8. ENFERMEDADES CAUSADAS POR PARÁSITOS DEL GRUPO HAPLOSPORIDIA
Resumen
Los protozoos del filo Haplosporidia son parásitos obligados o hiperparásitos de una amplia variedad de hospedadores invertebrados. Actualmente, se aceptan como válidos 4 géneros dentro del grupo: Haplosporidium, Urosporidium, Minchinia y Bonamia. En general, los haplosporidios se caracterizan por presentar dos estadíos dentro de los hospedadores: un estadío de plasmodio, que se multiplica por plasmotomía, y un estadío de espora, probablemente de resistencia; no obstante en tres especies del género Bonamia, B. ostreae, B. exitiosa y B. roughleyi, nunca se han observado esporas y los plasmodios son poco frecuentes, siendo su estadio más frecuente el de microcélulas uninucleadas que al dividirse generan dos células hijas. Este capítulo aborda más detalladamente la revisión de las tres especies parásitas de mayor relevancia, debido a las importantes mortandades y pérdidas económicas que ocasionan al sector marisquero en todo el mundo: Haplosporidium nelsoni, Bonamia ostreae y Bonamia exitiosa. H. nelsoni es causante de mortandades masivas de la ostra Crassotrea virginica de la costa atlántica de los EE.UU; además se ha detectado en ostras Crassostrea gigas en EE.UU, Corea, Japón y Francia. A B. ostreae se le responsabiliza de mortalidades muy altas de la ostra plana Ostrea edulis en la costa atlántica Europea y en el litoral pacífico y atlántico de los EE.UU; también se ha detectado en Canadá y en Marruecos. B. exitiosa ha causado mortandades masivas de la ostra Ostrea chilensis en Nueva Zelanda y también se ha detectado su presencia en ostras Ostrea angasi de Australia y O. edulis de España.
La dinámica de la enfermedad causada por H. nelsoni está muy influida por la temperatura y la salinidad, lo que determina una marcada estacionalidad de la adquisición de nuevas infecciones, intensificación de la enfermedad y mortalidad de las ostras; en el caso de la bonamiosis, las infecciones nuevas pueden adquirirse en cualquier mes del año y se hacen más intensas en los meses cálidos. El diagnóstico se ha basado tradicionalmente en el examen de cortes histológicos. Con el reciente desarrollo de las herramientas moleculares, basadas en la PCR y en sondas de ADN, se ha logrado mejorar la especificidad y rapidez de las identificaciones de estas especies patógenas, pero también se han abierto nuevos campos que están permitiendo ampliar el conocimiento de aspectos tan diversos de la biología de estos parásitos como son su distribución geográfica, rango hospedador, epidemiología, ciclo de vida o formas de transmisión.​​
1. INTRODUCCIÓN
Desde el descubrimiento de las primeras especies a finales del siglo XIX, los Haplosporidia han sido un grupo problemático para taxónomos y filogenetistas. Históricamente, el taxón fue un cajón de sastre que incluía aquella diversidad de parásitos que no eran fácilmente clasificables y que tenían dos estadios en su ciclo de vida: un estadio de plasmodio y un estadio de resistencia como espora (Sprague 1979). Los haplosporidios constituyen un pequeño grupo de endoparásitos histozoicos y celozoicos, que forman esporas e infectan mayoritariamente a invertebrados marinos (Perkins 2000). Actualmente, se reconocen como válidas 39 especies, aunque otras muchas fueron descritas, pero no identificadas a nivel de especie, en numerosos hospedadores invertebrados. De las 40 especies descritas 17 infectan moluscos bivalvos, siendo tres de ellas, Bonamia ostreae, B. exitiosa y Haplosporidium nelsoni, causantes de enfermedades de declaración obligatoria para la Organización Mundial de Sanidad Animal, debido a los importantes eventos de mortalidad que ocasionan en las poblaciones de moluscos bivalvos que infectan. Este trabajo revisa la filogenia del grupo, así como de los taxones actualmente incluidos en el mismo, enfatizando la importancia de los resultados obtenidos mediante el análisis de filogenias moleculares. Dada la importancia de las enfermedades causadas por B. ostreae, B. exitiosa y H. nelsoni en las poblaciones de ostra, este trabajo se centrará en la revisión de los siguientes aspectos: distribución geográfica y rango hospedador, ciclo de vida y vías de transmisión, epidemiología, patología y métodos diagnósticos aplicables a dichas enfermedades. En otro capítulo del libro se aborda con más detalle las estrategias de lucha contra las enfermedades de moluscos bivalvos.
2. FILOGENIA DE LOS HAPLOSPORIDIOS
Los esquemas taxonómicos propuestos para la clasificación de este grupo han sido numerosos. Caullery y Mesnil (1899) establecieron el género Aplosporidium, posteriormente enmendado por Lühe (1900) como Haplosporidium, para la clasificación de dos nuevas especies H. scolopli y H. heterocirri, parásitas de anélidos marinos. Este nuevo género fue ubicado en un nuevo orden Haplosporidia perteneciente a la clase Sporozoa. En los años sucesivos, la clasificación interna de los Haplosporidia sufrió varias modificaciones (Kudo 1931; Caullery 1953; Sprague 1966; Sprague 1970), pero el principal cambio vino de la mano de Sprague en 1979, quien creó el filo Ascetospora incluyendo dos clases: la clase Stellatosporea con las familias Marteiliidae, Haplosporidiidae y Urosporidiidae, y la clase Paramyxea con la familia Paramyxidae. En esta nueva clasificación, la familia Haplosporidiidae incluía los géneros Haplosporidium y Minchinia. Posteriormente, Desportes y Nashed (1983) incluyeron la familia Marteiliidae en la clase Paramyxea. Actualmente la clasificación de Sprague (1979) está en desuso, desapareciendo el filo Ascetospora, y elevando a nivel de filo los taxones Haplosporidia y Paramyxea (Desportes y Perkins 1990; Perkins 1990, 1991; Cavalier-Smith 1993).
Los primeros trabajos de filogenia molecular de los Haplosporidia ubicaron al filo como un grupo monofilético dentro de los Alveolata y como un taxón de igual rango que los otros filos incluidos en los Alveolata (Siddall et al. 1995; Flores et al. 1996). Análisis más recientes, empleando un mayor número de secuencias y de taxones, localizaron los Haplosporidia como un taxón hermano de los Dictyosteliidae (Berthe et al. 2000). Este trabajo también apoyó la separación a nivel de filo de los Haplosporidia y los Paramyxea. Cavalier-Smith (2002) y Cavalier-Smith y Chao (2003) hipotetizaron la inclusión del género Marteilia en los Haplosporidia y su proximidad filogenética a los Cercozoa. El análisis de filogenia molecular realizado por Reece et al. (2004), incluyendo en su estudio genes ribosomales y de la actina, apoyó la monofilia de los haplosporidios y su proximidad filogenética a los Cercozoa, y también rechazó la inclusión de los Paramyxea dentro de los Haplosporidia. La reciente clasificación de los eucariotas realizada por Adl et al. (2005) ubica los Haplosporidia en el supergrupo de los Rhizaria, el cual incluye como taxones próximos filogenéticamente los Cercozoa, Foraminifera, Radiolaria y Gromia.
​
3. TAXONES INCLUIDOS EN EL FILO HAPLOSPORIDIA
Dentro de los Haplosporidia se reconocen 3 géneros como válidos: Urosporidium, Minchinia y Haplosporidium; no obstante, trabajos recientes de filogenia molecular apoyan la inclusión del género Bonamia en este filo (Carnegie et al. 2000; Cochennec-Laureau et al. 2003; Reece et al. 2004; Burreson y Reece 2006).
Históricamente, el grupo se caracteriza por presentar dos estadios en su ciclo de vida: un estadio de plasmodio y un estadio de resistencia como espora. Los plasmodios pueden presentar hasta unos 100 núcleos y un diámetro de 5 a 20 mm, aunque pueden alcanzar los 50 mm o más (Fig. 1). Los plasmodios de todas las especies son similares, por lo que su morfología no se puede emplear con fines taxonómicos (Burreson, 2005). Las esporas presentan un tamaño que varía entre 4 y 12 mm de longitud, dependiendo de las especies (Figs. 2-3-4), siendo la ornamentación de la espora el principal criterio morfológico para la asignación de género y para la identificación de especies en los Haplosporidia (Burreson 2005).
FIG. 1. Micrografía de un corte histológico de la glándula digestiva de ostra Crassostrea virginica en cuyo tejido conjuntivo se observan numerosos plasmodios de Haplosporidium nelsoni (flechas) así como infiltración hemocitaria. Tinción: hematoxilina-eosina.
FIG. 2. Micrografía de un corte histológico de la glándula digestiva de ostra Crassostrea virginica en que se observan esporas de Haplosporidium nelsoni (flechas) en el epitelio de dos cortes de túbulos digestivos contiguos. Tinción: hematoxilina-eosina.
FIG. 3. Micrografía de un corte histológico de la glándula digestiva de berberecho Cerastoderma edule cuyo tejido conjuntivo aparece invadido por esporas de Haplosporidium edule (flechas); también se observan algunos plasmodios (flechas dobles) en proceso de esporulación. Tinción: hematoxilina-eosina.
FIG. 4. Micrografía de un corte histológico de la glándula digestiva de almeja Ruditapes decussatus cuyo tejido conjuntivo aparece invadido por esporas de Minchinia tapetis, teñidas de rojo. Tinción: tricrómica de Gomori.
La morfología ultraestructural de las esporas del género Urosporidium se caracteriza por tener una pestaña interna derivada de la pared de la espora tapando el orificio de esta. Haplosporidium y Minchinia se caracterizan por presentar un orificio 1990; Flores et al. 1996; Azevedo 2001; Burreson 2001). La inconsistencia terminológica se vio agravada por la carencia de una descripción precisa de la ornamentación de la espora de la especie tipo del género Haplosporidium, H. scolopli. Sprague (1970) sugirió que la presencia o ausencia de filamentos o colas en la espora podía emplearse para distinguir ambos géneros. Ormières (1980) fue el primer autor que consideró el origen estructural de la ornamentación de la espora y estableció la distinción entre extensiones de la pared de la espora y extensiones del citoplasma de la epispora.
En trabajos posteriores, Perkins (1990, 1991) agrupó las especies que tenían esporas con extensiones visibles con microscopía óptica, sin considerar el origen de la estructura, en el género Haplosporidium, y las especies con esporas sin extensiones visibles en el género Minchinia. Perkins (1991) estableció que la distinción hecha por Ormières (1980) quedaba invalidada debido a la morfología de Minchinia armoricana descrita por Perkins y va n Banning (1981).​
Sin embargo, un estudio posterior de esta especie realizado por Azevedo et al. (1999) documenta que la ornamentación de la espora de M. armoricana deriva de la pared de la espora, por lo que siguiendo la clasificación establecida por Ormières (1980), los autores transfieren la especie al género Haplosporidium. La propuesta taxonómica de Perkins no ganó demasiados adeptos y de forma general se tiene en consideración el origen ontogénico de la ornamentación. Por ello, a pesar de la controversia, el género Haplosporidium engloba aquellas especies cuyas esporas presentan colas o filamentos derivados de la pared de la espora (Sprague 1979; Ormières 1980; Hine y Thorne 1998; Azevedo et al. 1999, 2003; Ciancio et al. 1999; Burreson 2001) (Fig. 6), mientras que las esporas del género Minchinia se caracterizan por carecer de colas o por poseer ornamentaciones derivadas del citoplasma de la epispora, las cuales son efímeras y desaparecen durante el periodo de maduración de la espora (Ormières y De Puytorac 1968; Marchand y Sprague 1979; Desportes y Nashed 1983; Azevedo 2001) (Figs. 5-6-7).
FIG. 5. Micrografía, obtenida con microscopio electrónico de transmisión, de un corte ultrafino en que se observan esporas de Minchinia tapetis (flechas). Las flechas dobles señalan el opérculo de la espora; N. núcleo.
FIG. 6. Micrografía, obtenida con microscopio electrónico de barrido, de una espora de Haplosporidium edule en que se aprecian los filamentos de la pared de la espora. Micrografía cedida por el Prof. Carlos Azevedo.
FIG. 7. Micrografía, obtenida con microscopio electrónico de barrido, de una espora de Minchinia tapetis en que se observa que la pared de la espora está desprovista de filamentos. Micrografía cedida por el Prof. Carlos Azevedo.
Trabajos recientes de filogenia molecular apoyan la importancia de origen ontogénico de la ornamentación de la espora (Reece et al. 2004; Burreson y Reece 2006). En sus análisis, todas las especies del género Minchinia, cuyas ornamentaciones derivan del citoplasma de la epispora, constituyen un clado monofilético, mientras que las especies del género Haplosporidium forman un clado parafilético (Fig. 9). Estos resultados sugieren que los criterios taxonómicos en vigor no se pueden aplicar a aquellas especies cuyas ornamentaciones deriven de la pared de la espora, lo que indicaría la necesidad de un mayor número de géneros para clasificar la diversidad morfológica de especies incluidas actualmente en el género Haplosporidium (Reece et al. 2004; Burreson y Ford 2004; Burreson y Reece 2006).
La complejidad taxonómica del filo se vio incrementada cuando los primeros trabajos de filogenia molecular revelaron que el género Bonamia y la especie Mikrocytos roughleyi (actualmente Bonamia roughleyi) también debían incluirse en los Haplosporidia (Carnegie et al. 2000; Cochennec-Laureau et al. 2003) (Fig. 9). En ese momento, aunque se habían observado estadios plasmodiales, no se conocía para ninguna de las especies de Bonamia descritas estadios de resistencia en forma de espora, siendo una célula uninucleada el tipo celular más comúnmente observado. La afinidad taxonómica de Bonamia spp. A los Haplosporidia había sido argüida en 1980 por Pichot et al. En su descripción de Bonamia ostreae, señalan la presencia en esta especie de un orgánulo común a todos los Haplosporidia, los haplosporosomas (Fig. 8). El descubrimiento en 1982 por Brehélin et al. de verdaderas formas plasmodiales del parásito claramente lo relacionó con los Haplosporidia. Perkins (1987, 1988) también ubicó el género Bonamia en los Haplosporidia y enfatizó la ausencia de células dentro de células como evidencia para excluirlos de los Paramyxea, ya que estos también presentan haplosporosomas. En un reciente trabajo de filogenia molecular, Reece et al. (2004) mostraron que las especies de Bonamia formaban un clado monofilético dentro de los tradicionales taxones de los Haplosporidia, siendo un taxón hermano del género Minchinia.
FIG. 8. Micrografía, obtenida con microscopio electrónico de transmisión, de un corte ultrafino que muestra una microcélula uninucleada de Bonamia ostreae, en cuyo citoplasma aparecen numerosos haplosporosomas (flechas). M: mitocondria; N: núcleo; Nu: Nucleolo.
FIG. 9. Análisis de Máxima Parsimonia mostrando la posición taxonómica y las relaciones filogenéticas de los diferentes géneros incluidos actualmente en el Phylum Haplosporidia. Los números en el nudo de las ramas indican los valores porcentuales de confianza del bootstrap.
La proximidad filogenética a un género que desarrolla esporas sugería que las especies del género Bonamia podrían formar esporas, y que probablemente los estadios conocidos (microcélulas) no eran más que estadios intermedios de un complejo ciclo de vida, en el cual las esporas se podrían encontrar infectando algún otro hospedador todavía desconocido (Burreson y Reece 2004; Reece et al. 2004). En 2006, Carnegie et al. publicaron el descubrimiento de una nueva especie, Bonamia perspora, la cual se caracteriza por presentar plasmodios y esporas con un opérculo externo y ornamentación derivada de la pared de la espora. La confirmación de que al menos una especie del género Bonamia desarrolla esporas con características morfológicas propias del género Haplosporidium, ha ocasionado un nuevo problema taxonómico en la diagnosis de los géneros Haplosporidium y Bonamia, ya que actualmente ambos géneros no se pueden diferenciar en base a caracteres morfológicos.
Bonamia queda definido como género en base a la monofilia observada en los análisis de filogenia molecular, mientras que Haplosporidium forma un grupo parafilético. El género Haplosporidium es difícil de definir tanto por la falta de información sobre la ornamentación de la espora en la especie tipo como por la carencia de datos de secuencias de ADN para otras especies del género. Burreson y Reece (2006) señalaron que la ornamentación de la espora puede ser un carácter válido para definir especies pero no para la asignación de especies a géneros. Sin embargo, recomiendan que aquellas especies con ornamentaciones derivadas de la pared de la espora que no se agrupen con Bonamia spp. en los análisis de filogenia molecular, deberían asignarse a Haplosporidium, hasta que se resuelvan las incógnitas existentes sobre la especie tipo, H. scolopli, y se establezcan unos criterios morfológicos sólidos para la descripción de los diferentes géneros de haplosporidios.
​En la revisión de los Haplosporidia realizada por Burreson y Ford (2004) reconocen 36 especies como válidas. Desde entonces, se han descrito 4 nuevas especies: Bonamia perspora infectando la ostra Ostreola equestris (Carnegie et al. 2006), Haplosporidium montforti infectando la oreja de mar Haliotis tuberculata (Azevedo et al. 2006), Haplosporidium hinei parasitando la ostra perlífera Pinctada máxima (Bearham et al. 2008a) y Minchinia occulta infectando poblaciones de Saccostrea cucullata (Bearham et al. 2007; 2008b). De estas 40 especies 17 infectan a moluscos bivalvos o, como en el caso de Urosporidium, son especies hiperparásitas de trematodos parásitos de bivalvos (Tabla 1). Además, existe otro grupo de unos 18 haplosporidios que no han sido asignados a especies o incluso a género, de ellos 12 infectan moluscos bivalvos. Haplosporidium sp. se identificó parasitando poblaciones de Crassostrea gigas (Comps y Pichot 1991) y Ostrea angasi (Bachere et al. 1987) en Francia. Hine y Thorne (2002) también identificaron Haplosporidium sp. infectando poblaciones de Saccostrea cucullata en la costa occidental de Australia y lo asociaron con un evento de mortalidad masiva en los años 90. Recientemente, Bearham et al. (2007; 2008b) han caracterizado molecularmente este mismo parásito y lo han ubicado filogenéticamente como perteneciente al género Minchinia, creando la nueva especie Minchinia occulta. Minchinia sp. también ha sido identificada infectando al mejillón Mytilus galloprovincialis en Francia (Comps y Tigé 1997). Recientemente, Carballal et al. (2005) describieron la ultraestructura de la espora de Urosporidium sp. infectando al turbelario Paravortex cardii, localizado en el lumen digestivo de un berberecho, Cerastoderma edule, en Galicia (España). Otros parásitos tipo Haplosporidia se han descrito infectando las ostras C. gigas en California (EE.UU) (Katkansky y Warner 1970) y Ostrea lurida en Oregón (EE.UU) (Mix y Sprague 1974); las almejas Tresus capax en Oregón (Armstrong y Armstrong 1974), Ruditapes decussatus en Galicia (Novoa et al. 2004) y Ruditapes philippinarum en Japón (Itoh et al. 2005); la vieira Argopecten irradians en China (Chu et al. 1996); el longueirón Ensis minor en Italia (Ceschia et al. 2001); los mejillones Mytilus edulis en Maine (EE.UU), Nueva Escocia (Canadá) (Figueras et al. 1991; Stephenson et al. 2002) e Inglaterra (Reino Unido) (Bignell et al. 2008) y Mytilus galloprovincialis en Galicia (Fuentes et al. 2002) e Inglaterra (Bignell et al. 2008); y el mejillón cebra Dreissena polymorpha en Francia y Alemania (Burreson y Ford 2004).
La mayoría de las especies de estos géneros no son patógenos importantes para las poblaciones hospedadoras que parasitan, debido a los bajos valores de prevalencia que presentan. Sin embargo tres de ellas, H. nelsoni, B. ostreae y B. exitiosa, tienen especial relevancia debido a los graves efectos que provocan en las poblaciones de moluscos que infectan (Carnegie 2005). Las mortandades asociadas a estas especies han afectado gravemente al desarrollo socioeconómico del sector marisquero en muchos países, convirtiéndose en una seria restricción para el crecimiento y la sostenibilidad de este. Dada la importancia de estas enfermedades, incluidas en la lista de enfermedades notificables de la Organización Mundial de Sanidad Animal, a lo largo del desarrollo de los siguientes epígrafes de este capítulo, nos centraremos en la revisión de diferentes aspectos de la biología y diagnosis de estas especies, así como de los efectos patológicos que causan.
4. DISTRIBUCIÓN GEOGRÁFICA Y RANGO DEL HOSPEDADOR
H. nelsoni, también denominado MSX (multinucleate sphere X), fue identificado como el agente causal de las mortalidades masivas de la ostra americana Crassostrea virginica en la bahía de Delawere (EE.UU) en 1957. Dos años más tarde se descubrió la enfermedad en la bahía de Chesapeake, y a lo largo de los años 60, se identificó H. nelsoni infectando la ostra americana en aguas costeras de Carolina del Norte, Virginia, Maryland, Delaware, Nueva Jersey, Connecticut y Nueva York. Los muestreos periódicos realizados desde mediados de los años 60 hasta principios de los 80, no detectaron el parásito al sur de Carolina del Norte.
TABLA 1. Especies de Haplosporidia aceptadas como válidas que infectan moluscos bivalvos.
Sin embargo, en 1984 el rango geográfico de la enfermedad se amplió desde el río Damariscotta (Maine) a la Bahía de Byscaine (Florida). En 1991, se describe una epidemia de H. nelsoni en el estuario del rio Piscataqua en Maine/New Hampshire (USA) (Barber et al. 1991a).
En el otoño de 2002 Stephenson et al. (2003) identifican por primera vez H. nelsoni en Bras d’Or Lakes en Cape Breton (Nueva Escocia, Canadá). H. nelsoni también ha sido identificado infectando la ostra japonesa Crassostrea gigas en California, Corea, Japón y Francia (Burreson et al. 2000; Renault et al. 2000; Kamaishi y Yoshinaga 2002). Entre 1989 y 1993, más del 10% de las semillas de C. gigas procedentes de Japón, que fueron examinadas para importación en California, estaban infectadas por H. nelsoni (Friedman et al. 1991; Friedman 1996).
​
En Junio de 2007, también se detectó H. nelsoni infectando algunos individuos de C. gigas en unas instalaciones de cultivo en la Columbia Británica (Canadá) (Bower 2007).
La bonamiosis causada por B. ostreae y B. exitiosa, es la responsable de las mortalidades masivas de ostras en el hemisferio norte y sur, respectivamente. Los primeros registros de B. ostreae fueron en EE.UU, tanto en la costas oeste (California y Washington) como este (Maine) infectando la ostra plana Ostrea edulis (Katkansky et al. 1969; Friedman et al. 1989; Elston et al. 1986; Barber y Dav is 1994; Friedman y Perkins 1994). B. ostreae también se ha descrito infectando la ostra plana a lo largo de la costa europea, desde España hasta Dinamarca, incluyendo Irlanda y Gran Bretaña (Pichot et al. 1980; Bucke et al. 1984; Montes y Meléndez 1987; Mc Ardle et al. 1991). Existen evidencias que sugieren que la introducción de este parásito se produjo a finales de los años 70 en Maine, Washington y Europa desde California, debido a los movimientos comerciales de ostras planas infectadas (Elston et al. 1986, Friedman y Perkins 1994, Cigarría y Elston 1997). En el otoño de 2004, Marty et al. (2006) detectaron B. ostreae infectando la ostra plana por primera vez en la Columbia Británica (Canadá), y en el año 2005, se confirmó por primera vez la presencia de este protozoo infectando O. edulis en Marruecos (OIE 2005). Además de la ostra plana, mediante exposición experimental se ha constatado que son susceptibles a B. ostreae las ostras Ostrea angasi, Ostrea chilensis, (= Tiostrea chilensis, =T. lutaria, =Ostrea lutaria), Ostrea puelchana, Ostrea denselamellosa, Crassostrea ariakensis (= C. rivularis) y Crassostrea angulata (Carnegie y Cochennec-Laureau 2004). B. exitiosa se describió parasitando O. chilensis en el estrecho de Foveaux y otras localizaciones alrededor de la isla sur en Nueva Zelanda (Hine et al. 2001; Berthe y Hine 2003). Corbeil et al. (2006) también describieron y caracterizaron molecularmente B. exitiosa infectando Ostrea angasi en Australia. Recientemente, Abollo et al. (2008) han registrado la presencia de B. exitiosa infectando la ostra plana O. edulis en Galicia (NO España), lo que amplia tanto el rango geográfico de esta especie, previamente descrita solo en el hemisferio sur, como el rango hospedador. Existen diferentes registros de Bonamia sp. parasitando O. chilensis en Chile (Kern 1993; Campalans et al. 2000), O. puelchana en Argentina (Kroeck y Montes, 2005) y C. ariakensis en Carolina del Norte (Burreson et al., 2004). Recientemente, el laboratorio de Referencia de la OIE para la bonamiosis ha incluido todos estos registros de Bonamia sp. de localidades tan dispares en la misma especie, B. exitiosa (López-Flores et al., 2007).
5. CICLOS DE VIDA Y TRANSMISIÓN
En los Haplosporidia tradicionales que forman esporas, los plasmodios se dividen por plasmotomía y eventualmente tienen una esporulación simultánea. Las esporas (forma de resistencia) son liberadas al medio, normalmente, después de la muerte del hospedador. El destino de las esporas se desconoce, pero no parecen ser infectivas para el hospedador en el que se desarrollan.
Los estadios plasmodiales de H. nelsoni se localizan infectando intracelularmente el tejido conjuntivo (Fig. 1) y epitelial, mientras que las esporas se observan únicamente infectando el epitelio de los túbulos digestivos (Fig. 2). El proceso de esporulación se observa en rara ocasión en las poblaciones de ostras adultas, pero es bastante frecuente en ostras juveniles infectadas (Barber et al. 1991b). Actualmente, el estadio infectivo de H. nelsoni todavía se desconoce. Farley (1967) estudiando series histológicas durante 5 años, propuso un ciclo de vida para esta especie. Farley hipotetizó que de la espora debía emerger un esporoplasma uninucleado con capacidad infectiva. Debido a que la observación de esporas en esta especie es poco frecuente, algunos investigadores consideran que H. nelsoni debe tener un ciclo indirecto, en el cual exista un hospedador intermediario que facilite la transmisión y propagación de la enfermedad (Andrews 1968; Burreson 1988; Haskin y Andrews 1988; Ford y Tripp 1996). Los primeros experimentos diseñados para estudiar el ciclo biológico de H. nelsoni se centraron en el estudio de la transmisión de la enfermedad en condiciones controladas, pero siempre con resultados negativos (Canzonier 1968, 1974; Andrews, 1979). En el estudio realizado por Powell et al. (1999), para establecer un modelo matemático de la dinámica de la infección, destacaron las características que debía cumplir el posible hospedador intermediario, las cuales son muy similares a las propuestas previamente por Haskin y Andrews (1988): (1) debe liberar gran número de partículas infectivas rápida y continuamente durante los meses de verano; (2) no se puede ver afectado por variaciones de temperatura y salinidad; (3) puede verse afectado por las temperaturas del invierno, pero con capacidad para recuperarse en 1 ó 2 años; (4) debe producir partículas infectivas independientemente del nivel de infección de H. nelsoni en las poblaciones de ostra; y 5) debe vivir en un nivel de salinidad relativamente alto.
En B. ostreae y B. exitiosa los estadios que se observan rutinariamente son células uni o binucleadas tanto intra como extracelulares, denominadas microcélulas (Figs. 10-11), y más esporádicamente estadios plamodiales multinucleados. En B. ostreae los estadios uninucleados tienen un diámetro de 1 a 2.5 mm, con núcleo en posición periférica mientras que en B. exitiosa el diámetro es de 2 a 5 mm y el núcleo suele ser central o subcentral (Abollo et al. 2008). Cuando las células de B. ostreae se examinan con microscopio electrónico de transmisión, pueden aparecer como formas densas a los electrones, siendo el núcleo más pequeño y condensado, o como formas claras. La importancia de estos estadios no está todavía clara. Las formas densas a los electrones de B. ostreae son más numerosas en ostras fuertemente infectadas, y las claras son más frecuentes en ostras con infecciones leves. Pichot et al. (1980) propusieron que la forma densa podía ser el estadio infectivo de B. ostreae; sin embargo, en la actualidad no existen suficientes evidencias que apoyen esta propuesta. Las células binucleadas representan estados intermedios de división celular.
En B. exitiosa, Hine (1991) observó cambios estacionales en las frecuencias de formas densas y binucleadas en las infecciones de Ostrea chilensis de Nueva Zelanda, distinguiendo una fase de incubación (Septiembre a Noviembre) caracterizada por formas densas escasas, una fase de proliferación de las formas densas (Diciembre a Mayo), que coincide con el pico de mortalidad, y una fase de predominio de células binucleadas (Junio a Agosto). Los estadios plasmodiales de más de dos núcleos se observan frecuentemente en B. exitiosa, mientras que en B. ostreae se encuentran esporádicamente y sólo en ostras moribundas o post-mortem (Brehélin et al. 1982). Los factores que favorecen el desarrollo de los estadios plasmodiales son desconocidos. Brehélin et al. (1982) lanzaron una hipótesis, todavía sin verificar, en la que decían que a partir de los estadios plasmodiales que se desarrollaban en algunas ostras muertas, se producía un gran número de células infectivas, siendo está la razón por la que B. ostreae proliferaba explosivamente en una población de ostras.
FIG. 11. Micrografía de un corte histológico de ostra Ostrea edulis infectada por Bonamia exitiosa (flechas). Obsérvese el tamaño mayor de las microcélulas y la posición central del núcleo. Tinción: hematoxilina – eosina. Barra: 10 μm.
FIG. 10. Micrografía de un corte histológico de ostra Ostrea edulis infectada por Bonamia ostreae (flechas). Obsérvese el tamaño reducido de las microcélulas y la posición periférica del núcleo. Tinción: hematoxilina – eosina. Barra: 10 μm.
A diferencia de lo que ocurre con H. nelsoni, la transmisión de la bonamiosis puede producirse directamente de ostra a ostra por cohabitación (Elston et al. 1986; Culloty et al. 1999) o por inoculación de microcélulas (Mialhe et al. 1988a; Hervio et al. 1995). Este hecho constituye una evidencia de que las esporas no son imprescindibles en el proceso de transmisión (Reece et al. 2004), y también podría explicar la rápida propagación de la enfermedad en los bancos de ostras. Previo al desarrollo de la infección, existe un periodo de latencia, en el cual no ha sido posible la detección del parásito en los tejidos empleando técnicas histológicas (Montes 1991; Culloty y Mulcahy 1996; Culloty et al. 2001). Se cree que el parásito penetra en la ostra durante el proceso de filtración del agua o la respiración (Bucke 1988; Montes et al. 1994). Después de atravesar el epitelio branquial, el parásito es fagocitado por los hemocitos, donde se multiplica por fisión binaria hasta romper el hemocito. Entonces, los parásitos, otra vez libres, pueden infectar nuevos hemocitos. Los parásitos, tanto intra-como extracelulares, son liberados del hospedador con las heces, quizás también por diapédesis de hemocitos infectados y/o cuando el hospedador muere.
​
La fase de vida libre del parásito en el medio se desconoce, incluso existen razones que hacen sospechar que el ciclo de vida de Bonamia spp. puede tener otros hospedadores o vectores, en los cuales se encuentre otros estadios de desarrollo como la espora. Esta sospecha se ha acrecentado con el reciente descubrimiento de una especie del género Bonamia que produce esporas, B. perspora, (Carnegie et al. 2006). Se han realizado diferentes estudios de transmisión, con el objetivo de aclarar el posible papel de otras especies de moluscos como transportadores o reservorios de B. ostreae. La ostra japonesa C. gigas, los mejillones Mytilus edulis y M. galloprovincialis, las almejas Ruditapes decussatus y R. philippinarum y el berberecho, Cerastoderma edule no pudieron ser infectados en experimentos realizados en el campo y en el laboratorio tanto empleando infecciones naturales como experimentales (Van Banning 1987; Figueras y Robledo 1994; Renault et al. 1995; Culloty et al. 1999). Todos estos estudios se realizaron empleando como técnicas diagnósticas la citología y la histología, ya que las técnicas moleculares no se encontraban desarrolladas en ese tiempo. Culloty et al. (1999) señalan que aunque B. ostreae no se detectó en el estudio realizado con las diferentes especies de bivalvos, no se puede concluir que dichas especies no sean transportadores de B. ostreae, hasta que el ciclo vital del parásito se conozca en detalle. Recientemente, Lynch et al. (2007) demostraron que 8 invertebrados bentónicos y 19 muestras de zooplancton agrupadas daban resultados positivos a B. ostreae empleando la PCR como técnica diagnóstica. En los experimentos de transmisión que realizaron en el laboratorio también obtuvieron resultados positivos en dos ostras cohabitando con la estrella de mar Ophiothrix fragilis. Sin embargo, este resultado tampoco es concluyente, ya que puede ser indicativo tanto de parasitismo como de transporte o ingestión de B. ostreae por el equinodermo.
6. EPIDEMIOLOGÍA
El ciclo anual de infección de H. nelsoni fue descrito por Ford y Haskin (1982) en la Bahía de Delaware. La infección se adquiere a comienzos de junio y a lo largo del verano la prevalencia e intensidad de la infección van aumentando, alcanzando el mayor nivel de infección a finales del otoño. Los valores de prevalencia permanecen relativamente estables hasta finales del invierno, siendo entonces cuando se produce la muerte de las ostras fuertemente infectadas y deja de detectarse la infección en la población restante. Los valores demográficos de la infección vuelven a incrementarse de nuevo en Abril y Mayo, coincidiendo con el incremento de las temperaturas, resurgiendo de nuevo la infección, que parecía estar suprimida como consecuencia de las bajas temperaturas del invierno (Ford 1985a). En el caso de la infección de Crassostrea virginica por H. nelsoni está bien documentado el efecto de variables ambientales como temperatura y salinidad. En los primeros trabajos de campo se sugirió que la infección por el parásito estaba limitada por la salinidad, ya que las infecciones son extremadamente raras a salinidades por debajo de 10 ppt y no es epidémica a salinidades inferiores a 15 ppt (Andrews 1964; Haskin y Ford 1982; Andrews 1983). Ford (1985b) observó que cuando se producía una disminución de la salinidad media desde 15 a 5 ppt también se producía una rápida pérdida de parásitos. Sin embargo, cuando la salinidad era superior a 20 ppt se producía una elevada actividad parasitaria (Haskin y Ford 1982; Andrews 1983). Ford (1985b) propuso que una limitación fisiológica podía afectar a la distribución de H. nelsoni en aguas de baja salinidad. En estudios in vitro se observó que la tolerancia de los estadios plasmodiales a cambios bruscos de salinidad mostraba un comportamiento similar a lo observado en la naturaleza. La reducida prevalencia de H. nelsoni en áreas de baja salinidad probablemente se deba a la incapacidad fisiológica del parásito para tolerar salinidades reducidas más que a un aumento de la eficacia en la respuesta inmune frente a la infección (Ford y Haskin 1988).
Muchos de los datos generados a los largo de estos años se integraron en un modelo matemático de interacciones hospedadorparásito-medio ambiente (Ford et al. 1999; Paraso et al. 1999; Powell et al. 1999). Empleando este modelo se observó que bajo condiciones de salinidad elevada, la temperatura era el factor dominante; sin embargo, la salinidad era un factor clave cuando las simulaciones se realizaban con datos de áreas donde los regímenes de salinidad variaban. Las simulaciones realizadas empleando las series temporales recogidas a lo largo del gradiente de salinidad de la Bahía de Delaware, reprodujeron la dinámica poblacional de H. nelsoni bajo condiciones de mayor y menor aporte de agua dulce. Los resultados del modelo indicaron que la intensidad de infección del parásito bajo condiciones cambiantes de salinidad era más compleja que el simple resultado de un cambio salino que pudiese afectar a la proliferación del parásito y a sus tasas de mortalidad en las ostras, y que la tasa de infección era probablemente más reducida a bajas salinidades. El modelo también se construyó para reflejar las variaciones en la dinámica de la infección de H. nelsoni en relación a las variaciones de temperatura del invierno tomadas en la Bahía de Delaware (Ford y Haskin 1982). Las diferentes simulaciones realizadas apoyan la hipótesis que atribuyen los recientes brotes epidémicos de la enfermedad en el noreste de Estados Unidos (Barber et al. 1997; Sunila et al. 1999) y en el este de Canadá (Stephenson et al. 2003) a la tendencia mundial de calentamiento global registrada desde hace más de una década y que conlleva la aparición de inviernos más cálidos (Cook et al. 1998). Los resultados de la simulación demostraron la capacidad del modelo para reproducir medidas de campo y su utilidad para elucidar la asociación entre la magnitud y el calendario de descarga del río Delaware, sus variaciones asociadas con la salinidad, y el ciclo anual de H. nelsoni.
Desde el descubrimiento de la bonamiosis, la elevada prevalencia de B. ostreae se ha relacionado con picos de mortalidad, que se producen en los últimos periodos de crecimiento, cuando las ostras llegan a su talla comercial (Baud et al. 1997; Da Silva et al. 2005). La infección por Bonamia se produce a lo largo de todo el año, pero los valores demográficos de la infección se incrementan en las estaciones cálidas (Grizel 1985; Hine 1991; Culloty y Mulca hy 1996). En el caso de B. ostreae existen mayores valores de prevalencia a finales de la primavera y durante el verano (Tigé et al. 1982; da Silva et al. 2005); mientras que en el hemisferio sur, B. exitiosa muestra una mayor prevalencia desde enero a abril, siendo raramente detectable el parásito en septiembre y octubre. B. ostreae prolifera y se transmite dentro de un amplio rango de temperaturas del agua. Las temperaturas altas promueven la expansión de la enfermedad mientras que las bajas ralentizan la transmisión de la enfermedad (Grizel et al. 1988). También se ha comprobado que inviernos fríos seguidos de veranos suaves limitan la propagación de la enfermedad (Zabaleta y Barber 1996). El efecto de la salinidad en el desarrollo de la enfermedad no se ha estudiado con detenimiento, aunque se han observado infecciones en tanques con salinidades de hasta un 39‰ (Grizel et al. 1988). El periodo prepatente para ambas especies de Bonamia es de 3-4 meses, pero puede llegar a ser hasta de 5 meses (Tigé y Grizel 1984; Elston et al. 1987; Montes, 1991); sin embargo, empleando técnicas moleculares de diagnóstico, se han detectado infecciones en ostras transcurridos 2 meses desde su introducción en un área enzoótica (Lynch et al. 2005). La infección por B. ostreae también está relacionada con factores intrínsecos del propio hospedador, como son la edad (Tigé et al. 1982; Culloty y Mulca hy 1996) y la talla (Figueras 1991; Cáceres-Martínez et al. 1995); aunque también se sabe que la variabilidad en los valores demográficos de la infección está relacionada con efectos sinérgicos negativos como la postpuesta o la disminución del alimento (Culloty y Mulca hy 1996).
7. INTERACCIÓN HOSPEDADOR-PARÁSITO
La enfermedad MSX fue reconocida por primera vez como causante de mortalidades masivas en la bahía de Delaware en la primavera de 1957. Aproximadamente la mitad de las ostras sembradas en los bancos de Nueva Jersey murieron en un periodo de 6 semanas (Haskin et al. 1966). El síntoma macroscópico más obvio de la infección por H. nelsoni son las anormalidades en la concha de C. virginica (Farley 1968). En las ostras más fuertemente infectadas se ha descrito retracción del manto; mientras que en las ostras de mayor edad, que sobreviven a la infección, se han observado depósitos de conquiolina en la cara interna de la superficie de las valvas, aunque no es un síntoma conservado en todas las poblaciones estudiadas. Las ostras infectadas son típicamente delgadas y acuosas con la glándula digestiva pálida. Farley (1968) describió 5 etapas progresivas de la enfermedad. Una etapa inicial en la que los plasmodios se localizan en el epitelio del palpo, branquias o sifones. Las infecciones en la etapa intermedia afectan al tejido conjuntivo y a los epitelios de la masa visceral, observándose infiltraciones masivas por hemocitos del tipo hialinocito. La etapa avanzada de la infección se caracteriza por una invasión masiva del parásito con diseminación por el torrente circulatorio, así como por infiltración masiva de hialinocitos en el tejido conjuntivo. En esta etapa de la infección se pudo constatar que se producían procesos de reparación, tanto en el epitelio de las branquias como del palpo, por lo que se estableció que la destrucción mecánica no era la causa directa de la muerte del molusco. La etapa terminal se caracteriza histológicamente por la necrosis tanto de las células hospedadoras como parásitas. En esta etapa se observa debilitamiento del músculo aductor, imposibilitando el cierre de las valvas. La última etapa descrita por Farley es la de remisión, que se caracteriza por reducción de la infiltración en los tejidos, y por presencia de gran número de parásitos moribundos y de células pigmentarias en el tejido conjuntivo. En general, se observa una reducción del número de parásitos, así como localización de estos en el tejido epitelial o en su proximidad. También se observa la presencia de parásitos y células fagocíticas en el lumen intestinal. H. nelsoni consigue evadir el sistema inmunitario de la ostra evitando ser fagocitado por los hemocitos de la ostra (Ford et al. 1993; Ford y Ashton-Alcox 1998). La presión de MSX durante años sobre la población de ostras de la Bahía de Delaware ha dado lugar a un aumento notable de la tolerancia a la enfermedad en la población por selección natural (Ford 2002). Un programa pionero de selección genética de resistencia a una enfermedad de moluscos bivalvos se desarrolló con éxito para hacer frente a H. nelsoni en la Bahía de Delaware (Ford y Haskin 1987); las estirpes de ostras producidas no son resistentes en sentido estricto, pues adquieren la infección, pero consiguen que ésta no progrese, manteniendo los plasmodios confinados en el epitelio branquial durante años, de forma que las ostras superan ampliamente el tamaño comercial mucho antes de sufrir los efectos letales de la enfermedad (Ford y Haskin 1987).
Las mortandades masivas atribuidas a B. ostreae a partir de 1979, ocasionaron el desplome de la producción de ostra plana en Europa. Así, en Francia, la bonamiosis unida al brote epidémico causado por Marteilia refringens, ocasionó una reducción drástica en la producción de ostra plana, pasando de las 20.000 Tm por año en 1970 a las 1.800 Tm en 1995. El impacto negativo de B. ostreae sobre las poblaciones de ostra plana también se ha observado en otros países europeos, sin embargo existen discrepancias de cómo afecta la infección al crecimiento o al índice de condición de las ostras. En Galicia se ha constatado una influencia negativa de la bonamiosis sobre el crecimiento y el índice de condición de las ostras (Montes y Meléndez 1987; Montes et al. 1991); sin embargo, en otros países como Irlanda y Estados Unidos el índice de condición no se ve fuertemente afectado por la bonamiosis (Rogan et al. 1991; Zabaleta y Barber 1996), mientras que en Francia las ostras apenas muestran síntomas de la infección (Balouet et al. 1983). El síntoma macroscópico más obvio es la formación de hendiduras en el borde de las láminas branquiales, que llegan a ser profundas en los casos más avanzados de la enfermedad. B. ostreae es un protozoo intrahemocitario, pero también puede ser observado extracelularmente entre células intersticiales en branquia y estómago o en áreas de tejido conjuntivo necrosado. También se describió en el interior de células epiteliales de branquia (Montes et al. 1994). Aunque la mayoría de las ostras infectadas parecen normales, algunas veces la infección va acompañada por decoloración amarilla y amplias lesiones en el tejido conjuntivo de branquias, manto y glándula digestiva. La patología está relacionada con la destrucción de los hemocitos y la intensa infiltración hemocitaria de los órganos afectados, lo que ocasiona una destrucción de la arquitectura normal de tejidos y órganos y su consecuente disfunción. Probablemente la intensa proliferación hemocitaria puede ocasionar la oclusión del sistema circulatorio. Las infecciones leves suelen ser focales, mientras que las infecciones avanzadas normalmente tienen carácter sistémico y provocan la muerte de la ostra, que puede ser más o menos rápida en función de las condiciones ambientales. La interacción entre la célula hospedadora y el parásito fue estudiada comprobándose que los hemocitos de la ostra plana son capaces dereconocer y fagocitar al parásito, pero no lo destruyen (Montes et al. 1994). Sin embargo, en el caso de Crassostrea gigas (especie resistente a la bonamiosis) se han observado signos de destrucción del parásito dentro de los hemocitos (Chagot et al., 1992). Diversos estudios han abordado la interacción entre el parásito y el sistema inmunitario del hospedador, pero todavía no se ha aclarado definitivamente cómo las microcélulas consiguen eludir el sistema de defensa de la ostra. B. ostreae provoca un incremento significativo de los hemocitos circulantes, más marcado en el caso de los hialinocitos (probablemente el tipo más favorable para que en su interior se multipliquen las microcélulas), y una infiltración hemocitaria intensa del conjuntivo de distintos órganos (Da Silva et al. 2008); B. ostreae ingresa en el citoplasma hemocitario mediante un proceso de fagocitosis activa (Chagot et al. 1992); todos los tipos hemocitarios fagocitan al parásito (Mourton et al. 1992); según Hervio et al. (1991) la actividad fosfatasa ácida de B. ostreae podría interferir en el estallido respiratorio del hemocito (proceso por el que los hemocitos producen radicales tóxicos de oxígeno que contribuyen a destruir patógenos), lo que facilitaría la supervivencia de las microcélulas dentro de los hemocitos. Se han constatado diferencias cualitativas y cuantitativas en niveles enzimáticos entre la hemolinfa de ostras infectadas y no infectadas (Xue y Renault 2000; Da Silva et al. 2008).
Bonamia exitiosa es también un parásito intrahemocitario que prolifera con rapidez, originando igualmente infecciones sistémicas que se detectan en el tejido conjuntivo de las branquias, manto y gónada. Las mortandades masivas causadas por B. exitiosa también constituyen una característica recurrente en la dinámica de la población de ostras de Foveaux Strait en Nueva Zelanda (Doonan et al. 1994; Cranfield et al. 2005). A finales de 1985, se confirmó un brote epidémico de B. exitiosa, con evidencias de mortalidad anormal hasta Marzo de 1995. La pesquería se clausuró en 1993 para permitir la recuperación de la población de ostras, con el consiguiente impacto negativo sobre la economía local. En el periodo indicado, la población de ostras se redujo a menos del 10% de los efectivos presentes antes del brote (Doonan et al. 1994). Entre los años 2000 y 2006 se confirmó otro brote epidémico, con valores de mortalidad en torno al 72% de las ostras reclutadas hasta el 2005 (Anónimo 2006).
8. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO
Para un control efectivo de las enfermedades en moluscos es necesario disponer de métodos de diagnóstico que sean rápidos, fiables y altamente sensibles. Tradicionalmente, la técnica histopatológica ha sido el método de elección para el diagnóstico de las enfermedades de moluscos en general, ya que proporcionan mucha información sobre el estado general de salud de los individuos, y también permite la detección de un amplio rango de patógenos. Sin embargo, presenta algunas limitaciones, ya que es una metodología que no permite hacer un diagnóstico a nivel de especie y muchos patógenos pueden ser difíciles de diagnosticar cuando las intensidades de infección en los tejidos son bajas. Además del examen de cortes histológicos, para el diagnóstico de bonamiosis se utilizan otras técnicas de microscopía óptica, más rápidas y baratas, basadas en el examen de frotis o improntas de diferentes órganos así como el examen citológico de muestras de hemolinfa (Fig. 12), siendo mayor la sensibilidad con el examen de frotis de corazón o de hemolinfa que con los cortes histológicos (Da Silva y Villalba 2004). En general, las especies de haplosporidios son muy difíciles de identificar en secciones histológicas si sólo se dispone de estadios plasmodiales. Cuando se identifican esporas en un corte histológico, H. nelsoni puede ser presuntamente identificado en las ostras si las esporas son del tamaño correcto (6-8 mm de longitud) y si aparecen infectando exclusivamente el epitelio de los túbulos digestivos. La presencia de plasmodios multinucleados ovales de 4-50 mm de diámetro infectando ostras en zonas de estuario con una salinidad inferior a 25 ppt, también indica que presuntamente la infección es causada por H. nelsoni. En el caso de Bonamia un resultado positivo consiste en la detección, en los frotis o en las preparaciones histológicas, de hemocitos de ostra infectados por microcélulas con núcleo eosinófilo y con forma esférica u ovoide, de entre 2 y 5 μm. Según la bibliografía (Bower 2007; Vallat 2006) no resulta posible la distinción de Bonamia ostreae y B. exitiosa mediante microscopía óptica, aunque Abollo et al. (2008) indican algunas diferencias morfológicas entre ambas especies (Figs 10–11). Sí existen diferencias a nivel ultraestructural entre ambos parásitos (Hine et al. 2001), pero el empleo de microscopía electrónica de transmisión no es viable en programas de monitoreo y control, quedando esta técnica reservada para trabajos de investigación. La especie hospedadora y el rango geográfico puede ser un buen indicativo para saber de qué especie se trata; sin embargo, cuando estos rangos se solapan pueden producirse identificaciones erróneas. Tal fue el caso de H. nelsoni y H. costale en la costa este de Norte América (Stokes y Burreson 2001) o el reciente hallazgo de las coinfecciones de B. exitiosa y B. ostreae en Galicia (NO España) (Abollo et al. 2008).
​
Para la detección de B. ostreae se desarrollaron varios inmuno-ensayos que, aunque inicialmente eran muy prometedores, actualmente no están en vigor (Mialhe et al. 1988; Boulo et al. 1989; Rogier et al. 1991; Cochennec et al. 1992). Las técnicas moleculares basadas en la PCR y la hibridación in situ también se han desarrollado para muchas de las especies de haplosporidios.
FIG. 12. Micrografía de una capa de hemocitos sobre un portaobjetos obtenida por citocentrifugación de la hemolinfa de una ostra Ostrea edulis. Se observan numerosas microcélulas uninucleadas (flechas) y binucleadas (flechas dobles) de Bonamia ostreae en el citoplasma de los hemocitos. Tinción: Hemacolor
Está bien documentado, en diferentes estudios de validación, que las técnicas de diagnóstico molecular son más sensibles que la histología cuando las infecciones son de baja intensidad, especialmente si el parásito es pequeño (Diggles et al. 2003; Balseiro et al. 2006). Sin embargo, hay que tener siempre en consideración que un resultado positivo de PCR aunque puede indicar la presencia de un agente infeccioso, no verifica la existencia de una infección. Los resultados obtenidos por PCR deberían ser siempre confirmados por histología o hibridación in situ, ya que ambas técnicas permiten la visualización del parásito (Burreson 2008).
​
Para la detección de H. nelsoni se diseñó una pareja de cebadores para PCR (MSX-A y MSX-B), que se unen a la subunidad pequeña del ADN ribosomal y amplifican un fragmento de 564 pares de bases (Stokes et al. 1995). La especificidad y la sensibilidad de estos cebadores fue demostrada por Stokes et al. (1995) y Renault et al. (2000). Las regiones hipervariables del gen 18S del ARNr también se emplearon para diseñar sondas de hibridación in situ (Fong et al. 1993; Stokes y Burreson 1995). Fong et al. (1993) probaron la sonda diseñada en células de H. nelsoni realizando frotis de corazón. La oligosonda diseñada por Stokes y Burreson (1995), denominada MSX1347, se probó para valorar tanto su sensibilidad como especificidad y permite la identificación específica de los estadios plasmodiales de H. nelsoni (Stokes y Burreson 2001).
Para la identificación molecular de B. ostreae se han desarrollado dos protocolos de PCR, con dos parejas de cebadores diferentes, que amplifican un fragmento de la subunidad pequeña del ADN ribosomal. Basándose en la similitud de la secuencia de los cebadores Bo-Boas diseñados por Cochennec et al. (2000), con las secuencias del gen 18S ARNr de otras especies de haplosporidios, se cree que dichos cebadores deben amplificar todas las microcélulas de haplosporidios; mientras que los cebadores CF-CR diseñados por Carnegie et al. (2000) se cree que al menos amplifica B. ostreae y B. exitiosa. La falta de cebadores específicos de PCR obliga a que la identificación de B. ostreaea y B. exitiosa se realice empleando un protocolo de RFLPs aplicado a los productos de PCR amplificados con los cebadores Bo-Boas. El producto de PCR digerido con la enzima BglI produce dos perfiles de restricción: una banda de 300 bp para B. exitiosa y dos bandas, de 120 y 180 bp, para B. ostreae (Fig. 13); sin embargo, esta técnica aún no fue validada. Recientemente, también se han publicado dos protocolos de PCR a tiempo real para Bonamia spp. (Marty et al. 2006; Corbeil et al. 2006).
FIG. 13. Ensayo diagnóstico para Bonamia ostreae y B. exitiosa mediante análisis de PCR-RFLP. La amplificación se realizó empleando los cebadores Bo-Boas y para el análisis de restricción se empleó la endonucleasa BglI. Carril: Pm marcador de peso molecular de 50 pb; 1, B. ostreae; 2, B. exitiosa.
Para la identificación de B. ostreae también se han desarrollado dos protocolos de ISH. Una de las sondas se realizó marcando con digoxigenina el producto de PCR generado por los primers Bo-Boas (Cochennec et al. 2000) (Fig. 14); no obstante, esta sonda no es específica ya que híbrida con B. exitiosa y H. nelsoni. El protocolo diseñado por Carnegie et al. (2003) se basó en el empleo combinado de 3 oligonucleótidos marcados con fluoresceína (UME-BO-1, UME-BO-2 Y UME-BO-3). La especificidad de la oligosonda se probó frente a H. nelsoni, pero probablemente hibrida con otras microcélulas, incluyendo B. exitiosa. La comparación reciente de técnicas microscópicas y moleculares pare el diagnóstico de B. ostreae (Lynch et al. 2008) ha demostrado la necesidad de mejorar la sensibilidad de las técnicas de diagnóstico. Brevemente podríamos concluir que aunque existe un cierto número de métodos basados en sondas de ADN para la detección de las principales enfermedades causadas por haplosporidios en moluscos bivalvos, sería necesario un mayor esfuerzo con el fin de (1) mejorar o implementar nuevas sondas específicas y (2) validar y estandarizar los protocolos ya existentes, mediante el trabajo conjunto de diferentes grupos de investigación.
FIG. 14. Prueba de hibridación in situ para la detección de la infección por Bonamia ostreae en la branquia de la ostra plana (Ostrea edulis). Las imágenes corresponden a cortes seriados del mismo tejido. (A) Micrografía de un corte histológico teñido con hematoxilina-eosina. (B) Detalle a más aumentos del mismo corte histológico mostrando las células de B. ostreae. (C) Sección hibridada utilizando como sonda el fragmento amplificado con los cebadores Bo-Boas. El parásito se identifica por la coloración más oscura. (D) Control negativo (sin sonda) donde se observa la falta de reacción de hibridación positiva.