Canadá; el análisis histológico y de ultraestructura reveló la existencia en los tejidos del hospedador de estadios equiparables a los trofozoítos, zooesporangios y zooesporas descritos para las especies de Perkinsus. Sin embargo, el que la zooesporulación tenga lugar en los tejidos del hospedador y el que los trofozoítos no aumenten de tamaño en el caldo de tioglicolato son caracteres que alejan a este parásito de las restantes especies de Perkinsus conocidas; además, los análisis filogenéticos que se han realizado con la secuencias del ITS sitúan a P. qugwadi en posición muy divergente con respecto al resto de las especies del género (Casas et al. 2002a; Moss et al. 2008), por lo que este parásito no debería estar incluido en el género Perkinsus.
La especie Perkinsus chesapeaki fue establecida por McLaughlin et al. (2000) para denominar a un parásito de la almeja Mya arenaria detectado en la bahía de Chesapeake (EE.UU), considerando en este caso los análisis de secuencias de ADN del gen del ARN ribosómico (Kotob et al. 1999a, b). Muy poco tiempo después Coss et al. (2001a, b) propusieron la especie nueva Perkinsus andrewsi para referirse a un parásito de la almeja Macoma balthica detectado en la misma región que la especie anterior, pero el análisis de secuencias de ADN de varias regiones del gen del ARN ribosómico (LSU, ITS y NTS) y genes de actina (tipo I y tipo II) llevaron a considerar a P. cheapeaki y P. andrewsi como sinónimas (Burreson et al. 2005), con preferencia de uso de la denominación más antigua, P. chesapeaki. Aunque P. marinus y P. chesapeaki muestran solapamiento en el rango de especies hospedadoras en la bahía de Cheasapeake, la primera de las especies parasita casi exclusivamente ostras mientras que la segunda infecta predominantemente almejas (Reece et al. 2008). Una nueva especie, Perkinsus mediterraneus, se estableció al encontrar un parásito de la ostra Ostrea edulis en las Islas Baleares (Casas et al. 2004). En el litoral Pacífico de Asia se han descrito en los últimos años dos especies nuevas, Perkinsus honshuensis, parásito de la almeja Ruditapes philippinarum detectado en Japón (Dungan y Reece 2006), y Perkinsus beihaiensis, encontrado en ostras Crassostrea hongkongensis de China (Moss et al. 2008). El rango geográfico y el de hospedadores de la mayor parte de las especies mencionadas se han ido ampliando con el tiempo (Tabla 1) y, por otro lado, son muchos los casos en que se han detectado parásitos de tipo Perkinsus en diferentes moluscos de áreas geográficas diversas sin que se haya identificado de qué especie se trataba.
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En el litoral español, se detectó la presencia de organismos de tipo Perkinsus en almejas de diferentes áreas: Galicia (González et al. 1987; Figueras et al. 1992), región suratlántica (Villalba y Nava s 1988; Navas et al. 1992), Cataluña (Sagristà et al. 1992; Santmartí et al. 1995), Asturias (Cigarría et al. 1997), litoral vizcaíno (Dang et al. 2008). Los estudios taxonómicos han permitido identificar Perkinsus olseni en almejas de Galicia (Robledo et al. 2000, Casas et al. 2002a), región suratlántica (de la Herrán et al. 2000) y Cataluña (Elandaloussi et al. 2009) y Perkinsus mediterraneus en ostras de las Islas Baleares (Casas et al. 2004).
5. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO
Los métodos de diagnóstico se pueden distribuir en 3 grupos: (1) visualización del parásito tal como aparece en el hospedador, (2) incubación de tejidos del hospedador en caldo de tioglicolato y (3) aplicación de técnicas moleculares para detectar secuencias de ADN (o proteínas) exclusivas del parásito. El primero de los grupos incluye técnicas estándar dirigidas a la visualización de cualquiera de los estadios conocidos del parásito, como por ejemplo en cortes histológicos del hospedador, muestras de hemolinfa, frotis de tejido, etc… Debido a la dificultad de discriminar especies del género por criterios morfológicos, este grupo de procedimientos no permite la identificación del parásito a nivel específico. No existen signos macroscópicos inequívocamente específicos de la perkinsosis, aunque en las almejas afectadas por perkinsosis intensa es frecuente la presencia de pústulas blanquecinas en la superficie de las branquias o del manto, que se corresponden con focos grandes de hemocitos en torno a acúmulos de parásitos.
5.1. Incubación en caldo de tioglicolato
La incubación de tejidos del hospedador en caldo de tioglicolato es un método de diagnóstico de perkinsosis muy utilizado por su alta sensibilidad y bajo coste. Permite además la cuantificación de la intensidad de infección, pero su especificidad se restringe al nivel de género. El método fue desarrollado por Ray (1952) quien, buscando un procedimiento de cultivo in vitro del parásito, comprobó que al incubar tejidos infectados del hospedador en caldo de tioglicolato las células del parásito aumentaban su tamaño notablemente, superando 40–50 μm de diámetro; además desarrollaban una pared gruesa de naturaleza polisacarídica, por lo que se teñían de forma intensa y rápida con el colorante de Lugol, con lo que su visualización era muy fácil con muy pocos aumentos, en forma de esferas de gran tamaño de color muy oscuro (de azul a negro). A partir de estas observaciones, el método de diagnóstico se fue perfeccionando (Ray 1966). Los detalles del procedimiento pueden encontrarse en Howard et al. (2004). El medio en que se incuban los tejidos se prepara disolviendo caldo de tioglicolato sódico con dextrosa en agua destilada y ajustando la salinidad con cloruro sódico; el medio debe esterilizarse y se complementa con antibióticos. La elección de los órganos de los que tomar una porción para incubar depende de la especie hospedadora; en el caso de las ostras suelen emplearse fragmentos de recto y branquias, mientras que en el caso de las almejas suelen emplearse branquias. La incubación ha de realizarse en tubos cerrados para impedir la renovación de aire y en oscuridad, con una duración de 5 a 7 días a la temperatura del laboratorio. Tras la incubación, los tejidos se depositan sobre un portaobjetos, se cubren con solución de Lugol, se trocean con un escalpelo y, tras colocar el cubreobjetos, se observan con microscopio con bajo aumento. Dado que las células del parásito no se multiplican durante la incubación sino que simplemente aumentan de tamaño, el número de las esferas oscuras (hipnoesporas) presentes en el tejido es un fiel reflejo de la situación previa a la incubación, por lo que este método de diagnóstico puede ser cuantitativo. De hecho Mackin (en Ray, 1954) propuso una escala numérica para estimar la intensidad de infección en cada individuo, basada en el recuento de las hipnoesporas, con las siguientes categorías de intensidad de infección: 0.5 (muy ligera), 1 (ligera), 2 (ligera a moderada), 3 (moderada), 4 (moderada a intensa) y 5 (intensa). Este método de diagnóstico es sencillo y económico, su sensibilidad es mayor que el examen de cortes histológicos (Rodríguez y Nava s 1995; McLaughlin y Faisal 1999; Villalba et al. 2005), pero no permite discriminar entre especies del género Perkinsus. Dado que la distribución del parásito no suele ser homogénea en los diferentes órganos del hospedador (Choi et al. 1989, McLaughlin y Faisal 1999; Oliver et al. 1998), la técnica se adaptó para que, incubando toda la carne del hospedador y, seguidamente, digiriendo los tejidos del hospedador, se pudiesen recoger todas las hipnosporas y realizar un recuento, estimando así la carga total de parásitos en el individuo infectado (Choi et al. 1989; Fisher y Oliver 1996, Almeida et al. 1999). Gauthier y Fisher (1990) adaptaron el método para incubar exclusiva mente una muestra de hemolinfa del molusco como una vía no letal para diagnosticar perkinsosis. Nickens et al. (2002) optimizaron este protocolo, lo que permite recoger un mayor número de hipnoesporas y de mayor tamaño, disminuyendo los residuos tisulares y la viscosidad de la muestra. La mayor sensibilidad del método se consigue cuando se incuba toda la carne del hospedador (Bushek et al. 1994; Rodríguez y Nava s 1995; Villalba et al. 2005). Ellin y Bushek (2006) han propuesto un método para cuantificar estadios planctónicos de Perkinsus spp. en muestras de agua, que combina la filtración de las muestras de agua con la incubación en caldo de tioglicolato, seguida de digestión y tinción con solución de Lugol.​
5.2. Métodos moleculares
La posibilidad de realizar diagnósticos mediante inmunoensayos depende de la disponibilidad de anticuerpos específicos frente a los parásitos. Choi et al. (1991) desarrollaron anticuerpos policlonales frente a hipnoesporas de P. marinus, pero no reconocían otros estadios del parásito. Dungan y Roberson (1993) produjeron anticuerpos monoclonales con la misma limitación; en cambio desarrollaron anticuerpos policlonales que reconocían todos los estadios del parásito, aunque no eran específicos de P. marinus, pues también reaccionaban con células de P. olseni (Maeno et al. 1999), e incluso con varias especies de dinoflagelados (Bushek et al. 2002a). Una prueba diagnóstica basada en anticuerpos policlonales mostró una sensibilidad alta frente a P. marinus, pero su especificidad no se ha examinado con detalle (Ottinger et al. 2001). Montes et al. (2002) produjeron anticuerpos policlonales que reconocían hipnoesporas de P. olseni. En cualquier caso, con el desarrollo de pruebas diagnósticas basadas en el reconocimiento de secuencias de ADN se ha desatendido el desarrollo de inmunoensayos diagnósticos.
A raíz del conocimiento de secuencias de varias regiones del gen del ARN ribosómico del parásito se han desarrollado pruebas diagnósticas basadas en el reconocimiento de tales secuencias. Se han diseñado cebadores para diagnosticar la infección con especificidad para varias especies de Perkinsus mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), como es el caso de P. marinus (Marsh et al. 1995; Robledo et al. 1998) y P. chesapeaki (Coss et al. 2001b) a partir de la secuencia del NTS; P. olseni a partir del ITS (Hamaguchi et al. 1998) y del IGS (de la Herrán et al. 2000; Robledo et al. 2000; Park et al. 2002); P. beihaiensis a partir del ITS (Moss et al. 2008) y Perkinsus sp. de la almeja Mercenaria mercenaria a partir del IGS (Pecher et al. 2008). También se han diseñado cebadores cuya especificidad se limita al nivel de género Perkinsus, a partir de la secuencia del ITS (Casas et al. 2002a) y del IGS (Robledo et al. 2002), que por tanto permiten diagnosticar la perkinsosis sin identificar la especie implicada. Yarnall et al. (2000) fueron pioneros en cuantificar la intensidad de infección por P. marinus mediante PCR; posteriormente se desarrollaron procedimientos para cuantificar mediante rtPCR las infecciones por P. marinus (Audemard et al. 2004; Baird y Roesijadi 2005; Gauthier et al. 2006, Ulrich et al. 2007) o incluso con el uso de cebadores con especificidad a nivel de género (Audemard et al. 2004; Gauthier et al. 2006). Para aumentar la sensibilidad del diagnóstico se han diseñado procedimientos que combinan la PCR con ELISA para la detección de P. marinus y P. olseni; en este caso se utilizan sondas marcadas con digoxigenina que hibridan con la región amplificada por PCR (Elandalloussi et al. 2004). La combinación de PCR con el análisis del polimorfismo de la longitud de los fragmentos producidos por la digestión de los productos de la amplificación mediante endonucleasas de restricción (RFLP) se ha aplicado para distinguir infecciones por diferentes especies de Perkinsus, pues en función de las endonucleasas que se empleen, los patrones de restricción son distintos entre P. marinus y P. chesapeaki (Kotob et al. 1999a) y entre éstas, P. olseni y P. mediterraneus (Abollo et al. 2006). También se han desarrollado procedimientos «multiplex PCR» que permiten diagnosticar la infección por P. marinus conjuntamente con la infección por los protozoos Haplosporidium nelsoni y Haplosporidium costale (Penna et al. 2001, Russell et al. 2004), lo que se justifica porque las tres especies mencionadas coexisten en áreas del litoral de los EE.UU parasitando a la ostra C. virginica. Finalmente, se han desarrollado sondas de ADN que permiten el diagnóstico de la perkinsosis mediante hibridación in situ sobre cortes histológicos, bien con especificidad a nivel de género (Elston et al. 2003) bien específicas para detectar P. olseni (Nava s et al. 2001) y P. beihaiensis (Moss et al. 2008).
La elección de un método de diagnóstico u otro dependerá del ámbito en el que se enmarca la diagnosis, ya se trate de programas de vigilancia en zonas en las que ya se ha detectado la presencia de la enfermedad o en zonas donde no se ha detectado, si se conoce o no la especie o especies presentes en una zona, si se quiere certificar la presencia de la enfermedad en una zona donde no se había detectado previamente o si se quiere certificar su ausencia. La Tabla 2 resume la adecuación de los métodos de diagnóstico de la perkinsosis en función del ámbito en que se enmarca la diagnosis y de criterios de sensibilidad, especificidad, laboriosidad, coste y rapidez del diagnóstico. Las técnicas más usadas en la actualidad son la incubación en caldo de tioglicolato y la PCR. La limitación fundamental de la primera, su especificidad únicamente a nivel de género, puede solventarse si los tejidos con diagnóstico positivo se someten a PCR, lo que es viable con determinadas precauciones (Audemard et al. 2008). Para evitar usos o interpretaciones inadecuados del diagnóstico por PCR es conveniente tener en cuenta que esta técnica lo que detecta es la presencia del ADN del parásito y que, para que un positivo por PCR se considere como prueba de infección en un hospedador concreto, conviene que el método de diagnóstico por PCR se haya validado con otro que permita la visualización del parásito, preferentemente en el área geográfica y en el hospedador en cuestión (Burreson 2008).
6. ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS. DINÁMICA DE LA INFECCIÓN POR PERKINSUS SPP.
6.1. Influencia de factores ambientales
La mayor parte de los estudios sobre aspectos epidemiológicos de la perkinsosis se han centrado sobre P. marinus. La temperatura y la salinidad del agua tienen una influencia determinante en la dinámica de la infección por este parásito en las poblaciones de su hospedador Crassostrea virginica del litoral de los EE.UU (Mackin 1962; Quick y Mackin 1971; Andrews 1988; Crosby y Roberts 1990; Burreson y Ragone Calvo 1996; Soniat 1996). La prevalencia y la intensidad de infección por P. marinus en el medio natural aumentan al aumentar la salinidad. En las bahías afectadas por P. marinus, las zonas estuáricas con salinidades inferiores a 12-15‰ se mantuvieron libres del parásito durante muchos años hasta que, tras una serie de años secos, la salinidad superó dicho límite y el parásito penetró en tales zonas. Una vez establecido en esas zonas, aun cuando la salinidad retornó a valores bajos, el parásito ha persistido incluso tolerando salinidades inferiores a 5‰ durante más de 3 meses, aunque con prevalencias e intensidades mínimas. Cuando la salinidad aumenta, la prevalencia y la intensidad de infección se incrementan.
TABLA 2. Adecuación de los métodos de diagnóstico de perkinsosis en función del ámbito en que se enmarca la diagnosis, sea en programas de vigilancia, diagnosis presuntiva o diagnosis confirmativa. A = es el método recomendado por razones de disponibilidad, utilidad, así como por su especificidad y sensibilidad diagnóstica; B = es un método estándar con buena especificidad y sensibilidad diagnóstica; C = es un método aplicable en algunas situaciones, pero su costo, laboriosidad, sensibilidad u otros factores limitan seriamente su aplicación; D = es un método no recomendable en la actualidad. Tabla subjetiva adaptada y modificada a partir de OIE (2009).
La prevalencia y la intensidad de las infecciones por P. marinus también aumentan con el incremento de la temperatura, de forma que en latitudes intermedias con ciclos anuales de periodos fríos y cálidos hay un patrón estacional de variación de prevalencia e intensidad de infección, mientras que en latitudes más bajas, cálidas durante todo el año, no se ha observado tal patrón estacional en la dinámica de la infección. La dinámica estacional se ha estudiado con detalle en la Bahía de Chesapeake (EE.UU); allí cuando la temperatura sobrepasa los 20º C, hacia el final de la primavera, la infección progresa en las ostras, alcanzándose máximos de intensidad de infección al final del verano y principios de otoño, que es cuando se registra un pico de mortalidad en la población de ostras. Las ostras infectadas muertas son fuentes de hipnoesporas, por lo que el periodo de máxima abundancia de zooesporas libres y, por tanto, de máxima probabilidad de adquirir la infección es el de final de verano y comienzos del otoño.
Con la bajada de la temperatura, las infecciones adquiridas se mantienen a un nivel mínimo de intensidad de infección durante el invierno e inicio de la primavera y es al final de la primavera cuando la infección retoma la progresión. Incluso al inicio de la primavera, cuando la temperatura ya ha entrado en fase de ascenso, se ha constatado que la disminución de la prevalencia e intensidad de perkinsosis continúan disminuyendo (Burreson y Ragone Calvo 1996), lo que se explicaría porque la temperatura es suficientemente alta como para estimular el sistema inmune de la ostra, que elimina parásitos activamente, pero no lo suficientemente alta como para estimular la proliferación del parásito (La Peyre et al. 2008). El número de parásitos que quedan en la ostra hacia el final de la primavera es, por tanto, clave para la intensificación de la infección cuando la temperatura supere el umbral (20º C) de proliferación de P. marinus. Así, los años en que el invierno y, en especial, el inicio de la primavera son menos fríos que de costumbre, las prevalencias e intensidades de infección se intensifican antes y se amplía el periodo de máxima intensidad, con lo que la mortalidad de las ostras en tales años es incluso más dramática. La influencia de la temperatura ha determinado que P. marinus haya colonizado latitudes cada vez más altas muy probablemente como consecuencia de una tendencia de aumento de la temperatura media del invierno ligada al calentamiento global (Ford 1996; Ford y Chintala 2006).
En latitudes bajas como el Golfo de Méjico, en que la variación de la temperatura del agua es moderada, la dinámica de la infección (por tanto el desencadenamiento de brotes epidémicos) está marcada por la salinidad, por lo que hay una alta dependencia de la pluviosidad y por tanto una asociación marcada con el fenómeno climático de la Oscilación del Sur El Niño, que tiene una influencia decisiva sobre el clima de esa zona: durante la fase de «La Niña» la pluviosidad es menor y se favorece la proliferación del parásito (Soniat et al. 2005, 2009).
Sin embargo, en latitudes más altas de la costa atlántica de los EE.UU, la temperatura tiene una influencia más marcada en la dinámica de la infección, por lo que hay una asociación con el fenómeno climático de la Oscilación Noratlántica (Soniat et al. 2009).
En el caso de P. olseni, el estudio de la dinámica de la infección por este parásito en un banco de almejas Ruditapes decussatus de Galicia mostró un patrón anual influido por la temperatura (Villalba et al. 2005). En la primavera, cuando la temperatura supera los 15 ºC la infección progresa registrándose un pico de intensidad; la intensidad se mantiene alta durante el verano, alcanzándose un nuevo pico hacia el final del verano o comienzos del otoño, coincidiendo con valores máximos de tasa de mortalidad de las almejas, cuando la temperatura alcanza máximos anuales (19-21 ºC); con el descenso de la temperatura, hay una regresión de las infecciones, con valores mínimos de prevalencia e intensidad de infección desde el final del otoño al comienzo de la primavera (mínimo anual de 9-10 ºC). Como en el caso ya mencionado de P. marinus, la importancia de los inviernos menos fríos como potenciadores de la proliferación de P. olseni ha sido sugerida por Liang et al. (2008). La influencia de la salinidad en la dinámica de la infección por P. olseni todavía no se ha abordado con rigor mediante estudios de campo. En el caso de la infección de las vieiras Patinopecten yessoensis por P. qugwadi, no se detectó estacionalidad, pero el parásito se mostró patogénico y con capacidad para producir zoosporas a 10 ºC (Bower et al. 1998).
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Estudios realizados en laboratorio han confirmado la influencia de la temperatura y la salinidad del agua en la perkinsosis. Por un lado, mediante infecciones experimentales in vivo se ha demostrado que ambos factores influyen en la infectividad y en la progresión de la infección por P. marinus en la ostra C. virginica (Fisher et al. 1992; Chu y La Peyre 1993 a, b; Chu et al. 1993; Ragone y Burreson 1993; Chu 1996; Chu et al. 1996; Chu y Volety 1997; La Peyre et al. 2003), así como en el caso de la progresión de la infección por P. olseni en la almeja R. philippinarum (Liang et al. 2008). Por otro lado, mediante experimentos in vitro se ha confirmado la influencia de temperatura y salinidad en la actividad celular y viabilidad del parásito, tanto en el caso del proceso de zooesporulación de P. marinus (Chu y Greene 1989) y P. olseni (Auzoux-Bordenav e et al. 1995; Ahn y Kim 2001; Casas et al. 2002a) como en el de los trofozoítos de ambas especies (Burreson et al. 1994a; Dungan y Hamilton 1995; Gauthier y Vasta 1995; O’Farrell et al. 2000, La Peyre et al. 2006; 2008). La comparación de la proliferación in vitro de ambas especies mostró que, si bien en ambas especies la tasa de proliferación fue mayor a 28 ºC que a 15 ºC, la tasa de proliferación de P. marinus fue mayor que la de P. olseni a 28 ºC, mientras que la de P. olseni fue mayor que la de P. marinus a 15 ºC, lo que es coherente con las observaciones de campo referidas arriba. La transcendencia de temperatura y salinidad para la dinámica de la infección no sólo se debe a la influencia de ambos factores ambientales sobre la actividad y viabilidad del parásito sino también a la probada influencia de ambos factores sobre el funcionamiento del sistema inmunitario del hospedador (La Peyre et al. 2008; Chu y La Peyre 1993 a, b; Anderson 1996).
6.2. Influencia de factores estresantes
La progresión de la infección por P. marinus en ostras se acentúa por la degradación de la calidad del agua (contaminación) y destrucción del hábitat (métodos de extracción de ostra agresivos) (Anderson et al. 1996; Chu y Hale 1994). También en el caso de la infección de almejas por P. olseni se ha constatado que en las zonas más afectadas por la actividad humana se favorece el avance de la infección (Leite et al. 2004). La elevada mortalidad de almejas R. decussatus registrada en el Algarve (S. de Portugal) ha sido achacada a la infección por P. olseni (Azevedo 1989), a la contaminación (Bebianno 1995) y a la situación de hipoxia (Sobral y Widdows 1997); probablemente los tres factores contribuyen de forma sinérgica a la mortandad. Anderson et al. (1998) también sugirieron que la contaminación por TBT, la hipoxia y la infección por P. marinus contribuyeron de forma sinérgica a una mortandad de ostras. Hofmann et al. (1995) y Powell et al. (1996) enfatizaron el papel de los factores que determinan el estado nutricional de la ostra (disponibilidad de alimento y factores que influyen en la ingestión de alimento) en la progresión de la infección por P. marinus. La debilidad del hospedador tras la puesta puede facilitar también la progresión de la perkinsosis.
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6.3. Influencia de la edad
La mayor prevalencia de P. marinus en ostras adultas que en juveniles en un mismo área fue explicada por la mayor tasa de filtración y la exposición más prolongada al parásito de las adultas, lo que aumenta la probabilidad de adquirir la infección (Burreson y Ragone Calvo 1996; Soniat 1996; Powell et al. 1996). También se constató la asociación entre la prevalencia y la intensidad de infección por P. olseni y la edad de las almejas R. decussatus de un banco natural, de forma que no se detectó el parásito en almejas menores de un año mientras que todas las mayores de 3 años estaban infectadas (Villalba et al. 2005). Una asociación similar se constató en un estudio sobre almejas R. phillipinarum de Corea, al no detectar ninguna infección en almejas menores de 15 mm y encontrar infectadas casi el 100% de las almejas mayores de 20 mm.
6.4. Modelos predictivos
Se han desarrollado varios modelos que simulan la dinámica de la infección de P. marinus incorporando los factores que la influencian (Hofmann et al. 1995; Powell et al. 1996; Soniat y Kortright 1998; Ragone Calvo et al. 2000). Estos modelos pueden ser herramientas predictivas útiles para gestionar los bancos afectados tratando de minimizar las pérdidas por la enfermedad.
7. CULTIVO IN VITRO DEL PARÁSITO
La disponibilidad de células del parásito que proporcionan los cultivos in vitro ha posibilitado desarrollar experimentación crucial para conocer la biología, fisiología, bioquímica, genética del parásito, sus mecanismos de patogenicidad y comprender la interacción con el hospedador. Una limitación la marca el que la virulencia de las células que proliferan in vitro es menor que la de las aisladas del hospedador (Bushek et al. 1997; Bushek et al. 2002b; Ford et al. 2002). El medio de cultivo JL-ODRP-1 (La Peyre et al. 1993) que se asemeja a la composición del plasma de la ostra, se usó para propagar P. marinus y P. chesapeaki (La Peyre et al. 1993; McLaughlin y Faisal 1998). Con el medio de cultivo JL-ODRP-2, derivado del anterior, se establecieron cultivos de P. olseni (Casas et al. 2002b) y P. mediterraneus (Casas et al. 2008). El medio comercial DME: Ham’s F-12 con varios suplementos nutritivos se usó para cultivar P. marinus (Gauthier y Vasta 1993, 1995; Gauthier et al. 1995), P. chesapeaki (Coss et al. 2001; Burreson et al. 2005), P. olseni (Casas et al. 2002b; Robledo et al. 2002; Dungan et al. 2007), P. honshuensis (Dungan y Reece 2006) y P. beihaiensis (Moss et al. 2008). P. marinus también se ha cultivado en medio Leibowitz’s L-15 con suplementos (Kleinschuster y Swink 1993). La Peyre y Faisal (1996, 1997) formularon medios sin proteínas para cultivos P. marinus con los que estudiar las proteínas liberadas por el parásito al medio. Como fuente de inóculo en los cultivos se han usado diferentes órganos infectados del hospedador, como corazón, ganglio visceral, hemolinfa y branquias, mientras que en otros casos se han utilizado hipnoesporas derivadas de la incubación de tejidos infectados en caldo de tioglicolato. La American Type Culture Collection (ATTC) mantiene cultivos congelados de todas las especies mencionadas que están a disposición de los investigadores.
Dado que un mismo hospedador puede estar infectado por más de una cepa de una especie de Perkinsus o incluso por dos especies diferentes del género (Kotob et al. 1999a, b; Dungan y Reece 2006), la capacidad de producir cultivos clónicos es esencial cuando se requiere que todas las células sean genéticamente idénticas. Se han establecido cultivos clónicos mediante el aislamiento individual de células por diluciones sucesivas, de forma que cada célula aislada origina un clon al proliferar (Gauthier y Vasta 1995). Otro método de clonación conlleva el aislamiento de células individuales por micromanipulación y su mantenimiento sobre una membrana colocada por encima de células que se dividen activamente, de forma que los productos liberados por las células que proliferan se difunden a través de la membrana y estimulan la proliferación de la célula aislada (Bushek et al. 2000). Sea cual sea el método de aislamiento, la adición de factores de crecimiento y hormonas puede estimular la proliferación de las células aisladas y acelerar la obtención de cultivos clónicos (Casas y La Peyre 2009).
8. INTERACCIÓN HOSPEDADOR-PARÁSITO
La observación de cortes histológicos de moluscos afectados por perkinsosis pone de manifiesto, en mayor o menor medida, una respuesta inmunitaria del hospedador frente al parásito que supone la concentración de hemocitos en las áreas en las que el parásito está presente. En el caso de las ostras C. virginica, un porcentaje elevado de las células de P. marinus, tanto aisladas como en división, aparecen fagocitadas en el interior de hemocitos (Fig. 6); sin embargo, las células fagocitadas del parásito en su mayoría no son destruidas sino que se desarrollan y pueden destruir el hemocito (Mackin 1951). Células de P. beihaiensis aisladas y en división sin daño aparente se observaron también fagocitadas por hemocitos en los tejidos de las ostras C. honkongensis y C. ariakensis (Moss et al. 2008). En cambio, es la encapsulación de las células del parásito por parte de hemocitos (Fig. 7), en lugar de la fagocitosis, la reacción predominante en el caso de almejas R. decussatus, R. philippinarum y Mya arenaria (Chagot et al. 1987; Nava s et al. 1992; Montes et al. 1995a; Sagristà et al. 1995; Montes et al. 1996; Ordás et al. 2001; Park y Choi 2001; Choi et al. 2002), orejas de mar Haliotis spp. (Goggin y Letser 1995) y vieiras P. yessoensis (Bower et al. 1998) frente a la especie correspondiente de Perkinsus, llegándose a observar hasta varias decenas de parásitos en un único foco de encapsulación hemocitaria. Aun siendo obvia la respuesta inmunitaria, ésta es ineficaz en muchos casos pues la infección progresa en el hospedador. Esto justifica los numerosos estudios realizados sobre la interacción entre el hospedador y el parásito. La mayor parte de estos estudios se han centrado en el modelo C. virginica-P. marinus, mientras que una fracción pequeña corresponde a la interacción entre almejas y P. olseni (revisado por Soudant et al. 2008).
FIGS. 6 Y 7. Respuesta hemocitaria de ostra y almeja ante Perkinsus spp. Fig. 6. Corte histológico de la masa visceral de una ostra americana Crassostrea virginica mostrando hemocitos (flechas) que han fagocitado Perkinsus marinus. Fig. 7. Corte histológico de la masa visceral de una almeja Ruditapes decussatus mostrando un foco de proliferación de Perkinsus olseni (flechas) rodeado por varias capas de hemocitos (*) y fibras conjuntivas (pares de flechas) correspondientes a una reacción de encapsulación del parásito por parte del hospedador.
8.1. Perkinsosis y el sistema inmunitario del hospedador
Numerosos estudios han evaluado la asociación de la perkinsosis con parámetros inmunitarios del hospedador. Con frecuencia los resultados han sido contradictorios entre estudios, lo que dificulta extraer conclusiones. La complejidad de la interpretación de este tipo de resultados se explica en parte por la notable influencia de factores ambientales sobre los parámetros del sistema inmunitario de los moluscos (Feng y Canzonnier 1970; Steinert y Pickwell 1985; Fisher y Newell 1986; Chu 1988; Fisher y Tamplin 1988; Chu y La Peyre 1993b; Chu 2000; Da Silva et al. 2008a).
8.1.1. Hemograma
Se ha observado que el número de hemocitos en la hemolinfa tiende a aumentar en las ostras infectadas con P. marinus (Anderson et al. 1992, 1995; Chu y La Peyre 1993b; La Peyre et al. 1995a, b), mientras que en almejas infectadas por P. olseni se ha detectado la tendencia contraria (Ordás et al. 2000; Casas 2002). El aumento notable de hemocitos que se infiltran en los tejidos de áreas infectadas podría justificar la disminución de los hemocitos circulantes en la hemolinfa (Casas 2002).
8.1.2. Actividad fagocítica​
Se ha constatado que el porcentaje de células de la hemolinfa que son capaces de fagocitar partículas disminuye tanto en las ostras infectadas por P. marinus (La Peyre et al. 1995b; Goedken et al. 2005) como en las almejas infectadas por P. olseni (Ordás et al. 2000), aunque en otros estudios no se detectó un efecto significativo de P. olseni en las almejas (Hégaret et al. 2007; Da Silva et al. 2008b). Es destacable el que los hemocitos de C. virginica mostrasen una mayor capacidad de fagocitar células de P. marinus que los hemocitos de C. gigas, una ostra más tolerante a la infección (Gauthier y Vasta 2002).
8.1.3. Lectinas
Varios estudios han demostrado que la infección por P. olseni induce la producción de varios tipos de lectinas con distintas especificidades en la almeja R. philippinarum que se han caracterizado de talladamente (Bulgakov et al. 2004; Kim et al. 2006; Kang et al. 2006; Kim et al. 2008 a, b). Estas lectinas tienen especificidad para ligarse a diferentes azúcares de la superficie celular del parásito y juegan un papel fundamental en su reconocimiento como cuerpo extraño frente al que hay que reaccionar. El conjunto de lectinas expresadas frente a la infección por P. olseni es diferente al resultante de la exposición a Vibrio tapetis (bacteria responsable de la enfermedad del anillo marrón en la almeja) (Kang et al. 2006) lo que demuestra especificidad en la respuesta. Kang et al. (2008) comprobaron que una de estas lectinas está asociada a una proteasa que, a su vez, podría jugar un papel en la defensa frente al parásito. En el caso de la ostra C. virginica, (Gauthier et al. 2004) comprobaron la presencia en la superficie celular de P. marinus de azúcares a los que se ligan lectinas que habían sido previamente caracterizadas en la ostra (Vasta et al. 1982; Vasta et al. 1984), lo que sugería la implicación de las lectinas en el reconocimiento del parásito. Tasumi y Vasta (2007) demostraron que la infección por P. marinus induce la movilización de una lectina hacia la superficie de los hemocitos de C. virginica, facilitando el reconocimiento del parásito y promoviendo su fagocitosis.
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8.1.4. Producción de especies reactivas de oxígeno
El proceso de producción de especies reactivas de oxígeno (radicales tóxicos), que está asociado a la fagocitosis de patógenos por los hemocitos y que contribuye a la degradación de los patógenos fagocitados, se inhibe cuando los hemocitos de C. virginica se enfrentan a células vivas de P. marinus (La Peyre et al. 1995c; Volety y Chu 1995; Anderson 1999a, b; Schott et al. 2003a). Esta inhibición permite que el parásito se mantenga vivo dentro de los hemocitos de la ostra. En cambio, no se ha encontrado un efecto significativo de P. olseni en la producción de especies reactivas de oxígeno por los hemocitos de la almeja R. philippinarum (Hégaret et al. 2007; Da Silva et al. 2008b).
8.1.5. Producción de óxido nítrico
Villamil et al. (2007) constataron que P. marinus induce un aumento en la producción de óxido nítrico por los hemocitos de C. virginica; la producción de óxido nítrico está asociada a la fagocitosis de patógenos por los hemocitos, contribuyendo a la degradación de los patógenos fagocitados. Los autores sugirieron que el óxido nítrico contribuye a destruir P. marinus en las primeras etapas de infección, aunque de algún modo el parásito supera esa fase y la infección progresa. Constataron que aunque el óxido nítrico inhibe parcialmente la proliferación in vitro del parásito, éste muestra cierta resistencia, si bien los mecanismos de resistencia de P. marinus al óxido nítrico no se conocen.
8.1.6. Apoptosis
La apoptosis o muerte celular programada, es un recurso que los organismos pueden utilizar para impedir la proliferación de patógenos intracelulares pues, a diferencia de lo que ocurre con la necrosis, las células al morir no liberan el patógeno, tratando de evitar su proliferación. P. marinus parece que inhibe la apoptosis de los hemocitos de C. virginica, lo que facilita su proliferación (Sunila y La Banca 2003): En cambio, no se ha encontrado un efecto significativo de P. olseni sobre la apoptosis de hemocitos de la almeja R. philippinarum (Hégaret et al. 2007; Da Silva et al. 2008b).​
8.1.7. Polipéptido anti-Perkinsus
En la respuesta inflamatoria de las almejas R. philippinarum y R. decussatus frente a P. olseni, cuando los hemocitos se disponen rodeando al parásito, los granulocitos se diferencian en granulocitos secretores que sintetizan un polipéptido ligeramente glucosilado, con un peso molecular de 225 kDa. Este polipéptido (p225) se almacena en gránulos y es liberado acumulándose y formando una cápsula en torno al parásito (Montes et al. 1995a, 1996). El polipéptido no se sintetiza en almejas no infectadas o bien expuestas a otros microorganismos como algas o bacterias (Montes et al. 1995b, 1996, 1997), por lo que se puede considerar una respuesta específica a la infección por P. olseni. No se conoce con exactitud la eficacia con que las células del parásito son eliminadas por este proceso, pero de esta forma podría evitarse la diseminación del parásito a través del sistema circulatorio. No obstante, la acumulación de hemocitos a veces es tan intensa que podría llegar a obliterar los senos sanguíneos con consecuencias fatales (Montes et al. 1995a).
8.1.8. Actividad citocida en el plasma
Se comprobó que la actividad anti-P. marinus presente en el plasma de la hemolinfa fue muy superior en moluscos resistentes a la perkinsosis que en C. virginica (Anderson y Beaven 2001b); los autores sugirieron que esta actividad sería dependiente (al menos en parte) de moléculas diferentes a la lisozima o péptidos antimicrobianos. Gauthier y Vasta (2002) también constataron que el plasma de especies de bivalvos poco o nada susceptibles a la perkinsosis inhibe la proliferación in vitro de P. marinus de forma mucho más efectiva que el de C. virginica.
8.1.9. Lisozima
Las lisozimas son enzimas con actividad antibacteriana, aunque también se les ha conferido actividad antifúngica y antiprotozoaria. En los bivalvos está presente en muchos órganos, hemocitos circulantes y plasma de la hemolinfa (Itoh et al. 2007). No se ha encontrado información sobre si la lisozima tiene efecto en parásitos del género Perkinsus. El efecto de la perkinsosis en los niveles de lisozima del plasma del hospedador es controvertido, pues en algunos estudios no se encontró efecto significativo en el caso de C. virginica y P. marinus (Chu y La Peyre 1989, 1993 a, b; Chu et al. 1993) ni tampoco en el caso de P. olseni-R. decussatus (Ordás et al. 2000; Casas 2002), mientras que La Peyre et al. (1995b) detectaron una ligera disminución de la concentración de lisozima en el suero de C. virginica infectada por P. marinus y Chu y La Peyre (1993b) observaron un incremento.
8.1.10. Fenoloxidasa
La fenoloxidasa es una enzima cuya implicación en las reacciones de defensa de los artrópodos frente a patógenos se conoce desde hace tiempo, así como los mecanismos a través de los que actúa. Sin embargo, apenas se conocen los mecanismos por los que esta enzima está implicada en el sistema inmunitario de los moluscos bivalvos, si bien los estudios realizados sobre la relación entre esta enzima y la parasitación de la ostra australiana Saccostrea glomerata por el protozoo Marteilia sydneyi (enfermedad QX) sugieren un papel crucial de la fenoloxidasa en la tolerancia a dicha enfermedad (Newton et al. 2004, Butt y Raftos 2007; 2008). Se desconoce si la fenoloxidasa juega un papel importante en la reacción frente a la perkinsosis; por un lado se comprobó que P. marinus inhibía in vitro la actividad fenoloxidasa de la hemolinfa de ostras C. virginica (Jordan y Deaton 2005), mientras que se registraron niveles más altos de esta enzima en los hemocitos y plasma de almejas R. decussatus con infecciones ligeras y moderadas por P. olseni que en las almejas no infectadas Muñoz et al. 2006).
8.1.11. Actividad antiproteasa en el plasma
Como se comenta más abajo, la liberación de proteasas es uno de los factores de virulencia de Perkinsus. Se ha demostrado la existencia de actividad inhibitoria de las proteasas liberadas por el parásito en el plasma de la ostras C. virginica infectadas por P. marinus (Faisal et al. 1998; Oliver et al. 1999), existiendo una correlación negativa entre la actividad inhibitoria de las proteasas del parásito y la intensidad de infección (Oliver et al. 2000). La ostra C. gigas que es menos susceptible a P. marinus, muestra actividad antiproteasa en el plasma significativamente más alta que C. virginica (Faisal et al. 1999b). Xue et al. (2006) han purificado del plasma de C. virginica y caracterizado una proteína inhibidora de proteasas, a la que han denominado cvSI-1; esta proteína inhibe la perkinsina, que es la proteasa mayoritaria liberada por P. marinus, y la subtilisina, proteasa producida por Bacillus licheniformi, entre otras proteasas serínicas.
8.1.12. Genes implicados en la respuesta inmunitaria
Un planteamiento cada vez más utilizado para obtener una visión amplia de la respuesta inmune de moluscos bivalvos frente a infecciones es el análisis de los genes cuya expresión se inhibe o se potencia ante la infección. Mediante hibridación sustractiva sorpresiva se han identificado genes cuya expresión está regulada (inhibida o potenciada) en C. virginica y C. gigas frente a la infección por P. marinus (Tanguy et al. 2004), en R. philippinarum frente a la infección por P. olseni (Kang et al. 2006) y en R. decussatus frente a P. olseni (Prado Álvarez et al. 2009). El número de secuencias de genes conocidas, bien completas o incompletas, pertenecientes a bivalvos susceptibles a la perkinsosis está creciendo en los últimos años; la disponibilidad de secuencias de genes permite evaluar, mediante la técnica de rtPCR, en qué medida su expresión está influenciada por la perkinsosis. La identificación de genes implicados en la respuesta a la perkinsosis podría permitir usar genes marcadores de tolerancia/resistencia en programas de selección genética para obtener estirpes tolerantes o resistentes a la enfermedad. Mediante una estrategia diferente, usando marcadores neutros (AFLP) y comparando el genoma de dos familias de C. virginica antes y después de que P. marinus ocasionase mortandad, Yu y Guo (2006) han identificado en el genoma de la ostra una serie de loci asociados muy probablemente a la tolerancia a la infección por P. marinus.
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8.2. Supervivencia del parásito en el hospedador y factores de virulencia
El parásito cuenta con mecanismos que le permiten sobrevivir y proliferar dentro del hospedador a pesar de que el hospedador trata de impedirlo mediante el sistema inmunitario.
8.2.1. Actividad antioxidante
Como se ha comentado arriba, la producción de especies reactivas de oxígeno asociada a la fagocitosis se inhibe cuando los hemocitos de C. virginica se enfrentan a P. marinus. Además, se comprobó que P. marinus tolera la exposición in vitro a especies reactivas de oxígeno, en concreto el ion superóxido y el peróxido de hidrógeno (Schott et al. 2003a). Todo ello sugiere que el parásito ha desarrollado mecanismos para evitar el daño oxidativo mediante la anulación de la síntesis y/o la eliminación de los radicales tóxicos (detoxificación). Volety y Chu (1997) detectaron niveles altos de fosfatasa ácida en los productos extracelulares de P. marinus; esta enzima podría actuar desfosforilando enzimas como la NADPH oxidasa, bloqueando así la cascada de producción de especies reactivas de oxígeno. Una de las rutas de detoxificación de P. marinus conlleva la dismutación del ion superóxido a oxígeno molecular y peróxido de hidrógeno mediante la superóxido dismutasa; se han purificado y caracterizado dos superóxido dismutasas con hierro como cofactor de P. marinus (Ahmed et al. 2003; Asojo et al. 2006), sus genes se han identificado y caracterizado (Wright et al. 2002; Schott y Vasta 2003; Schott et al. 2003b) y se ha determinado su localización subcelular (Schott y Vasta 2003; Fernández-Robledo et al. 2008a). Por otro lado, se ha demostrado la actividad peroxidasa dependiente de ascorbato en P. marinus; esta enzima podría eliminar el peróxido de hidrógeno (Schott et al. 2003a).
8.2.2. Secreción de proteasas
Tan pronto como se pudo contar con cultivos in vitro del parásito, los productos liberados por las células cultivadas fueron objeto de estudio. Aunque se han detectado múltiples actividades líticas en los productos extracelulares (Casas et al. 2002c), los estudios se han enfocado mayoritariamente sobre la actividad proteolítica detectada, con capacidad para degradar proteínas del hospedador (La Peyre et al. 1995c; Faisal et al. 1999a), lo que favorece la invasión y propagación por los tejidos del hospedador y puede facilitar la disponibilidad de nutrientes (La Peyre et al. 1996). Se constató que las proteasas liberadas in vitro por P. marinus inhibían funciones inmunitarias de C. virginica, como la movilidad de los hemocitos, la actividad lisozima, la aglutinación (Garreis et al. 1996), y la actividad vibriocida de los hemocitos (Tall et al. 1999). Tanto la progresión de la infección in vivo como la proliferación in vitro de P. marinus se ven inhibidas por la bacitracina (un inhibidor de proteasas), lo que apoya la consideración de las proteasas de P. marinus como factor de virulencia (Faisal et al. 1999b). El análisis de las proteasas liberadas in vitro por P. marinus mostró que pertenecen a la clase de proteasas serínicas del tipo quimotripsina, confiriendo el nombre de perkinsina a la más abundante (Faisal et al. 1999a). Brown y Reece (2003) identificaron un gen en el genoma de P. marinus correspondiente a una proteasa cuya secuencia es muy próxima a la de la familia de proteasas serínicas del tipo subtilisina. No se conoce apenas la actividad enzimática de los productos extracelulares de otras especies de Perkinsus. En el caso de P. olseni no se detectó actividad proteasa de tipo tripsina o quimotripsina, aunque sí se detectaron otras actividades líticas de tipo esterasa, glucosidasa y fosfatasa (Casas et al. 2002c). Tampoco se detectó actividad proteolítica en el caso de P. chesapeaki (McLaughlin et al. 2000). Perkinsus mediterraneus es la única especie en la que se han detectado proteasas además de en P. marinus (Casas et al. 2008).
8.2.3. Aspectos del metabolismo
En los últimos años se han desarrollado estudios sobre el metabolismo de algunas especies de Perkinsus para entender cómo sobrevive el parásito en el hospedador, su patogenicidad y, en otros casos, buscando vías para atacar al parásito mediante medidas terapéuticas. P. marinus tiene capacidad para sintetizar fosfolípidos y adquirir y metabolizar lípidos del hospedador (Chu et al. 2000, Lund y Chu 2002; Chu et al. 2003). A diferencia de otros protozoos parásitos, P. marinus sintetiza un amplio rango de ácidos grasos poliinsaturados (Soudant y Chu 2001, Chu et al. 2002) incluido el ácido araquidónico; este último lo sintetiza a través de una vía inusual (Chu et al. 2004; Venegas-Calerón et al. 2007). P. marinus utiliza probablemente la ruta de la ácido graso sintetasa tipo II para sintetizar ácidos grasos (Lund et al. 2005), mientras que no es capaz de sintetizar esteroles y ha de tomarlos del hospedador (Lund et al. 2007). No se ha investigado si, como ocurre en otros protozoos parásitos, algunos metabolitos asociados a estas rutas tienen implicaciones en la virulencia de P. marinus. Este parásito sintetiza isoprenoides a través de la ruta independiente del mevalonato (Stelter et al. 2007). Las rutas del shikimato y del folato que están implicadas en la síntesis de vitamina B9, una coenzima para la síntesis de DNA/RNA, se han identificado en P. olseni (Elandalloussi et al. 2005). Leite et al. (2008) han caracterizado los genes de prolil hidroxilasas implicadas en la tolerancia a la hipoxia presentes en el genoma de P. olseni, comprobando que su expresión se incrementa de forma considerable en presencia de la hemolinfa del hospedador R. decussatus, lo que sugiere la implicación de las prolil hidroxilasas asociadas a la tolerancia a la hipoxia en los mecanismos de infección.
8.2.4. Genes del parásito implicados en virulencia
Hay en marcha un proyecto de secuenciación del genoma de P. marinus, desarrollado conjuntamente por el J Craig Venter Institute y el Center for Marine Biotechnology de la Universidad de Maryland (EE.UU). Parte de la información generada se puede consultar en la dirección web http://www.tigr.org/tdb/e2k1/pmg/. En cualquier caso ya se han dado pasos en la caracterización de genes del parásito implicados en virulencia y supervivencia, como es el caso de los genes de superóxido dismutasas (Wright et al. 2002; Schott y Vasta, 2003; Schott et al. 2003b) y proteasas (Brown y Reece 2003) de P. marinus y prolil hidroxilasas asociadas a la tolerancia a hipoxia de P. olseni (Leite et al. 2008). Se han identificado una serie de genes de P. olseni cuya expresión se potencia con el enfrentamiento del parásito a la hemolinfa de la almeja R. decussatus (Ascenso et al. 2007). La expresión de genes de P. olseni frente a la hemolinfa de bivalvos susceptibles y no susceptibles se ha estudiado mediante un macroarray (Ascenso et al. 2009). Por otro lado, se ha puesto a punto un procedimiento de transfección de genes para P. marinus que facilitará el estudio de la regulación y expresión de genes (Fernández-Robledo et al. 2008b).
8.3. Efectos de la enfermedad en la fisiología del hospedador
Los estudios sobre los efectos de la perkinsosis en la fisiología del hospedador se restringen a P. marinus y, en menor medida, P. olseni. Por lo que se refiere a la fisiología energética del hospedador, Choi et al. (1989) concluyeron que en ostras C. virginica de tamaño grande con infecciones intensas por P. marinus, el enorme número de parásitos consumen más energía de la que la ostra necesita para satisfacer su propia demanda del metabolismo basal, por lo que el balance energético es negativo para el hospedador. Sin embargo, en ostras jóvenes, de menor tamaño, la respiración consume una fracción más pequeña del suministro energético, de forma que el impacto neto de P. marinus en el balance energético de la ostra es menor. Usando las mismas estimaciones del consumo energético del parasito que Choi et al. (1989), Casas (2002) concluyó que, de acuerdo con el número de células de P. olseni presentes en los tejidos de almejas R. decussatus con infecciones intensas, el consumo energético del parásito sobrepasa la energía necesaria para mantener el metabolismo basal del hospedador, lo que se agudiza en condiciones de temperatura elevada y escasez de alimento, frecuentes en verano, que es cuando se intensifican las infecciones. No se ha detectado ningún efecto significativo de P. marinus en la tasa de aclaramiento, eficiencia de absorción y consumo de oxígeno de C. virginica (Newell et al. 1994; Paynter 1996; Willson y Burnett 2000), mientras que la tasa de aclaramiento tiende a disminuir y a aumentar el consumo de oxígeno en almejas R. decussatus con infecciones intensas por P. olseni, sin que se hayan detectado efectos en la eficiencia de absorción (Casas 2002). El desequilibrio energético ocasionado por la perkinsosis intensa ha de contribuir a la reducción del crecimiento detectada en ostras C. virginica infectadas por P. marinus (Andrews 1961) y a la pérdida de condición observada en C. virginica (Andrews 1961; Craig et al., 1989; Crosby y Roberts 1990; Paynter y Burresson 1991; Dittman et al. 2001) y en almejas R. decussatus (Casas 2002; Leite et al. 2004) infectadas por P. marinus y P. olseni respectivamente.
Otra de las disfunciones causadas por la perkinsosis avanzada afecta a la gametogénesis, con lo que se reduce el potencial reproductivo de C. virginica (Kennedy et al. 1995; Dittman et al. 2001), R. decussatus (Casas 2002) y R. philippinarum (Park et al. 2006a). Un efecto más de la perkinsosis P. olseni es la disminución de la capacidad defensiva del hospedador frente a otros patógenos; así Montes et al. (2001) detectaron que P. olseni favorece el desarrollo de infecciones oportunistas por virus y bacterias en la almeja R. philippinarum. También se ha detectado que los efectos de modulación del sistema inmunitario de R. philippinarum producido por algas tóxicas se intensifican por infecciones avanzadas de P. olseni (Hégaret et al. 2009).