Patología en acuicultura
Infecciones víricas de peces cultivados
1. Introducción
La virología y la patología de peces eran dos campos de estudio más unidos a la especulación que a datos experimentales definitivos hasta la llegada de las técnicas de cultivos celulares de peces a mediados de los años cincuenta. Las técnicas de cultivo celular permiten, al menos en parte, la investigación sobre virus de peces desde los dificultosos estudios estacionales y ambientales de animales vivos y proveen un fundamento para investigaciones controladas. Como en otras áreas de salud animal, el ímpetu y dirección de la investigación sobre virus de peces ha estado llevado por las enfermedades con significación económica, social o estética. Las primeras investigaciones se realizaron en salmónidos cultivados intensivamente y especies no salmónidos en Europa y Norteamérica. Sin embargo, debido al acelerado interés mundial por la Acuicultura, el estudio de los agentes virales de peces ha llegado a un amplio espectro de peces cultivados y salvajes de diversos hábitats acuáticos. El número de virus de peces demostrados y los agentes parecidos a virus «virus-like») ha incrementado desde menos de seis a principios de los sesenta a más de 60 hoy (cuadro I). Similarmente, la virología de peces no abarca meramente el aislamiento de un virus y la determinación de sus características. Las técnicas modernas en bioquímica, biofísica, citogenética, inmunología y biología molecular refuerzan la capacidad para detectar, identificar y caracterizar los virus de peces, y afortunadamente para realizar un control de las infecciones víricas de peces. Nuevos grupos y subgrupos de virus de peces han estado definidos como resultado de los estudios coordinados de virus de peces, aves, insectos y mamíferos, y estos estudios han estimulado el interés de la audiencia científica
Los virus de peces están ahora reconocidos como una faceta integral en la totalidad de los virus de animales y plantas, y las enfermedades agudas, infecciones latentes y enfermedades neoplásicas, resultado de infecciones víricas, se miran como representativas de los problemas sanitarios en otras especies.
2. Adenovirus de peces
Los adenovirus son virus icosaédricos no envueltos de ADN, conocidos principalmente por sus infecciones largas y por las infecciones latentes fácilmente activadas en mamíferos y aves. Los virus replican en el núcleo celular formando disposiciones cristalinas. Algunos adenovirus son oncogénicos, y algunos requieren virus ayudantes («Nhelper») para su replicación. Cuatro agentes parecidos a adenovirus han sido reconocidos en electromicrografias y están asociados con enfermedades crónicas en esturiones blancos cultivados, hiperplasias epidérmicas en el bacalao atlántico, hiperplasias epidérmicas en la barbada y la enfermedad de la «fresa» (strawberre y disease) en la trucha arco iris.
2.1. Biología de las enfermedades
Adenovirus del esturión blanco Esturiones blancos, salvajes y maduros sexualmente fueron capturados en el río Sacramento (California, USA) para ser usados como reproductores. Después de varios años de obtención de buenas progenies, empezaron a ocurrir determinados niveles de mortalidad en peces de menos de un año en varias piscifactorías. Algunas mortalidades fueron atribuidas a infecciones bacterianas, pero una nueva enfermedad viral fue también detectada.
Signos clínicos, cambios histológicos y transmisión
Esturiones blancos juveniles enfermos (0,5 g) estaban letárgicos, inapetentes y desnutridos. Internamente, el hígado estaba pálido y el tracto alimentario se hallaba sin comida, pero no se encontraron más signos de enfermedad clínica. Se observaron cambios histopatológicos en las células epiteliales del intestino delgado y la válvula espiral. En las células afectadas el núcleo sufría un aumento progresivo, y las células se desprendían al lumen del intestino. En un caso, cambios patológicos similares fueron observados en el parénquima del hígado. La enfermedad resultó en una mortalidad crónica y al menos una piscifactoría tuvo pérdidas en un 50% en un período de 4 meses. Esturiones blancos juveniles (10 g) inoculados intraperitonealmente con homogenados filtrados (0,45 pm) de órganos desarrollaron una hipertrofia nuclear idéntica, pero no tan severa a la observada en infecciones naturales.
Detección vírica
Las pruebas realizadas para aislar el virus no tuvieron éxito. Homogenados de órganos fueron inoculados en las siguientes líneas celulares, BB, BF-2, FHM, CCO, CHSE-214, SH-1 y SS-2; células de tejidos infectados fueron co-cultivadas con las líneas SH-1 y 88-2, y se intentó iniciar cultivos primarios para poder detectar cambios inducidos por los virus. En ninguna de las pruebas se detectaron efectos citopáticos.
Electromicrografias del intestino y válvula espiral de animales afectados mostraron baterías de partículas icosaédricas densas a los electrones de unos 74 nm de diámetro (fig 1). Las partículas fueron vistas exclusivamente en el núcleo y no se observó ni una sola gemación en membranas celulares. Partículas no densas a los electrones, presuntivamente incompletas, mostraban una cápsida interna de unos 47 nm de diámetro que podría corresponder al diámetro del núcleo central o nucleoide. No se observaron fibras en los vértices. Dichas partículas fueron tentativamente asignadas al grupo de los adenovirus debido a que presentaban muchas de las características morfológicas de este grupo.
Adenovirus del bacalao atlántico
Signos clínicos y cambios histológicos
JENSEN y BLOCK (1980) describieron una enfermedad de la piel en bacalaos atlánticos capturados en el mar Báltico Las lesiones eran placas transparentes de 3 a 20 mm de diámetro ligeramente elevadas y se hallaban distribuidas sobre todo el cuerpo particularmente en la región caudal. Histológicamente las placas eran hiperplasias epidérmicas. El epitelio era liso y de apariencia normal, pero la epidermis tenia un grosor de cuatro veces el normal y era escaso en células mucosas.
Las células de la capa germinal eran de un tamaño menor al habitual, y muy vacuolizadas por debajo de la membrana basal Las células pigmentadas se encontraban separadas y formaban agregados de pigmentos más que una capa uniforme.
Detección vírica
Fig. 1. Microfotografía electrónica del adenovirus del esturlon blanco. Cédulas epiteliales de la válvula espiral mostrando partículas víricas liberadas en el citoplasma a través de una rotura en la membrana nuclear. De HF.DRICK et al. (1985b); reproducida con permiso de Inter-Research.
Las partículas eran icosaédricas de unos 77 nm de diámetro y desnudas; estaban formadas de un nucleoide electron-denso localizado centralmente y rodeado de una cápsida externa de unos 10 nm de espesor, de cuyos vértices partían espículas radiales de unos 20-25 nm de longitud. Debido a la localización y ultraestructura de las partículas (JENSEN y BLOCK, 1980), concluyeron que se trataba de adenovirus. Dicho virus no ha sido todavía aislado en cultivo celular y no ha sido descrita la transmisión experimental de la enfermedad.
Adenovirus de la trucha arco iris
La enfermedad de la «fresa» es una afección inflamatoria de la piel no fatal que sólo afecta a la trucha arco iris. La enfermedad fue reconocida hace treinta años y se considera endémica de ciertas «hatcheries» del cuadrante noroeste de los Estados Unidos, aunque recientemente la enfermedad ha sido detectada en Francia. Han sido citadas morbosidades de hasta el 80% y la enfermedad ha causado posiblemente fuertes pérdidas económicas. La etiología de la enfermedad es desconocida y las especulaciones van desde una enfermedad infecciosa hasta reacciones alérgicas locales. La enfermedad se transmite por cohabitación. Los animales afectados suelen recuperarse al cabo de los dos meses y la enfermedad no es recurrente. Han sido descritos acortamientos en el período de recuperación con tratamiento con oxitetraciclina oral (OLSON et al., 1985). FLEURY et al. (1985) han aislado un agente parecido a adenovirus de las lesiones, pero los postulados de River no han sido todavía demostrados.
Signos clínicos y cambios histopatológicos
Los signos clínicos de la enfermedad de la «fresa» sólo se han asociado a afecciones de la piel que cubren las porciones central y posterior del cuerpo. Inicialmente las lesiones aparecen como áreas elevadas circulares u ovoides, pequeñas, únicas o múltiples en la piel. Cuando las lesiones se han desarrollado totalmente, son ulceraciones rojas y brillantes, pero no hemorrágicas, de un diámetro de varios milímetros hasta varios centímetros. Cuando las úlceras curan, la pigmentación normal de la piel reaparece. Histológicamente, la enfermedad es una. respuesta inflamatoria progresiva. Aparecen focos difusos de linfocitos y monocitos que se infiltran en la dermis, hipodermis y capas fasciculares subyacentes, formando una separación laminar casi continua entre la dermis y la epidermis. La infiltración se hace más extensa cuando se desarrolla la lesión. Se produce una necrosis local y pérdida de la epidermis superficial, así como una necrosis local y lisis de las fibras musculares en la profundidad de la lesión. La apariencia rojo brillante de la lesión es debida a una dilatación y congestión de los vasos sanguíneos.
Detección vírica
FLEURY et al. (1985) describen el aislamiento de virus en lesiones de la enfermedad de la «fresa. provenientes de dos brotes. El tejido fue dispersado e inoculado sobre membranas corionicoalantoideas de huevos de pollo embrionados de 9 días. Pústulas de 1 mm de diámetro aparecieron a los siete días de Incubación a 37°C. Observaciones al microscopio electrónico de dichas pústulas y lesiones tisulares mostraron partículas lárices idénticas de unos 65 nm de diámetro, icosaédricas y desnudas Las partículas tenían 6 capsómeros en cada extremo periférico, pero no se observaron espiculas en los vértices. FLEURY et al. (1985) propusieron la designación de «fresa. a esta enfermedad y consideraron al virus como parecido a adenovirus. No se han descrito intentos de transmisión experimental en trucha, y el papel del virus en el desarrollo de esta enfermedad sigue siendo especulativo. Por otro lado, se duda del origen piscícola del posible virus debido a que sólo se conocen adenovirus de origen aviar que repliquen en huevos de pollo embrionados y porque ningún virus aislado de salmónidos replica a 37° C.
3. Herpesvirus de peces
Los Herpersvirus están asociados a varias lesiones inocuas irritantes de piel, a infecciones virulentas y fulminantes y a neoplasias. Las infecciones latentes son características de los Herpersvirus; los virus después de una infección primaria desaparecen y se reactivan algunos anos más tarde. Los Herpersvirus replican en el núcleo celular y su genoma está constituido por ADN. En peces se han descrito doce Herpersvirus (cuadro 2); ocho de estos virus han sido aislados en cultivo celular y son virus del pez gato, Herpesvirus salmonis, «Steelheach Herpersvirus, virus de Nerka, virus de Oncorhynchus masou, virus del tumor de Yamame, Herpesvirus cyprini y el Herpesvirus vitreum». Otros cuatro han sido sólo detectados al microscopio electrónico y son Herpersvirus 1 de Esócidos, Herpesvirus scophtalmi, Herpersvirus del «Smooth dogfish« y Herpersvirus del bacalao del Pacífico. Los virus de Oncorhyncus masou y del Tumor de Yamame son oncogénicos.
3.1. Biología de las enfermedades
Virus del pez gato (CCV)
El virus del pez gato (CCV) fue descrito por primera vez en 1968 como el agente causal de una afección aguda, hemorrágica de larvas y alevines del pez gato. Cuando las temperaturas del agua son de unos 25 a 30° C, los signos clínicos se desarrollan rápidamente y se producen altas mortalidades. El virus y la enfermedad fueron descritos por primera vez por FIJAN (1968) y FIJAN et al. (1970).
Distribución geográfica y hospedadores afectados
En condiciones naturales el CCV sólo afecta al pez gato, aunque se han descrito dos epizootias en el «blue entfigh» debidas al CCV o a un CCV-Like (Piala 1972b; Woir, 1973). Por otro lado, se ha conseguido la transmisión experimental de la enfermedad por inyección en el «blue catflsh», «white catflsh» y a catflsh», así como en los híbridos del «blue catflsh» y el pez gato; en cambio, han resultado resistentes a dicha inyección o a cohabitación el «black», «brown« y «yellaw bullhead», carpín dorado, «bluegill», «Teclear sunfish« y «stripped basa». La enfermedad ha sido detectada en la mayor parte del Sur de los Estados Unidos y muchas áreas de California Brotes aislados de la enfermedad han sido diagnosticados en otras áreas de Estados Unidos. La única cita de brote fuera de los Estados Unidos está en Honduras y se trataba de peces gato importados de USA. La distribución geográfica de la enfermedad se ha debido al tráfico de animales infectados.
Signos clínicos
Los signos clínicos de la enfermedad del CCV no son únicos y pueden variar o estar ausentes. Los animales afectados aparecen inapetentes, letárgicos, a menudo nadando por la superficie del agua o dando vueltas convulsivamente sobre su eje longitudinal. Los síntomas externos incluyen exoftamia, distensión abdominal y protusión del ano (fig. 2). Pueden aparecer zonas hemorrágicas en la base de las aletas y en las propias aletas en la superficie ventral, en las agallas y en el ano. Internamente la cavidad del cuerpo está llena de ascitis, el tracto digestivo se halla vació de comida y contiene un exudado mucoide. Aunque los órganos internos están generalmente edematosos e hiperémicos, el hígado y riñones aparecen pálidos. Hay petequias y equimosis en los órganos internos y a veces en los músculos esqueléticos. El cerebro y la médula espinal pueden estar también edematosos. Los máximos de mortalidad se dan hacia los 3-6 días después de la aparición de la sintomatología clínica, y pueden llegar hasta el 100%. Los animales supervivientes pueden ver retardado su crecimiento.
Cambios histológicos
A las 48 horas de exposición al patógeno, los cambios patológicos se hacen ya evidentes en la mayoría de órganos y tejidos con el riñón, bazo y tracto digestivo severamente afectados. En el riñón la parte hematopoyética se necrosa y se deshace, y el epitelio de los túbulos proximales sufren hemorragias moderadas y necrosis.
En el bazo se denota hemorragia, necrosis de las células hematopoyéticas y reducción del tejido linfoide. El intestino y el estómago presentan necrosis y desprendimiento de la mucosa y submucosa.
Fig. 2. Alevines de pez gatos afectados por la enfermedad del CCV. a) Peces moribundos de una epizootia mostrando hidropesía abdominal y ano saliente; b) hemorragias en músculos, piel, y aletas de peces de una epizootia; e) exoftalmia y hemorragias en peces infectados 6 días antes con CCV procedente de cultivo celular. De Pian et al. (1970).
En el hígado la degeneración es menos espectacular, aunque se observan inclusiones intracitoplasmáticas en los hepatocitos. El epitelio que rodea las células atinares pancreáticas está moderadamente necrótico y las células actuares algo más necróticas. Pueden darse cambios degenerativos en el músculo cardíaco y las neuronas del cerebro. Se observa un acúmulo de macrófagos en los riñones, bazo, tracto digestivo y corazón.
Aislamiento e identificación del virus
El virus del pez gato ha estado aislado de larvas y alevines infectados naturalmente y de juveniles y adultos infectados experimentalmente. Raramente el virus ha sido aislado de adultos con enfermedad natural. En los juveniles infectados el virus puede ser detectado en la sangre, riñones, intestino e hígado ya a las 24 horas postinfección, y el título máximo se obtiene a partir de órganos internos a las 72-98 horas. Pocos virus se aíslan a partir del músculo esquelético. Los títulos virales decrecen con el tiempo, y los intentos de recuperar el virus después de 7-10 días de la remisión de la enfermedad no han tenido éxito. Debido a que el virus se inactiva muy fácilmente en los tejidos, las muestras deben mantenerse congeladas o en frío.
La marcada especificidad del CCV »in vivo» se corrobora también en el limitado número de líneas celulares, donde se logra la replicación del virus.
Hasta el presente sólo se conocen cinco líneas celulares donde replica el CCV, y todas ellas son de peces ictalúricos. Las lineas celulares más usadas para la replicación del virus son la BB y la CCO. La incubación a 25-30° C demuestran claramente la formación de sincicios en 24-48 horas. Además, el virus puede ser detectado por un ensayo de inmunofluorescencia directa a las dos horas después de la infección.
Para la identificación del CCV la neutralización y la inmunofluorescencia son los ensayos más comúnmente utilizados.
Los ensayos de infectividad después de neutralización indican que sólo existe un serotipo de CCV, pero los distintos perfiles obtenidos con la digestión con endonucleasas de restricción sugieren que pueden haber distintas cepas del CCV. La existencia de una fracción vírica no neutralizable, atribuida a la agregación vírica, puede interferir con la interpretación de los ensayos de neutralización.
Se ha investigado sobre la existencia de portadores asintomáticos de CCV por las técnicas de diagnóstico tradicionales, así como por la estimulación de producción de virus por tratamientos hormonales, irradiación y cambios de temperatura y los resultados han sido negativos.
Varias citas han sugerido que los tratamientos con drogas irununosupresoras pueden estimular la producción de virus o que pueden reforzar el potencial para detectar los virus, los antígenos víricos o los ácidos nucleicos víricos PLUMB et al (1981) detectaron el antígeno de CCV, pero no aislaron el virus en el primer pasaje en cultivo celular de ovarios de presuntos portadores inmunosuprimidos de CCV. Bowser et al., (1986) fueron los primeros en describir el aislamiento del CCV de reproductores asintomáticos. Cuando estos animales fueron trununosuprimidos, se aislaron virus de los leucocitos de 7 peces en un total de 7 a los cinco días de la primera inoculación en cultivo celular. También se aislaron virus de 3 peces de un total de 15 animales no tratados en riñón posterior, gónoda y leucocitos, aunque fueron necesarios varios pasajes sin efecto citopático y de 9 a 21 días de incubación. WISE y BOYLE (1985), usando la técnica de sondas de ADN, detectaron el ADN del CCV en varios tejidos de ejemplares juveniles de pez gato infectados experimentalmente. Posteriormente, Wise et al, (1985) han utilizado dicha técnica de las sondas de ADN para detectar el CCV en dos poblaciones de adultos: una con historial de infección de CCV en años previos, y otra sin historial Las técnicas de las sondas de ADN y la co-cultivación de leucocitos son técnicas prometedoras para la detección y control de portadores asintomáticos. Debido a que una gran proporción de los supervivientes a la infección de CCV pueden desarrollar la formación de anticuerpos neutralizantes el análisis de poblaciones positivas al anticuerpo de CCV ha sido utilizado para identificar portadores potenciales asintomáticos. En algunos casos existe buena correlación entre la presencia de anticuerpos neutralizantes en los huevos y el aislamiento del CCV en las larvas. Sin embargo, debido a que el título de anticuerpos neutralizantes varia estacionalmente, debe usarse más como un indicador que como una predicción precisa del estado de portador de CCV.
Transmisión
Cuando los signos clínicos son evidentes se da fácilmente la transmisión horizontal del CCV. Para iniciarse una infección es suficiente que los animales estén en contacto con agua contaminada o con peces moribundos o muertos. La transmisión horizontal se ha conseguido por cohabitación, por inyección intraperitoneal o intramuscular, o bien frotando con suspensiones lárices las agallas o heridas de animales. Experimentalmente se ha logrado inducir la enfermedad a peces adultos y juveniles. La transmisión vertical del CCV se acepta en teoría, pero no se ha aislado virus de los productos sexuales.
Empíricamente se observan correlaciones entre brotes de enfermedad por CCV en alevines menores de un ato y reproductores con historia de exposición al CCV. La detección de ADN vírico en tejidos de animales adultos, sin ningún tipo de historial clínico de enfermedad de CCV, sugiere que el virus es transportado como una infección latente que se activa por factores ambientales o fisiológicos desconocidos. Similarmente las subidas cíclicas de anticuerpos neutralizantes contra el virus en adultos sugiere que el estado de portador latente puede ser periódicamente activado durante años después de la infección original.
Factores que afectan la enfermedad
La, incidencia de la mortalidad debida al CCV es máxima en larvas y alevines de menos de cuatro meses, y la susceptibilidad decrece posteriormente. Los juveniles y adultos son resistentes a la infección natural. Las distintas cepas de pez gato varían en susceptibilidad frente al CCV y las cepas híbridos parecen ser más resistentes que las cepas puras.
A temperaturas de 26 a 30°C, el período de incubación es más corto y la mortalidad mayor, y lo contrario ocurre a temperaturas de 10 a 20°C. En alevines mantenidos a 28°C, la sintomatología se desarrolla 48-72 horas después de la exposición, y la muerte ocurre poco después (auras, 1982). La mortalidad puede ser disminuida si 24 horas después de la infección la temperatura desciende a 20 o menos de 20°C, pero no se observa ningún tipo de disminución si la temperatura baja una vez ya se han desarrollado los signos clínicos. Las condiciones ambientales que promueven el stress fisiológico; por ejemplo, altas temperaturas, poco oxigeno disuelto, manipulación, masificación e infecciones bacterianas y parasitarias pueden predisponer a los peces susceptibles a la infección con CCV.
El stress puede activar la infección latente.
Control de la enfermedad
Los métodos tradicionales de desinfección y control se han utilizado para. el control de la enfermedad del CCV. El equipamiento y material puede ser desinfectado por secado y por tratamiento con cloro 49 (> = 20 ppm, y los estanques por secado y tratamiento con cal (CaO) a una proporción de 1 Tm/acre. Lo ideal seria que sólo se utiliza como stock las puestas provenientes de reproductores libres de CCV o sin ningún historial clínico de CCV. El CCV se ha aislado raramente de presuntos portadores adultos, y estudios de Wise et al, (1985) sugieren que el CCV puede ser endémico del pez gato. Encontraron que la prevalencia y la mortalidad debida a la infección por CCV puede ser muy baja por lo cual el historial y los niveles de mortalidad pueden ser indicadores irreales de la exposición al CCV.
Una manipulación juiciosa es la mejor medida de prevención para el CCV. Ni supervivientes al CCV ni adultos, cuyo suero tenga actividad neutralizante contra el CCV, deben ser usados como reproductores. La mortalidad puede ser prevenida o evitada seleccionando las cepas de pez gato más resistentes al CCV, manteniendo los animales a bajas temperaturas y minimizando las condiciones de cultivo y ambientales desfavorables. PLUMB (1973b) y Heartwell (1975) demostraron que adultos inmunizados con CCV producían anticuerpos neutralizantes. Noga y HARTMANN (1981) y WALCZAK et al, (1981) describieron una vacuna atenuada producida por pasajes seriados en células de riñón de iwalktng catfish.. Se vacunaron alevines por inmersión y éstos mostraron una alta supervivencia cuando sufrieron una infección experimental de CCV por inyección.
Además, la supervivencia fue mayor cuando los alevines recibieron además una dosis de recuerdo. Usanza et al. (1973) encontraron que peces inyectados con ácido poncifirisico, que ostensiblemente estimula la síntesis de interferir, eran más resistentes a una «challenge» letal. El efecto del interferir en la replicación del CCV no ha sido investigado en cultivo celular.
Las drogas antivireles 9-(2-hidroxietoximetil) guanina (acicloguanosina), fosfonoacetato y 5-iodo-2.-deorduridina inhibe la replicación del CCV en cultivo celular (Buck y Loh, 1983; Kelly et al., 1983; KIMORA et al., 1983a; KomEent y HAINES, 1978). GERBA et al (1979) describieron que el CCV es fotodinámicamente inectivado por el azul de metileno en luz blanca No existen estudios que describan detalladamente la eficacia de ningún antivírico contra el CCV ni en peces ni en cultivo celular.
Herpesvirus de salmónidos
Fue aislado por primera vez en 1971 a partir de truchas en puesta, pero el aislamiento no fue confirmado ni el virus caracterizado hasta 1975. El virus no ha vuelto a ser aislado desde 1975; sin embargo, recientemente se ha aislado un Herpersvirus de truchas »steelhead» en puesta. Ensayos de neutralización cruzada demuestran que ambos herpesvirus están muy relacionados.
Distribución geográfica y hospedadores
El Herpesvirus salmonis originalmente aislado de fluidos ováricos de truchas que sufrían de un 30 a un 50% de mortalidad post-puesta, pero la relación causal entre el virus y la mortalidad de los adultos no ha sido confirmada. La enfermedad y la mortalidad se reproducen en truchas de 6 meses de edad inyectadas con el virus intraperitoneal o intramuscularmente. Las siguientes especies de peces son resistentes a la infección por dichos virus: salmón del Atlántico, trucha salvelinus, trucha fario, alevines de trucha arco iris y salmón kokane. La enfermedad no se puede reproducir por cohabitación. El Herpesvirus salmonis sólo se ha aislado en la Winthrop Washington National Fish Hatchery (USA). No se han recuperado dichos virus durante un muestreo de dos años en las piscifactorías que recibían huevos y alevines de dicha «hatchery». El »steelhead» herpesvirus fue aislado de fluidos ováricos de trucha arco iris que volvían a la Warm Spring Hatchery y en el Norte de California (USA). No hubo mortalidad asociada y los animales aparecían sanos. Tanto los alevines de trucha arco iris como de salmón chinook son susceptibles al virus por inmersión. No han sido descritos ni más hospedadores nf más localizaciones de enfermedad.
Signos clínicos
En larvas y alevines de trucha arco iris inoculados experimentalmente con Herpesvirus salmonis los signos clínicos de enfermedad aparecían de 2 a 3 semanas después de la infección y la mortalidad era generalmente alta, variando del 50 al 100%. Los peces afectados mostraban hiperactividad al principio, pero incrementaban el letargo más tarde hasta llegar a la muerte. La sintomatología externa incluía oscurecimiento de la piel, exoftalmia, distensión abdominal y agallas pálidas. Se observaban señales blancas mucosas alineadas a partir del ano junto con hemorragias en los ojos y en la base de las aletas Internamente la cavidad peritoneal estaba llana de ascitas y el tracto digestivo contenía pocos alimentos. Los órganos internos aparecían edematosos y flácidos. El hígado, corazón y bazo estaban moteados de áreas hiperémicas y los riñones aparecían pálidos algunas veces. Los peces estaban anémicos, los hematocritos eran a menudo de sólo un 30% del valor normal. En truchas arco iris adultas portadoras del Herpesvirus salmonis no se han descrito signos clínicos aparte de la alta mortalidad.
Cambios histológicos
Los cambios histopatológicos producidos por infección experimental con Herpesvirus salmonis en trucha arco iris han sido descritos por Wolf (1983), y WOLF y Smith (1981). La patología más pronunciada se da en riñones, hígado, intestinos, corazón y agallas. El riñón anterior presenta edematosis débil o moderada e hiperplasia del tejido hematopoyético. En el riñón posterior se dan cambios edematosos con necrosis del tejido hematopoyético y túbulos renales; además éstos contienen material sérico y residuos particulados. Los glomérulos están algo edematosos. El hígado presenta edematosis, necrosis y hemorragia o congestión. En cuanto al intestino, cabe distinguir entre la zona anterior y píloro que están normales de la zona posterior que muestra una extensa necrosis, desprendimiento de la mucosa e infiltración de leucocitos en la submucosa. El corazón está edematoso, necrótico, y presenta infiltraciones de linfocitos, leucocitos polimorfonucleares y macrófagos. El bazo y el cerebro presentan diferentes grados de edema y congestión. Ocasionalmente, se observan hemorragias y necrosis en el tejido muscular. El páncreas presenta grandes sincicios, y las agallas muestran edema, hipertrofia y hemorragia, así como una separación estructural entre el epitelio y el tejido conjuntivo.
Aislamiento del virus e identificación
Tanto el Herpesvirus salmonis como el herpesvirus de la trucha arco iris fueron aislados de fluidos ováricos de adultos aparentemente sanos y de alevines y juveniles infectados experimentalmente. En alevines infectados experimentalmente el Herpesvirus salmonis fue recuperado a partir de los riñones, el hígado, el estómago y los intestinos.
El Herpesvirus salmonis replica sobre las lineas celulares CHSE-214, KF-1, RTG-2 y RTF-1, pero no en BB, BF-2 y FHM. El herpesvirus de la trucha arco iris se propaga en las células CHSE-214 y RTG-2. Para obtener el máximo de sensibilidad se debe dejar una adsorción del inoculo sobre el cultivo celular de 2 horas. La temperatura óptima de replicación de ambos virus es 10°C, y ninguno de ellos replica a 15°C o más. Las células infectadas coalescen hasta formar sincicios a los 7-14 días después de la inoculación. Ensayos de neutralización de la infectividad han demostrado que ambos virus están muy fuertemente relacionados. Estos aislamientos realizados en Norteamérica forman un serogrupo distinto del de los herpesvirus de salmónidos japoneses, pero comparten algunos antigenos de neutralización.
Transmisión
La forma de transmisión del Herpesvirus salmonis y el herpesvirus de la trucha arco iris es aún desconocida Teóricamente estos virus pueden ser transmitidos horizontal y verticalmente. Ambos virus son portados como infecciones latentes, y son ostensiblemente activados en la época de puesta El Herpesvirus fue aislado en años sucesivos, indicando que los supervivientes de la infección pueden transformarse en portadores de virus. Sólo se ha efectuado la transmisión experimental en peces de menos de 6 meses. Herpesvirvs salmonis sólo se transmite por inyección y no por cohabitación. HEDRICH et al. (1987) describen que el «steelhead, herpesvirus puede ser transmitido por inmersión en peces jóvenes.
Factores que afectan la enfermedad
Las características del crecimiento en cultivo celular del Herpesvirus salmonis y el virus de la trucha arco iris y el progreso de la enfermedad bajo condiciones de laboratorio indican que la temperatura afecta profundamente el curso de la infección. La enfermedad y la mortalidad sólo se producen si los peces susceptibles infectados son mantenidos alrededor de los 10°C; las primeras muertes pueden ocurrir después de varias semanas si se mantienen las condiciones óptimas para la infección.
Control de la enfermedad
El control del Herpesvirus salmonis fue conseguido por destrucción de los reproductores y con desinfección de la «tatchery» de Winthrop National Fish Hatchery, que era el foco de la enfermedad KIMURA et al. (1983a) describieron que los antiviricos 9-(2-hidroxietoximettl) guanina. (acicloguanosina) y el 5-iodo-2'-deorluridina suprimen la replicación del Herpesvirtis salmonis en cultivo celular, pero los intentos en animales vivos no han tenido éxito.
Herpesvirus de salmónidos japoneses Se han aislado tres herpesvirus de peces salmónidos en Japón. El virus de Nerka del lago Towada, prefectura de Atrita y Aomori (NeVTA), fue aislado de salmones kokane moribundos (Salo, 1978); el virus de Oncorltyncus masou (OMV) fue aislado de fluidos ováricos de «j'amaine. (Kuniaa et al., 1981a), y el virus del tumor de «amame» (YTV) the aislado de tumores mandibulares de «vamame». Tanto el OMV como el YTV son oncogénicos. Ensayos de neutralización de la infectividad indican que estos tres aislados víricos están fuertemente relacionados (Hamar et al., 1987).
Signos clínicos y cambios histológicos
Alevines de «kokane• infectados con el NeVTA se vuelven de color oscuro, letárgicos e inapetentes. Los riñones son los órganos diana de los cambios patológicos. En las células intersticiales del riñón se observan sincicios e inclusiones citoplasmáticas, los túbulos se hacen necróticos y se acumula fluido sérico en las cápsulas de Bowman. Las células atinares pancreáticas se vacuollzan y las células epiteliales de las agallas presentan hinchazón y desprendimiento y en el músculo esquelético se observan cambios degenerativos (Uso, 1976). Se pueden dar brotes de enfermedad con mortalidades superiores al 80% en peces de menos de un año.
El OMV fue inicialmente aislado de «yamames• aparentemente sanos, pero los alevines y juveniles infectados experimentalmente morían. Los peces afectados presentan «oftalmia, inapetencia e hiperactividad. Hemorragias petaquiales son evidentes especialmente bajo la mandíbula Internamente, se observa el hígado moteado blanco o en ocasiones completamente blanco. Ocasionalmente el bazo está edematoso. El hígado es el foco de cambios patológicos, mostrando severa necrosis multifocal y formación de sincilios. La necrosis también se observa en el bazo y músculo cardíaco.
Las partículas de herpesvirus fueron visualizadas en micrografias electrónicas de tejido hepático. Algunos supervivientes de infecciones experimentales desarrollan papilomas epiteliales. Los tumores se hallan principalmente en el área perioral (KartraA et al, 1981a, b). El YTV fue aislado de tumores espontáneos que consistían en células banales cilíndricas y espiraimas en una disposición alveolar. Los tumores se observan en la región perfora', pero por lo demás el pez aparece como un animal sano. En infecciones experimentales se observa mortalidad, y los peces moribundos presentan exoftalmia, distensión abdominal e hiperemia especialmente del ano. Algunos supervivientes de la infección desarrollan tumores periorales que son histológicamente similares a los neoplasmas espontáneos (SANO et al, 1983).
Aislamiento e identificación del virus
Los virus NOTA, OMV y YTV replican sólo en cultivos celulares de salmónidos, y las lineas más frecuentemente empleadas son la RTG-2 y la CHSE-214 (Krisuaa, et al, 1981a, b; Salvo, et al, 1983. Las células infectadas forman sincicios a temperaturas de 6 hasta 18° C. La replicación vírica es óptima a 15°C y disminuye a 18°C. Ensayos de neutralización de la infectividad indican que los tres virus tienen fuertes similitudes serológicas. Los perpesvirus de salmónidos de Japón y USA son serológicamente distintos, pero muestran algún antígeno común (HEraucil et al, 1987).
Transmisión
Se conoce muy poco sobre la transmisión natural del NeVTA, OMV y YTV. Tanto la transmisión horizontal como la vertical pueden jugar un papel en las epizootias anuales del NeVTA de •kokanees. inferiores al arlo, en la baja supervivencia de la progenie de reproductores infectados con OMV y en la persistencia de epiteliomas de varias poblaciones de •amame•. Tanto el OMV como el YTV han sido transmitidos experimentalmente. Kuwatí, et al. (1981a, b) transmitieron el OMV por inmersión y cohabitación de alevines y juveniles de churnsalmón, kokanee y trucha arco iris. Encontraron que peces de tres meses de edad eran más susceptibles que los de cinco meses y que los de siete meses eran resistentes a la infección letal. Las muertes en animales de tres a cinco meses de edad ocurría desde los 11 a los 120 días después de la infección, y que los tumores epiteliales se desarrollaban en varios puntos en el grupo de cinco meses de edad al cabo de 4 a 10 meses después de la infección. Raramente se recuperaban virus de los tumores. Los supervivientes de las infecciones experimentales producían anticuerpos neutralizantes anta-OMV (lIntuaa, et al., 1981b).
Sexo et al (1983) infectaron por infección intraperitoneal a •amames• y salmones cluun; la mayoría de muertes ocurrieron hacia los 30 días después de la infección y se desarrollaron tumores periorales 10-13 meses después de la inoculación.
Control de la enfermedad
Programas de revisión de peces enfermos se realizan rutinariamente para identificar poblaciones portadoras de patógenos de peces, y restringir la distribución de peces infectados es una estrategia práctica para el control de la enfermedad. El OMV y el YTV fueron detectados durante uno de tales programas. Knanu, et al. (1983a, b) examinaron el efecto de varios antiherpesvirus en la Infección de OMV. Encontraron que la replicación del OMV en las células RTG-2 era inhibida más eficazmente por el 9-(2-hidrwdetoximetll) guanina (acicloguanosina) y en menor extensión por la 5-iodo-2'- deoiduridina (IUdR) y el fosfonoacetato. Peces infectados experimentalmente sumergidos diariamente en acicloguanosina mostraban un 30% más de supervivencia que los controles infectados no tratados. Resultados similares fueron observados con la administración oral diaria de lUdR. Ambos componentes suprimen el desarrollo de los tumores inducidos por virus.
Herpesvirus de la carpa La viruela de la carpa, una hiperplasia epidérmica benigna, es conocida en Europa desde la Edad Media La. enfermedad es conocida también por epitelioma papuloso, papilomatosis de la carpa, viruela de los peces y otros nombres. Ninguna de estas designaciones es clinicamente correcta debido a que la lesión no es ni una vesícula, ni está causada por un poxvirus, ni es un verdadero epitelioma o papiloma (HINES et. el, 1974; NIGRELLI, 1952; SCHULUMBERGER y LUCICE, 1948; Wou«, 1983). Aunque las lesiones son espectaculares, la enfermedad no causa mortalidad en los peces afectados. &miura (1964, 1966) publicó microgranas electrónicas que mostraban partículas semejantes a herpesvirus asociadas a la viruela de la carpa. SANO et. al. (1985a, b) aislaron de las lesiones de carpas con viruela un virus al que denominaron Herpesvirus cyprini o herpesvirus I de ciprínidos (CHV).
Distribución geográfica y hospedadores La viruela de la carpa se da principalmente en la carpa común y carpin, pero también en el barbo, la brema común, solenoide», spikeperch», leucisco, eperlano, tenca, híbridos de carpa y varios peces de acuario (atiza et. al, 1969; DWJN, 1967; Momia, 1954). La enfermedad está reconocida en toda Europa, Asia, RU.518, e Israel. NIGRELLI (1948) y SONSTEGARD y SONSTEGARD (1978) describieron la presencia de la viruela de la carpa en Norte América, y Mctuatsrza et. al. (1985) describieron un brote de viruela de la carpa en «golden ide» importados a los Estados Unidos.
Signos clínicos
Las lesiones de la viruela de la carpa son placas superficiales de un color blanco-lechoso a gris que se proyectan de 1 a 2 mm sobre la, superficie de la piel Las proliferaciones son lisas, pero pueden tomar una textura rugosa en estadios avanzados. Las lesiones van incrementando progresivamente de diámetro y en casos severos se fusionan cubriendo extensas zonas de la superficie del cuerpo y aletas (figs. 3 y 4). Eventualmente las lesiones se desprenden y quedan cicatrices o bien aparecen nuevas lesiones. La enfermedad no es fatal, pero el crecimiento de los peces afectados puede verse retardado y pueden aparecer deformaciones esqueléticas.
Cambios esqueléticos
Los cambios patológicos asociados con la viruela de la carpa están confinados a la epidermis (Irises et. íd., 1974; MAWDESLEY-THOMAS y Sucss, 1967; WOLF, 1983) Las células epiteliales escamosas se hiperplasian y su proliferación hace desaparecer el estrato normal epidérmico y reduce el número de células mucosas. El corion y las estructuras subyacentes son normales. No hay respuesta inflamatoria significativa y la necrosis es inusual.
Se han detectado inclusiones intracitoplasmáticas e intranucleares al microscopio óptico y fluorescente (SCHUBERT, 1964, 1966).
Fig. 4. Gulden ida mostrando múltiples lesiones nodulares de la postula do la carpe. De Mc Anisres. (1985); reproducida con permiso de la Wildlife asease Association.
Fig. 3. Carpa común mostrando múltiples lesiones dermicas de la pústula de la carpa. Fotografiara cortesía de N. NWAN. De Wotr (1973): reproducida con permiso de Academie Press.
La microscopia electrónica de los tejidos afectados ha revelado partículas semejantes a herpesvirus en células que muestran degeneración avanzada (ScsussaT, 1964, 1966). La replicación vírica ocurre en el núcleo en inclusiones granulares que parecen de cromatina, y los nucleoides son encapsulados y más tarde envueltos por membranas nucleares y citoplasmáticas.
Transmisión
SONSTECIARD y SONSTEGARD (1978) transmitieron la viruela de la carpa a la carpa común y a los híbridos de carpa común y carpín dorado, friccionando heridas epiteliales con tejidos infectados y por cohabitación. Las vesículas se desarrollaron alrededor de los 80 días después de la infección y a 10°C. Sexo et. al. (1985a) transmitieron la viruela de la carpa a carpas comunes por inyección intraperitoneal de Herpesvirus cyprini crecidos en células FHM. Los peces infectados eran mantenidos a 16°C, y las lesiones se desarrollaron alrededor de los cinco meses después de la infección.
Aislamiento e identificación del virus
Sarro et. a/. (1985a, b) aislaron el Herpesvirus cyprini de vesículas de la piel y aletas de kAsagi (kol carp)• y carpa común. Se inocularon las muestras en las líneas celulares EPC y FHM, y después de 2 ó 3 semanas de incubación a 20°C se observó la formación de inclusiones intranucleares y subsecuente lisia celular. La replicación vírica también se ha descrito en las líneas CE-1, CE-2 y MCT a 15 y 20°C. No se ha detectado replicación ni a 10 ni a 25°C. Se pueden detectar antígenos víricos en células infectadas con ensayos de anticuerpos fluorescentes después de 5 días de incubación a 20° C. SONSTEGARD y Sostrnsio (1978) y Mcausrsa et al. (1985) describieron intentos sin resultado de aislar el virus de lesiones vesiculares de carpa sobre varias líneas celulares.
Factores que afectan la enfermedad
La incidencia de la viruela de la carpa está afectada por factores ambientales y por factores del hospedador. La prevalencia de la enfermedad en tanques con alta densidad de población puede llegar casi al doble de los tanques con baja densidad de peces y la prevalencia y regresión de las pústulas varían con la estacionalidad (xaras et al., 1974; KAWDESLEY-Tmcomm y Humo, 1967). No está claro, sin embargo, si esto es reflejo del efecto del stress o del carácter infeccioso de la enfermedad. La susceptibilidad a la enfermedad viene afectada por factores genéticos. Cepas puras de peces muestran mayor prevalencia que las cepas híbridas, y la enfermedad raramente ocurre en alevines o peces juveniles (Boum et 1989; SCHAPEFICLALIS, 1954).
Control de la enfermedad
Para la prevención de la viruela de la carpa se han recomendado las siguientes medidas: separación de peces sanos y enfermos, mantenimiento del saneamiento en los tanques, eliminación de las condiciones que producen stress fisiológico y uso de híbridos seleccionados de peces (Boum et al., 1969; Mares et al, 1974; SCHAPERCLAUB, 1989).
Herpesvirus del rodaballo
El examen de rodaballos moribundos salvajes y cultivados de menos de un año reveló un gigantismo celular en piel y Mallas (Bucitallox, et al., 1978; Ricaoans, y BucHANAN, 1978). Cuando se observaron estas células gigantes al microscopio electrónico, se encontraron partículas semejantes a herpesvirus en el citoplasma y núcleo. Un estudio de individuos no afectados sugirió que la enfermedad vírica es endémica en Escocia El virus no ha sido aislado en cultivo celular.
Signos clínicos y cambios histológicos
Los peces afectados estaban letárgicos e inapetentes, pero por lo demás estaban sanos. La mortalidad rozó el 30% durante los seis meses siguientes al cultivo intensivo de alevines. Células epiteliales hipertrofiadas y ovoides fueron halladas primero en las agallas y en la piel de la superficie dorsal Las células afectarlas parecen derivar de las células de Malpigio. En infecciones severas de las agallas las lamelas adyacentes se fusionaban y las células de Malpigio de alrededor son hiperplásticas. No se observaron otros cambios patológicos en otros órganos o tejidos. Las células hipertrofiadas estaban formadas por fusiones celulares que creaban sincicios de 45 a 130 pm de diámetro. A pesar de que las células gigantes eran a menudo nuclearmente, los grupos de núcleos generalmente se fusionan para formar un único y enorme núcleo que ocupa casi el 90% del volumen celular. Además, se desarrollan inclusiones Feulgen-positivas en el citoplasma y núcleo. La microscopia electrónica reveló que las inclusiones osmofilicas del núcleo son distribuciones regulares de cápsulas semejantes a herpesvirus no envueltos y que el citoplasma estaba lleno de agregados de partículas víricas envueltas unidas a membranas.
Aislamiento e identificación del virus Los intentos para aislar el virus no han dado resultado y no estaban descritos intentos de transmisión experimental ( BUCHANAN y MADELEY, 1978). Se pueden detectar grandes acúmulos de virus en raspados de piel observados al microscopio electrónico. BucHANAN et al (1978) sugirió que la enfermedad era endémica de peces salvajes y que la infección vírica permanecía latente hasta que era activada por stress. Ricnsiws y BUCHANAN (1978) puntualizaron que el nivel de mortalidad en cultivos intensivos de peces fluctuaba considerablemente, pero que las muertes incrementaban a los cinco días después de algún tipo de stress, tales como transporte, fluctuación de la temperatura o cambios en la calidad del agua. La transmisión horizontal podría ocurrir bajo condiciones de cultivo intensivo cuando los peces son expuestos a los virus liberados de tejidos epidérmicos desprendidos de animales afectados (RacHARDs y BUCHANAN, 1978).
as microgranas electrónicas de cortes finos del virus muestran material de estructura indefinida entre la envoltura y la cápsida y dentro de la cápsida.
3.2. Biología, de los virus
La estructura y modo de replicación son las características fenotipicas primarias que sirvieron para ubicar diez virus de peces entre los herpesvirus.
El CCV ha sido el herpesvirus de peces más estudiado. Muchos detalles de su estructura molecular han sido definidos. De muchos herpesvirus de peces sólo se conocen algunos elementos rudimentarios de morfología, estabilidad y relaciones serológicas. De otros, como, por ejemplo, los herpesvirus del lucio, .smooth dogflsh», bacalao del Pacifico, y el rodaballo, tan sólo se ha estudiado la morfología al microscopio electrónico.
Morfología
La morfología de los herpesvirus es distintiva y, por tanto, es una de los criterios más útiles para la clasificación presuntiva. Los herpesvirus tienen una forma más o menos esférica y están compuestos de tres partes principales: un núcleo interno que contiene el genoma vírico, la cápsida icosaédrica que rodea el núcleo y la envoltura externa (figs. 5 y 6). El núcleo y la cápsida son ensambladas en el núcleo celular, y la cápsida contiene 162 capsómeros. La envoltura con peplómeros es adquirida por gemación a través de las membranas nuclear y celular. L
Fig. 5. Microfotografía electrónica de Herpesvirus salmonis. La partícula de la Izquierda retiene restos de la envoltura DE Wour et al. (1979): reproducido con permiso de la American Society for Microbiology.
Fig. 6. Microfotografía electrónica de lesiones de la pústula de la carpa de un Golden Ide• mostrando acumulaciones intranucleares de nucleoides encapsulados densos a los electrones (N) y cápsidas translúcidas (C) y virus intracitoplasmáticos envuelto& Barra = 200 nm. De McAtusma et al. (1985): reproducido con permiso de la Wildlife Disease Association.
Estos detalles ultra estructurales han sido descritos para los herpesvirus de peces, y las dimensiones y los componentes de los visiones están relacionados en el cuadro II. Como ocurre con otros virus con envoltura, las dimensiones de las partículas se ven afectadas por las técnicas preparativas: las preparaciones de virus teñidos negativamente muestran una mayor distorsión morfológica que las preparaciones de cortes ultrafinos.
Ácido nucleico vírico
Excepto para los herpesvirus del lucio, .srnooth dogfish., bacalao del Pacifico, y rodaballo, el ADN vírico se ha identificado presuntivamente por la inhibición de la replicación en cultivo celular ejercida por la 5-iodo-2'-desorluridina. El ADN del virión únicamente ha sido extraído del CCV y del Herpesvirus salmonis.
El ADN de Herpesvirus salmonis sedimenta a una densidad de 1.709 g/cm³ en gradientes de cloruro de cesio y tiene un contenido de guanina-citosina del 50% (Wou' et al., 1978). No se han descrito otras características del genoma de Herpesvirus salmonis.
El genoma de CCV ha sido el mejor caracterizado (CESRIAN et al., 1983; CHOUSTERNIAN et al, 1979; DIXON y FARSEE, 1977, 1980; Romí y RODB.101511, 1980a). El .ADN del virión es lineal, bicatenario, no fragmentado, con una longitud de 41 a 44 pm y un peso molecular de 84 ± 3 x 10 6 daltons. El ácido nucleico vírico sedimenta a una densidad de 1.715 Van en Sel y tiene un coeficiente de sedimentación de 53% y un contenido de citosina —guanina. del 58%. El genoma del CCV ha sido trinado por digestión con endonucleasas de restricción. El ADN del virión tiene una secuencia terminal redundante con un peso molecular de 12,3 x 10 6 daltons, pero no tiene ni secuencias repetidas invertidas ni permutaciones circulares del orden de secuencia de las bases. Por sedimentación diferencial, se pueden separar dos clases de ADN vírico intracelular: una fracción sobrenadante de 538, cuyo tamaño corresponde al del ADN del virión, y una fracción que sedimenta de ADN sin final que representa círculos multinuméricos de fusiones intergenómicas. El ADN «sin fin» podría estar implicado en la replicación del genoma (CEBRIAN et al., 1983).
Proteínas, lípidos y carbohidratos víricos
El análisis de las proteínas especificas del virus únicamente se ha descrito para el CCV. Basándose en la cinética de aparición, Dixox y FARBER (1980) identificaron 32 proteínas especificas del virus en células infectadas. Los pesos moleculares de las proteínas van desde 12.000 a 30.000 daltons. Dieciocho de las proteínas son componentes del virión. Resultados preliminares mostraron que las proteínas de 122.000 y 155.000 daltons son componentes de la nucleocápsida, y que las proteínas de 108.000 y 110.000 daltons están localizadas en la envoltura No se describieron otras relaciones estructurales.
Estudios cinéticos mostraron tres tipos distintos de patrones de síntesis de polipéptidos. Las proteínas de la clase A sólo son sintetizadas en la fase inicial de la infección. Las proteínas de la clase B se sintetizan tanto en la fase inicial como a través de todo el ciclo de replicación y la clase C, cuya síntesis se inicia tarde en el proceso de infección e incrementa fuertemente hasta que los viriones son liberados. Dixon y FARBER (1980) presentaron pruebas preliminares sugiriendo una regulación en cascada de la síntesis de proteínas de CCV. La síntesis de ciertas proteínas víricas seria necesaria para activar la síntesis de otras, y las proteínas de síntesis tardía podrían inhibir la síntesis de aquellas cuyas síntesis se inicia en las primeras fases de la replicación.
Las proteínas de síntesis temprana y tardía se podrían diferenciar por su dependencia de la síntesis de ADN. la síntesis de proteínas celulares es inhibida en las primeras fases de la infección, pero requiere síntesis de los dos tipos de proteínas para que la inhibición sea completa.
DIXON y FARBER (1980) calcularon que las 32 proteínas específicas del virus representaban tan sólo el 61% de la capacidad de codificación del ADN vírico.
No se ha descrito ningún lípido o carbohidrato asociado a los herpesvirus de peces.
Estabilidad vírica
La estabilidad de la infectividad de los herpesvirus de peces está afectada por la temperatura. y medio de suspensión del almacenaje. Cuando los virus están suspendidos en medios de cultivo que contiene del 2 al 10% de suero, hay poca pérdida de la infectividad a los 6 y 12 meses de almacenamiento a —80°C de los siguientes herpesvirus: CCV, Herpesvirus salmonis y OMV. A 4° C el CCV pierde el 50% de la infectividad en 4 semanas, el Herpesvirus salmonis pierde el 99,9% y el NeVTA pierde toda la infectividad. A temperaturas más altas o en la ausencia de medios salinos o suplementados con suero, la infectividad declina rápidamente. El CCV se inactiva con varios ciclos de congelación/descongelación, mientras que el Herpesvirus salmonis y el Herpesvirus vitreurn son más estables a la congelación/descongelación. Los herpesvirus de peces se inactiva por exposición al cloroformo, éter, glicerol, hipoclorito sódico, radiación ultravioleta, medio ácido (pH 3.0) y calor (60 a 60°C durante 30 a 60 minutos), (Kan et al., 1983; KIMURA et al., 1981a; Rosal y RODRIGUE, 1980b; WOLF, 1983).
4. Iridovirus de peces
Biología de las enfermedades
Virus de la linfocistis (o linfoquistis)
La linfocistis está. reconocida en todo el mundo y abarca al menos 125 especies de teleósteos pertenecientes a 42 familias y 9 órdenes (Arrogas y DARAI, 1985; LAwLER et al., 1977; HIGRELLI y RUCKUERI, 1988). La enfermedad se da en aguas frías, templadas y cálidas, y en ambientes de agua dulce, salobre y marina. Originalmente se creyó que las lesiones de esta enfermedad eran depósitos de huevos de helmintos o infestaciones de copépodos y esporozoos. WEISSENBERG (1914) y Josim (1918) propusieron que la linfocistis podía ser una enfermedad infecciosa de etiología viral. WEISSENBERG (1951) y Wois (1962) demostraron que el agente causal de la linfocistis era filtrable, y Woi et al. (1962) lo aislaron a partir de homogenados de tejidos.
Signos clínicos Los peces con linfocistis (fig. 7) desarrollan nódulos macroscópicos que primariamente se observan en la superficie del cuerpo, pero que pueden también pasar posteriormente a los órganos internos y tejidos (Dtácás y Lávriss, 1975; DUNRAR y WOLF, 1968; Rumí, 1974). Las lesiones tienen un color que va de crema a rosa o gris, dependiendo del epitelio que las cubre y del grado de vascularización de la lesión. Esta, según la especie hospedadora y las condiciones ambientales, puede tardar desde una semana hasta un año o más en desarrollarse Las lesiones nodulares están compuestas de una o más células que han incrementado en volumen 10 veces o más y han pasado de 0,3 a 2 mm o más de diámetro (Durniás y Wou, 1986; HowsE y CHRISTMAS, 1970; TEMPLEMAN, 1965). Las lesiones pueden desaparecer eventualmente dejando poca o ninguna evidencia de tejido cicatrizado.
La enfermedad se da en igual frecuencia en los dos sexos y en peces de todas edades, aunque la prevalencia en algunos casos es más alta en peces jóvenes.
Cambios citológicos e histológicos
La infección con el virus de la linfocistis causa una hipertrofia celular única y la enfermedad puede diagnosticarse por examen histológico (Duánáa y WOLF, 1966; LÓPEZ et al., 1969; MIDLIOE y MALSBERGER, 1968; NIGRELLI y RUGOIEB.I, 1965). La célula infectada (fig. 8) no se divide, pero tanto el núcleo como el citoplasma aumentan de tamaño con la infección. Los cambios degenerativos del núcleo incluyen condensación y fragmentación de la cromatina, y alargamiento, distorsión y disolución del nucléolos.
En el citoplasma agrandado se desarrollan cuerpos de inclusión Feulgen-positivos y puede haber filamentos semejantes a telas o cuerpos vacualares más densos, dependiendo de los hospedadores infectados (Wois, 1962). Asociados con los cuerpos de inclusión hay virus icosaédricos. A medida que la célula infectada se va desarrollando, se forma una gruesa cápsula hialina en la periferia Al menos parcialmente, la cápsula está compuesta de mucopolisacáridos ácidos sulfonados (HowsE y CHaisritAs, 1970; PRrrormw y MAISBERGER, 1968). La célula infectada está aislada por fibroblastos y en su periferia se acumulan células plasmáticas, linfocitos, macrófagos y leucocitos polimorfonucleares.
Aislamiento del virus e Identificación
El virus de la linfocistis replica en una serie de lineas celulares que todas ellas tienen morfología fibroblástica. La replicación vírica está descrita en lineas celulares de peces marinos (Crf, CyA-1, CyA-2, CyN-1, GF, SP-1, riñón de roncador (o burro) y aleta de «lane snapper.) y en líneas celulares de peces de agua dulce (BF-2, BF-W, LBF-1). Sin embargo, el virus no replica en las líneas BB, FHM, RTG-2 o células de ovarios de «bluegilla. (lhastrr et al., 1967; DURHAM y ANDERSON, 1981; LÓPEZ et 81., 1969; MIDDLEBROOKS et al., 1979, 1980, 1981; MIDLIGE y MALSBERGER, 1968; WALKER y HILL, 1980; Weartrox et al., 1977; WOLF, 1962; WOLF et al., 1966). Way y CARLSON (1965) compararon la replicación vírica y la formación de la lesión en “bluegills» infectados experimentalmente y encontraron que la curva de replicación vírica era paralela al desarrollo de la lesión (fig. 9).
Fig. 7. «Bluegill» extensamente Infectado por el virus de la linfocistis De Wois (1988); reproducido con el permiso de Academie Presa
Fig. 8. Microfotografía óptica de una célula de •Walleye• Infectada por el virus de la linfocistis. Las células están cortadas para mostrar la capa de células epiteliales que cubren a las células linfocisticas, las células linfocisticas literalmente hipertrofiadas, y la capa de substancia Melina que rodea a estas células. De YAMMEOT9 et al. (1978); reproducidas con el permiso del Minister of Sypply and Services of Canada.
La infección por el virus de la linfocistis puede ser diagnosticada por examen histológico. Se han detectado anticuerpos especificas del virus en el suero de animales infectados (RosEarrs, 1976; RUSELL, 1974) y se han preparado antisueros contra el virus en conejos. Sin embargo, no se ha intentado evaluar las relaciones antigénicas entre los varios aislados del virus de la linfocistis.
Transmisión
Las infecciones naturales del virus de la linfocistis parece que pueden tener su vía de entrada o por exposición de heridas al agua contaminada de virus o por ingestión de virus o células Infectadas
(Limas et al., 1974; 9113PITENS et al., 1970). Experimentalmente la linfocistis se ha transmitido por cohabitación, por exposición a aguas que contienen el virus, por alimentos contaminados, ya por lesiones, ya por homogenados de lesiones y por aplicación de homogenados de lesiones a las agallas o en zonas con desprendimientos de la piel.
Fig. 9. Curva de replicación del virus de la linfocistis en lesiones subdermices en «bluegill» pequeños a 25 ∓ 1°C. Los esbozos de células son proporcionales a los tamaños medios, y representan los estadios de desarrollo generalizados de células infectadas con virus de la linfocistis en «bluegill» bajo las mismas condiciones experimentales. De Wel, y Cenisou (1985); reproducido con el permiso de The New York Academy of atienes.
La enfermedad también ha sido transmitida por implantación subcutánea e intraperitoneal de lesiones y por inyección subcutáneas e intramuscular de homogenados de lesiones y medio proveniente de cultivos celulares infectados con el virus (Duma y WOLF, 1966; RASEN, 1927; Wou? et al., 1966, 1979). La linfocistis puede ser transmitida experimentalmente con relativa facilidad entre especies de un mismo género, pero con dificultad entre familias. Este grado de especificidad tan limitado puede ser un indicador de que existan varios tipos de virus de la linfocistis.
Control de la enfermedad
La linfocistis es una enfermedad de ámbito mundial en la naturaleza, crónica y no fatal. Las lesiones son de aspecto desagradable y afectan al mercado de los peces. En situaciones de cultivo, los peces portadores de lesiones deben ser eliminados para intentar controlar el reservorio de la enfermedad. BRASLEY et al. (1987) y LÓPEZ et al. (1970) demostraron que la droga antineoplásica 6-mercaptopurina inhibía específicamente la síntesis del virus y el efecto citopático en cultivo celular. Dichos autores utilizan también esta droga para controlar experimentalmente la enfermedad en los peces.
Virus de la necrosis eritrocitica, vírica
Se ha descrito una enfermedad eritrocitica de posible etiología vira]. en peces marinos, estuarinos y anadromos de Norte América y Europa. La enfermedad que originalmente se designó como necrosis eritrocitica piscina es ahora conocida como necrosis eritrocítica vírica o VEN (EvELYN y TRAME, 1978; Levan y araccx, 1969). Los eritrocitos afectados desarrollan una inclusión citoplasmática y otras alteraciones morfológicas y la microscopio, electrónica revela partículas icosaédricas intraeritrocíticas con ultraestructura de iridovirus.
El virus asociado con los eritrocitos infectados ha sido designado como virus de la necrosis eritrocitica (ENV) (McMnias et /11., 1980; ROHOVEC y AMAND1, 1981). Aunque el virus no ha sido aislado, la etiología vírica se basa en transmisiones experimentales de la enfermedad Degeneraciones eritrocitarias similares han sido observadas en varios vertebrados poiquilotermos y descritas como infecciones de protozoos de especies de Pirhemocyton, Toddia, Immanoplasma y otros (Jalamos, 1975; JOHNSTON y DAVIES, 1973). Las inclusiones y las partículas semejantes a virus de los eritrocitos de peces eran algunas veces descritas como semejantes en apariencia a Pirhemocyton (Arry et al., 1976; Jomismer y DAVIES, 1973; Luxa y Ettnnicx, 1969; Wancss, 1971).
Distribución geográfica y hospedadores la necrosis eritrocitica writa ha sido confirmada en especies de 23 géneros (Alosa, Anguilla, Brevoortia, Clupea, Gadus, Hemitripterug Zeistomu4 Limanda, Liparis, Macrozoarces, Melanogramus, Merlucciug Microgadus nroxocephalus Osmerus, Paralichtbys, Pholis, Pollachius, Pseudopleuronectes, Réga, Scophtalmus, Tautoga y Urophyscis) habitantes de la costa Atlántica de Norte América desde las Carolinas en Estados Unidos hasta Groenlandia (Kiwi y NEWMAN, 1982; LAIRD y Bumocx, 1969; PHILIPPON et aL, 1977; Raso et al, 1985; SHERBURia, 1977; SKORBURNE y SEAN, 1971; WALKER y Siaasmusis, 1977). La enfermedad ha sido confirmada en 3 géneros (aupea, Oncorhyncus y Salmo) del Pacífico noroeste de Estados Unidos y en 4 géneros (Blennius, Gadus, Mugil y Platichtl'zys) de las aguas del Atlántico europeo (Elms, 1984; EVELYN y TRAYLER, 1978; Joingsrox y DAVIES, 1973; RasovEc y AMANDI, 1981; atan. y EooLasrox, 1980a, b). Una enfermedad eritrodegenerativa en el pez gato del mediterráneo podría también ser VEN (JOHNSTON, 1975; JOHNSTON y DAVIES, 1973). La enfermedad ha sido experimentalmente transmitida en especies de Oncorhyncus, Salmo y Salvelinus (Bvays y Traxisa, 1978; Mclignass y MDCALRY, 1979). A pesar de que el virus puede ser experimentalmente transmitido en agua dulce, existen pocas presencias naturales en peces de agua dulce. Rosovzc y Ama.mi (1981) citan la VEN en larvas con saco vitelino y alevines de salmón chum y la implicación del virus de la VEN como causante de mortalidades en juveniles de salmón coho.
Signos clínicos
Existen muy pocos cambios clínicos asociados con infecciones moderadas de VEN. Peces afectados severamente aparecen con una pigmentación muy oscura y muestran signos de anemia severa y palidez de agallas y órganos Internos y valores de hematocrito muy bajos (Evival y flama, 1978; ~mas et al., 1980; PHILIPPON et al., 1977; SHERBURNE, 1973; Mama y SHERBURNE, 1977). La prevalencia en la naturaleza varía, pero puede llegar a un 100% en algunas poblaciones. Mortalidad atribuible a la VEN par se es baja, pero los peces afectados sucumben en infecciones bacterianas secundarias, generalmente vibriosis o la enfermedad bacteriana del riñón (EvELyw y TRAICl2R, 1978). MCMILLAN et al. (1980) encontraron que salmones chum infectados sufrían una mortalidad tres veces superior de vibriosis que los nos infectados, una tolerancia a falta de oxigeno inferior, y una disminución de la capacidad osmoreguladora. En contraste, RENO et al. (1985) demostraron una alteración en la osmorregulación no significativa en el bacalao y la pinchagua, pero sugirieron que los bacalaos infectados por VEN podían tener más dificultad en superar situaciones de stress.
Cambios histológicos y hematológicos
Exámenes histológicos revelaron una hiperactividad mitótica en el tejido hematopoyético renal compatible con eritroblastosis, pero no se observaron anomalías en otros tejidos. Los mayores cambios patológicos están confinados a los eritrocitos (Am et al., 1976; EVELYN y TRAXLER, 1978; JOHNSTON y N1CHOLSON, 1981; RENO et al., 1978; ROHOVEC y AMAND1, 1981; SHERBURNE, 1973; WALKER y SHERBURNE, 1977). Los cambios degenerativos intracitoplasmáticos e intranucleares ocurren tanto en los eritrocitos maduros como inmaduros. En algunos casos estaba virtualmente infectado el 100% de los eritrocitos. Los eritrocitos afectados generalmente desarrollan una morfología redondeada e irregular y son más frágiles (fig. 10). El citoplasma contiene una única (raramente múltiple) inclusión amorfa de 0,3 a 4 pm de diámetro (las mayores inclusiones se dan en las células inmaduras), y algunas veces se observa también una vacuolización citoplasmática marcada El núcleo desarrolla una morfología irregular atípica y se halla algunas veces desplazado. la membrana nuclear permanece intacta, pero la cromatina se acumula en la periferia, creando la apariencia de una pseudovacuola intranuclear. McMiLLAN et al. (1980), RENO y bizcamos (1981), RENO et al. (1978) y ~tea y SF1ERBURNE, (1977) describieron la apariencia de una inclusión intranuclear. Los parámetros hematológicos varían según la especie (EVELYN y TRAXIER, 1978; MacMILLAN et al., 1980; RENO et al., 1985). En general, se observa una bajada del hematocrito y recuento de eritrocitos acompañada de una eritroblastosis compensatoria En algunas ocasiones disminuye también la concentración de hemoglobina y los electrolitos plasmáticos. Rimo et al. (1986) estudiaron los enzimas eritrocitarios y niveles de ATP y proteínas plasmáticos en bacalaos, arenques y pinchaguas infectados por VEN. Encontraron cambios según la especie infectada en la síntesis de ATP y glucosa-6- fosfato, y en la actividad de los enzimas lactato deshidrogenasa y citrato sintetasa, pero los cambios fueron no significativos en el nivel de proteínas plasmáticas. RENO et al. (1985) concluyeron que los cambios fisiológicos relacionados con la VEN podían representar respuestas adaptativas a la infección y que podían estar afectadas por distintas presiones ambientales.
Fig. 10. Preparaciones tenidas con Glemsa de eritrocitos Infectados por el virus de la necrosis eritrocitica La fecha señala la inclusión citoplasmática la fotografía es cortesía de B. NICHOU3ON.
Detección vírica
Los eritrocitos afectados son reconocidos en preparaciones teñidas de Giemsa y confirmados por microscopia electrónica El VEN no ha sido todavía* aislado en cultivo celular. EVELYN y TRAXLER (1978) intentaron aislar el virus a partir de filtrados de riñón y bazo de salmón chum y salmón rosado. El filtrado que contenía los virus fue inoculado en las siguientes lineas celulares: CHSE-214, FRIA, RTG-2 y células de ovario de trucha arco iris e incubados a 8 y 15°C durante 3 semanas, pero no se observaron efectos citopáticos. Smail intentó aislar el virus de eritrocitos de «blenny» Usados sobre cultivos primarios de ovario de barbada (aun., 1982). Estos intentos fallidos lo fueron probablemente debido a la utilización de células inapropiadas para la replicación de un virus específico de eritrocitos. RENO y N'emisora (1980) mantuvieron eritrocitos infectados in vitro durante un tiempo superior a 2 semanas. Se evidenció replicación en la sangre periférica, pero los intentos de infectar eritrocitos in vitro no tuvieron éxito. La infección podría ocurrir en los estadios tempranos de la eritrogénesis.
Transmisión
Los eritrocitos afectados son reconocidos en preparaciones teñidas de Giemsa y confirmados por microscopia electrónica El VEN no ha sido todavía* aislado en cultivo celular. EVELYN y TRAXLER (1978) intentaron aislar el virus a partir de filtrados de riñón y bazo de salmón chum y salmón rosado.
El filtrado que contenía los virus fue inoculado en las siguientes lineas celulares: CHSE-214, FRIA, RTG-2 y células de ovario de trucha arco iris e incubados a 8 y 15°C durante 3 semanas, pero no se observaron efectos citopáticos. Smail intentó aislar el virus de eritrocitos de «blenny» Usados sobre cultivos primarios de ovario de barbada (aun., 1982). Estos intentos fallidos lo fueron probablemente debido a la utilización de células inapropiadas para la replicación de un virus específico de eritrocitos. RENO y N'emisora (1980) mantuvieron eritrocitos infectados in vitro durante un tiempo superior a 2 semanas. Se evidenció replicación en la sangre periférica, pero los intentos de infectar eritrocitos in vitro no tuvieron éxito. La infección podría ocurrir en los estadios tempranos de la eritrogénesis.
Transmisión
Aunque el virus no ha sido aislado la enfermedad de la VEN ha sido transmitida experimentalmente. Nicraoisora y Rimo (1981) transmitieron la enfermedad al bacalao atlántico por inyección intraperitoneal de eritrocitos de bacalao infectados. EVELYN y TRAxLER (1978) transmitieron la VEN a salmones chum y rosados por inyección intraperitoneal de filtrados (0,45 jan) de homogenados de riñón y bazo de salmón chum y arenque del Pacifico infectados. La inyección de filtrados calentados (60°C durante 15 minutos) no indujo la enfermedad. Mataba' y MUCALHY (1979) transmitieron la VEN a 10 especies de salmónidos por inyección intraperitoneal de filtrados de eritrocitos Usados y a 2 especies por inmersión. Observaciones empíricas y algunos resultados experimentales indican que los peces jóvenes son más susceptibles a la infección que los adultos.
El mecanismo de transmisión en condiciones naturales se desconoce. SuAn, (1982) sugirió que el stress podía activar infecciones latentes, exacerbar las infecciones existentes o reforzar la transmisión a través del agua. SHERBURNE (1977) citó el hallazgo de la VEN en pinchaguas anadromos en pre y post•puesta, pero no en juveniles en agua dulce. ROHOVEC y AMANDI (1981) citaron la presencia de la VEN en salmones chinook y coho y trucha arco iris en época de puesta, y sugirieron que el virus podía ser transmitido verticalmente debido a que la VEN era detectada en larvas y alevines de salmón churo. EVELYN y TRAXLER (1978) sugirieron que la enfermedad probablemente se adquiría en ambientes marinos, y SMAIL (1982) propuso la transmisión del virus por un ectoparásito suctor de sangre tal como un piojo del salmón (Lepeophtheirus sp) o el gusano de las agallas (Salrnirubola sp).
Iridovírus de la anguila japonesa
Signos clínicos y transmisión
SoanLAem y rama (1982) y SORIMACHI describieron el aislamiento y patogenicidad de un iridovirus de anguilas japonesas cultivadas en estanques en la prefectura de Shizuoka (Japón). Los ensayos de transmisión demostraron que la infección letal ocurría en todos los grupos de edad de las anguilas japonesas, pero no en las europeas. Las anguilas tienen infectadas por inyección intramuscular e intraperitoneal y por inmersión. Las anguilas infectadas tomaban un color brillante y mostraban congestión de las aletas e incremento de la superficie mucosa a los 3-5 días después de la infección. Durante las dos primeras semanas se observó de un 40 a un 76% de mortalidad a temperaturas de 14,5 a 18,6°C, 15% a 22,8°C y no había mortalidad a 24,1°C.
Detección vírica
Un iridovirus era uno de los varios virus aislados de los riñones de anguilas japonesas y europeas durante el seguimiento de una enfermedad. Homogenados de órganos filtrados (0,45 pm), eran inoculados sobre las células RTG-2 y EPC. El iridovirus fue aislado de anguilas japonesas en las dos lineas celulares. SORIMACHI y Eousa (1982) determinaron que el aislado era un virus de ADN, icosaédrico sin envoltura, y SORIMACID (1984) observó que el tamaño del virus era de 180-205 nm en diámetro. El virus se inactivaba por exposición al éter, cloroformo y ácido (pH 3) y por calentamiento a 60°C durante 30 min.
Virus de la necrosis de las agallas de la caspa
La necrosis de las agallas es una seria enfermedad que padecen las carpas de Europa y Rusia La causa de la enfermedad es incierta, pero se debaten posibles etiologías víricas y ambientales. POPKOVA y SHCHELKUNOV (1978) aislaron un virus de carpas enfermas (presumiblemente carpas comunes) y SHCHELKUNOVA (1984) caracterizó al agente como un iridovirus.
Signos clínicos y cambios histológicos
Cambios clínicos e histopatológicos están asociados con la necrosis de las agallas de la carpa (KovAcs-GAvzs, 1984).
Inicialmente las agallas aparecen edematosas y con moderada hiperplasia, acumulación de granulocitos, degeneración del epitelio y adhesión de las lamelas. Posteriormente, la hiperplasia va aumentando; hay necrosis local, hemorragias, y se produce una proliferación y degradación de las células mucosas seguido de una necrosis generalizada y una invasión secundaria de bacterias, hongos y parásitos.
SHCHELKUNOV y SHCHELKUNOVA (1984) intentaron inducir experimentalmente la necrosis de las agallas en la carpa aplicando virus crecidos en cultivo celular a abrasiones de las agallas o inoculándolos intraperitonealmente, pero los resultados no liaron concluyentes. Se observaron cambios necróticos característicos de las agallas en un grupo de peces que murió después de una inoculación intraperitoneal, pero a la vez se observaron cambios degenerativos del hígado. Pasajes seriados del posible virus de la necrosis de las agallas por peces no resultó ni en la aparición de la sintomatología ni en el reaislamiento del virus.
Iridovirus del síndrome ulceroso ( =ulcus) del bacalao
El síndrome ulceroso es una enfermedad infecciosa que ocurre principalmente en bacalaos de 1 y 2 años de la región de la costa Báltica de Dinamarca.. Las lesiones papulo-ulcerativas se encuentran básicamente en las superficies laterales del cuerpo. Las lesiones son más frecuentes durante el verano y otoño temprano, y la desaparición de las lesiones se observa principalmente en el otoño tardío cuando la temperatura del agua alcanza los 7°C. JENSEN Y LARSEN (1979) documentaron el progresivo desarrollo de las lesiones de la piel desde las múltiples erupciones papulo-vesiculares de 2-8 mm de diámetro hasta enormes ulceraciones de 2-8 cm de diámetro y finalmente se transforma en áreas de despigmentación hasta sanar. Los cambios histopatológicos aparecen inicialmente como pérdidas severas de tejido conectivo, edema en la epidermis y dermis, necrosis e infiltración celular de la musculatura subyacente antes de sanar. JENSEN y LARSEN (1982) sugirieron que el stress ambiental podía ser un factor decisivo en el desencadenamiento de brotes del síndrome ulceroso.
Aislamiento vírico y transmisión
Jimia et al. (1979) aislaron un iridovirus y un rabdovirus de bacalaos con el síndrome ulceroso. El iridovirus fue aislado en el tercer pasaje de papillas homogeneizadas inoculadas sobre las células EPC. El virus no se pudo aislar a partir de órganos internos Las partículas de iridovirus se disponían en el citoplasma y gemaban de la membrana celular, según micrografias electrónicas, de cultivos celulares infectados; no se observó virus en los tejidos de las pápulas. A 15°C el título viral alcanzado es de 10 TCID en las células EPC; en cambio, prácticamente no replica en las células PS. El caso contrario sucede para los cultivos celulares infectados por el rabdovirus. El síndrome ulceroso fue experimentalmente transmitido por cohabitación y aplicando homogenados de pápulas a lesiones de la piel (Jura= y LAMEN, 1982). La transmisión es variable en la inoculación intraperitoneal de homogenados de pápulas y no se consiguió la transmisión por inoculación intranasal. El síndrome ulceroso puede ser inducido por iridovirus crecidos en cultivo celular mediante inoculación intracarclíaca e intraperitoneal. Debido a que los estudios de transmisión fiaron hechos con animales salvajes capturados y que los intentos de reaislar el iridovirus de los peces infectados experimentalmente fallaron, la etiología varal del síndrome ulceroso no ha sido concluyentemente establecido.
4.1. Biología de los virus
La caracterización de los iridovirus de peces ha estado generalmente limitada a la definición de la morfología y propiedades biológicas rudimentarias. No se han definido relaciones serológicas para ninguno de los iridovirus de peces. El virus de la linfocistis ha sido el foco de investigaciones para caracterizar el ácido nucleico y las proteínas víricas, y las diferentes cepas del virus se han identificado basándose en diferencias en los perfiles de ácidos nucleicos y proteínas. La caracterización del virus de la necrosis eritrocítica ha sido limitada, puesto que el virus no ha sido aislado en cultivos celulares.
Morfología
Los iridovirus tienen cápsida de simetría icosahédrica y replican en el citoplasma Si bien los iridovirus de peces comparten estas características básicas, varían considerablemente en las dimensiones de la cápsida y el núcleo (cuadro III). Asimismo se han descrito variaciones en la estructura de la cápsida y otros detalles ultraestructurales. El virus de la linfocistis y el VEN muestran una gran diversidad tanto en las dimensiones de la ~sida como en el espectro de hospedadores. Microfotografías electrónicas muestran que, en general, la capa externa de la cápsida de los iridovirus de peces tiene 2 ó 3 capas con una anchura total de 11 a 40 nm y que está separada del nucleoide central por una zona translúcida a los electrones (figs. 11 y 12). La cápsida está compuesta de suburudades globulares (BrriuAumz et al., 1984; MADELEY et a/., 1978). Se han descrito variaciones en la apariencia del nucleoide: nucleoides uniformes en cuanto a densidad, estructuras parecidas a anillos, y nucleoides filamentosos, que podrían reflejar diferentes estadios de la maduración del virus (LANGDON et al., 1986; MADELEY et al., 1978; RENO y NICHOLSON, 1981; SCHCHELKUNOV y SCHCHELKUNOVA, 1984; YA1dAMOTO et 1976)
Las cápsidas y potenciales intermediarios en el desarrollo de la misma aparecen junto a un viroplasma amorfo que probablemente corresponden a la inclusión citoplasmática vista al microscopio óptico (DoLowy et al., 1976; !loca et al., 1976; RENO et al., 1978). ROBEN y BERTHIAUME (1981) purificaron posibles nucleoides y viriones maduros de células infectadas con virus de la linfocistis. Los viriones encapsulados intracelulares de algunos iridovirus de peces aparecen contiguos, mientras que otros aparecen separados y como embebidos en una matriz (figs. 11 y 12) (RENO et at, 1978; WALKER y SHERBURNE, 1977; YAMAMOTO et 1976).
Asimismo, se han visto virus madurando por gemación a través de membranas citoplasmáticas, otros son probablemente liberados al exterior por degradación de la célula infectada y otros no han sido vistos extracelularmente (amor et al, 1983; JEME)! et al., 1979; LANGDON et al., 1986; SMAIL, 1982). En preparaciones teñidas negativamente del virus de la linfocistis se pudieron observar filamentos que se extienden hacia fuera de los vértices de la cápsida (Mmuss y ~BERGER, 1986; ZWIIIMIBERG y WOLF, 1968). Estructuras filamentosas similares han sido descritas en diferentes iridovirus de insectos (GoossA y GRANOFF, 1979).
Ácido nucleico vírico
Los iridovirus tienen un genoma de ADN lineal de doble cadena. Estas características han sido determinadas en un único iridovirus de peces, el virus de la linfocistis. Para todos los iridovirus de peces, excepto el de la VEN y el virus del síndrome ulceroso del bacalao, la composición del ácido nucleico se ha identificado presuntivamente basándose en la inhibición de la replicación del virus y de la formación de cuerpos de inclusión en cultivos celulares por desorturidinas halogenadas
Fig. 11. Fotograba al microscopio electrónico de vi•lorli de la necrosis eritrocitica que muestran la espoleta hexagonal y el nucleoide en forma de donut la barra representa 500 nm. De Bao et al. (1978); Reproducida con el permiso del Miruster of Supply and Services of Canada.
Fig. 12. Microfotografía electrónica de un ultracorte de una Mula infectada con virus de la linfocistis mostrando el típico virus de la linfocistis en el citoplasma. Esta fotografía muestra la capa fibrosa que rodea la. capsida la barra representada 1.0 pm. El añadido muestra virus de la linfocistis seccionados con partículas de latex de 285 nm de diametroi la barra representa 1.0 pm De YAMAIICTO et al. ( 1978): reproducido con permiso de el MinLster of Supply Services of Canada.
(Bsarty et al., 1983; LANGDON et al., 1988; MIDI1GE, 1968; ScucaEucuwov y SCHCHELKUNOVA, 1984). Tinciones citoquimicas, incorporación de timidina y datos autoradiográficos han demostrado que las inclusiones citoplasmáticas inducidas por el virus contienen ADN.
RENO y NICROLSON (1980) midieron 19, incorporación de timidina «in vitro» en eritrocitos de bacalao infectados y no infectados.
No se observó incorporación apreciable de timidina en eritrocitos no infectados durante los 12 días del cultivo. Por el contrario, la incorporación de timidina en eritrocitos infectados con virus de la gilV incrementó casi 8 veces durante el primer día y casi 10 veces hasta el sexto día para declinar durante los días 7 al 12. Raso y Nicsoraox (1980) llegaron a la conclusión que la incorporación de timidina indica que el metabolismo de la célula hospedadora es redirigida hacia la producción de componentes inducidos por el virus.
ANDER8 y DARAI (1985), DARAI et al. (1983) y Perú et al (1983) han determinado algunas características biofísica del .ADN del virus de la linfocistis. ROBEN et aL (1983) encontraron que el virus de la linfocistis de los centrárquidos, purificado del medio de cultivo celular, está compuesto de un 1,6% de ADN, un 42,3% de proteína, un 17,1% de lípido (principalmente fosfolipido) y un 39% de componentes no identificados, de los cuales los glúcidos podrían constituir la parte más importante. ANDER8 y DARAI (1985) y DARAI et al. (1983) caracterizaron .ADN del virus de la linfocistis purificado de lesiones de tres géneros de pleuronéctidos: platija, solla y barbada Los ADN's son heterogéneos en tamaño. La longitud es de 49+23 Ritma y el peso molecular de 93 + 44 x 106 daltons. La estimación del peso molécula', por análisis con endonucleasas de restricción es de 64,8 x 10° deltona Por desnaturalización y posterior reasociación se forman moléculas circulares de 34,25 pm de longitud y un peso molecular de 66,25 x 10° daltons. El .ADN del virus de la linfocistis parece, por tanto tener secuencias repetidas en ambos extremos, ser redundante terminantemente y tener citosina metriada. El examen de los fragmentos generados por digestión con enzimas de restricción muestran que los ADNs del virus de la platija y la solla son idénticos, pero ambos son claramente distintos de la barbada Estos resultados sugieren que existen diferentes cepas o tipos del virus de la linfocistis, conclusión apoyada por los resultados del estudio de proteínas estructurales realizado por anon et al. (1982).
Proteínas víricas
Las proteínas estructurales del virus de la linfocistis han sido estudiadas por Finan et al. (1982) y Bonn et al. (1983, 1984). FLUGEL et a1. (1982) purificación virus de lesiones de platija, solla y barbada. Por electroforesis en geles de poliacrilamina se distinguen 33 proteínas con pesos moleculares desde 14.000 a 22.000 daltons. Se observa un marcado cambio en la síntesis proteica cuando se analizan células infectadas y no infectadas. El número de proteínas observadas en las preparaciones de virus purificados es considerablemente mayor que el número de proteínas descrito para iridovirus de insectos, plantas y mamíferos (Goma y GRANOFF, 1979). Roma et al. (1983) señalaron que el virus de la linfocistis de centrárquidos contienen un 42,3% de proteína En geles de poliacrilamina de virus purificados de medio cultivo celular se observan 22 proteínas cuyos pesos moleculares van desde 30.700 a 210.000 daltons (Roana et aL, 1984). Con experimentos de iodinación se ha podido comprobar que 4 de las proteínas son de la superficie del virión, mientras que 7 son internas. El número de proteínas y la distribución de pesos moleculares descritos por Rosca et al. (1984) es similar a los de algunos iridovirus de anfibios e insectos (Gooniut y GRANOFF, 1979).
Aunque se encuentran componentes lipídicos, y presuntamente glucídicos asociados al virus de la linfocistis, no se ha determinado su relación con las proteínas estructurales (Rosca et al., 1984). Sin embargo, el componente lipídico es esencial para la infectividad.
Estabilidad vírica
Los iridavirus de peces se inactivan frente a la exposición a éter o cloroformo, calor (56 a 60°C) y pH (3). Son progresivamente inactivados por sonicación, pero son estables a múltiples ciclos de congelación/descongelación. La infectividad puede ser detectada después de prolongados períodos de almacenamiento. ScHataximov y SCHCHELKONOVA (1984) hallaron que el virus de la necrosis de las agallas de la carpa suspendido en medio de cultivo celular no perdía infectividad durante su almacenamiento a —20°C durante 3,5 años, que una infectividad residual podía ser detectada después de 3,5 años a 4°C y que el 90% de la infectividad era perdida en 10 años a 27°C. El virus de la linfocistis es muy estable bajo una gran variedad de condiciones de almacenamiento. WOLF et al. (1979) recuperaron niveles significativos de infectividad a partir de tejidos infectados secados durante 18 años sobre P205 a 4°C, a partir de homogenados de lesiones liofilizados y mantenidos durante 13,5 años a 4°C, y a partir de lesiones y homogenados de lesiones mantenidos durante 20 meses a —20°C. Se detectó infectividad residual en algunos tejidos lesionados simplemente mantenidos desecados durante 15 años a 4°C. El título del virus de la linfocistis suspendido en medio de cultivo celular decrece 10' TCII:0 en 1,4 años a —70°C y 48 semanas a 4°C.
5. Birnavirus de peces
Varios virus de la necrosis pancreática infecciosa de peces, virus de la infección de la bursa de los pollos, el virus X de la mosca del vinagre (Drosophila melanogaster), el virus de la Tollina y a virus de mariscos marinos fueron formalmente catalogados como semejantes a reovirus o como virus no clasificados. Dolos et al. (1979) demostró que estos virus mostraban características bioquímicas y biofisicas similares y sugirieron que podían ser considerados como un nuevo grupo taxonómico, más tarde conocido como el grupo de los birnavirus. Los birnavirus son virus sin envoltura, con una sola cápsida icosaédrica de aproximadamente 60 nm de diámetro. Los viriones tienen ARN como ácido nucleico y una polimerasa ARN dependienta además, son los únicos que tienen genoma de ARN bicatenario bisegmentado.
5.1. Biología de las enfermedades
Virus de la necrosis pancreática infecciosa
La enfermedad conocida como la necrosis pancreática infecciosa (IPN) fue probablemente descrita por primera vez por M'GONIGLE (1941) como una enteritis catarral aguda y que atribuyó a factores nutricionales. WooD et al. (1955) determinaron que la enfermedad era infecciosa, y propusieron una etiología viral, aunque no fue probada hasta 1960 (SNmszxo et al., 1959; WOLF et al., 1960).
El virus de la IPN está reconocido como el prototipo de los birnavirus de peces (DoBos et al., 1979). Desde su aislamiento de truchas enfermas hace 30 anos se han aislado una extensa variedad de virus IPN e «IPN-like» de salmónidos y no salmónidos, y de mariscos. El término de birnavirus acuáticos se emplea para describir colectivamente los muchos virus aislados y abarcar su diversidad de hospedadores y patogenicidad. Los aislados son clasificados como IPN o «IPN-like» según su relación antigénica a los serotipos de los virus clásicos IPN, y según su patogenicidad para salmónidos. Esto ha hecho tender a la confusión de distinguir al IPN como un virus patógeno de salmónidos per se. El virus IPN está presentado aquí en el sentido clásico de agente causal de una enfermedad en peces salmónidos jóvenes.
También se describe la enfermedad clínica causada por el virus y las características serológicas de virus aislados de peces no salmónidos, y de moluscos y crustáceos marinos.
Hospedadores y distribución geográfica
Los primeros aislamientos del virus IPN fueron de trucha salvelinus (Wou et al., 1960). El virus IPN y los semejantes a IPN han sido aislados de al menos 63 especies de peces y mariscos (cuadro IV). Los aislamientos de peces salmónidos han sido descritos por BELLET (1969), DORSON (1983), Hin (1982), LJUNGBERG y JORGENSEN (1973), MACKELVIE y ARTSOB (1969), MCALLISTER (1983), MCALLISTER y REYES (1984), MCMICHAEL et al. (1973), MuNBc y DUNCAN (1977), PARISOT et al. (1963), SANO (1973), SWANSON y GIILESPIE (1979) y WOLF y PETriJoHIN- (1970). Los aislamientos del virus IPN y aIPN-like» de peces no salmónidos han sido descritos por ADAIR y FERGUSON (1981), AHNE (1977b, 1978), BONAMI et al. (1983), CASIRIC y CHASTEL (1980), DORSON (1983), HAH et al. (1984), HEDRICK et al. (1983a, b, 1985a, 1986a), Hin (1982), MCALLISTER (1983), MCALLISTER et al. (1984), MUNRO et al. (1976), SANo (1976), SANO et al. (1981), Scmrrz et al. (1984), SORIMACHI y HABA (1985), SONSTEGARD et a/. (1972) y STEPHENS et al. (1980). Boyo et al. (1984), Hitt (1976a„ b, 1982) y UNDERWOOD et aL (1977) describen aislamientos de virus IPN e .IPN-like• de mariscos marinos. Los virus IPN e «IPN-like» están distribuidos por todo el mundo. Los aislamientos han sido descritos en Norteamérica (Canadá y Estados Unidos), en América del Sur (Chile), en la mayoría de países de Europa del Este y Oeste y en Asia (Japón, Korea, Taiwán y Tailandia).
Signos clínicos y cambios histológicos
En los salmónidos la infección aguda se da en peces de 1 a 4 meses de edad y puede resultar en una mortalidad acumulativa de hasta al 100%. Peces de 6 meses o más pueden desarrollar síntomas subclinicos o infecciones inaparentes, pero sin producirse pérdidas significativas. Los brotes de enfermedad en peces de mayor edad implican portadores de virus que generalmente son activados por el stress. Los signos clínicos no pueden ser usados para distinguir el IPN de otros virus de enfermedades de salmónidos. Las larvas y alevines afectados aparecen pigmentados de color oscuro, exhiben exoftalmia, distensión abdominal, falsas defecaciones mucosas y natación errática girando alrededor de su eje longitudinal o dando vueltas violentamente. Internamente, el hígado y bazo aparecen pálidos y el estómago e intestinos están vacíos de comida, pero llenos de fluido mucoso. Se observan hemorragias petequiales en los tejidos pancreático y pilórico y los valores de hematocrito son muy bajos. Durante la infección con el virus de la IPN se pueden observar cambios patológicos de los tejidos pancreático, hepático y renal y también de la mucosa intestinal Las células pancreáticas acinares y ocasionalmente los islotes sufren masivamente una necrosis que se caracteriza por pignosis, cariorresis e inclusiones intracitoplasmáticas (Kuno et al., 1973; MolOnoirr y ROBERTS, 1976; Woon et al., 1955; Yasursitz, 1970).
El píloro, el ciego pilórico y el intestino anterior muestran una necrosis extensiva. El desprendimiento del epitelio intestinal, junto con un exceso de mucus, hacen que se forme un exudado mucoso blanquecino (MulOnotrr y ROBERTS, 1976). También se pueden dar cambios degenerativos del tejido hematopoyético renal, en el renal excretor y en el hígado (asaz y de Kuncatur, 1965; Kuno et al., 1973; SANO, 1971a, b; Wou' y Quillay, 1971). Los tejidos pancreático y hepático se hallan infiltrados de macrófagos y leucocitos polimorfonucleares (Kuno et aL, 1973; SwaesoN y Chussra, 1979). La microscopia electrónica revela partículas víricas en los tejidos pancreático, hepático, renal y esplénico (Kuno et aL, 1973; L'onza y Pon 1969; Muicatrr y Parra, 1976; Maullara, 1975c).
En peces no salmónidos los virus IPN y .IPN-like»han sido generalmente aislados de peces que no mostraban signos clínicos. Sin embargo, representan una notable excepción los virus aislados de la branquionefritis de las anguilas, de la «spinning disemia» de la lacha, y de ascitis víricas en seriola. En otros casos los virus IPN e «IPN-like, han sido aislados en asociación con. enfermedad, pero no se ha probado que sean la causa de la enfermedad; por ejemplo, la mortalidad epizoótica en lubinas americanas en cultivo (Sourrz et aL, 1984) y lubinas (Bortami et al., 1983), muerte de platija de California, «hogehoker», ‹Arlantic silverside» y «spot» salvajes (McArtisrza et al., 1984), mortalidad crónica en empines dorados cultivados (Hall et aL, 1984; HEDRICK et aL, 1985a) y la enfermedad de la úlcera en góbidos de la arena cultivados (Hznaicx et al., 1986a).
Sano (1976) y SANO et al, (1981) describieron los signos clínicos de la branquionefeitis o enfermedad tirita del riñón en anguilas europeas y japonesas. Las anguilas afectadas desarrollan rigidez corporal, abdomen retraído y congestión o hemorragias petequiales difusas en las agallas y la superficie ventral del cuerpo y la aleta anal. Internamente, el intestino está vacío de comida, la cavidad del cuerpo contiene escala y el riñón está algo hipertrofiado. Los cambios histopatológicos incluyen hiperplasia, fusión y colapsamiento de las agallas, nefritis glomerular, degeneración hialina en las células epiteliales de los túbulos renales y niveles variables de necrosis en el hígado, bazo, tejido linfoide y elementos renales. La enfermedad pudo ser experimentalmente reproducida en las anguilas, pero no en la trucha arco iris.
Stephens et al. (1980) aislaron el virus de la IPN de lachas con «spinning disease». Los peces afectados toman un color oscuro y nadan de forma errática y descoordinada.
Se desarrollan hemorragias en la base de las aletas, en los ojos y a lo largo del cuerpo. Internamente, el bazo y los vasos del cerebro están congestionados y algunas veces se desarrollan hemorragias en el lumen del intestino. Las lesiones histopatológicas incluyen necrosis focal, pignosis y desprendimiento de la mucosa del duodeno y el ciego pilórico, inflamación del tejido adiposo, necrosis focal del páncreas exocrino y las glándulas del estómago y una débil meningitis y edema y lesiones focales de desmielización en el cerebro (M. W. ~LAN, comunicación personal).
La enfermedad puede ser transmitida experimentalmente a lacha y trucha salvelinus. EGUSA y SORIMACHI (1986), FUJIBIAICE et al. (1986), Mnrazam (1985) y SOIUMACHI y Haca (1986) describieron una enfermedad llamada ascitis víricas en las seriolas. La enfermedad causa altos niveles de mortalidad en larvas y alevines de seriola cultivados en tanques y estanques en varias provincias de Japón. Los peces afectados presentan distensión abdominal, agallas pálidas y comportamiento quiescenta Internamente, la cavidad del cuerpo se llena de ascitis claros o teñidos de sangre; habían hemorragias evidentes en el hígado, ciego pilórico y estómago, y los riñones y bazo palidecen. El examen histológico muestra necrosis difusa y focal en las células parenquimatosas del hígado, células atinares pancreáticas, células de los túbulos renales, en la pulpa esplénica y arterias, degeneración del epitelio intestinal y edema del bazo y submucosa del estómago. La microscopia electrónica muestra acumulaciones de virus en los hepatocitos y células atinares pancreáticas. La enfermedad fue experimentalmente transmitida a la seriola
La evidencia de la virulencia de los virus IPN e «IPN-like« de moluscos y crustáceos marinos es muy limitada. Hui (1976a, b, 1982) y UNDEftw000 et al. (1977) describieron el aislamiento y caracterización de varios virus IPN-like de mariscos. La infección experimental de ostras (Ostrea edulis) y el molusco bivalvo (Tenias tenuis) inducía cambios patológicos en la glándula digestiva que incluían edema, infiltración de hemocitos y necrosis del tejido conectivo. La infección experimental de varios crustáceos con un virus «IPN-like» de cangrejos mostró que el virus podía ser recuperado durante varias semanas después de la inoculación inicial. Los ensayos de virulencia no han sido descritos para virus .IPN-like« aislados de la gamba Kuruma (Boyo et 1984).
Aislamiento del virus e identificación
Una gran variedad de líneas celulares tanto de salmónidos como no salmónidos y condiciones experimentales han sido utilizadas para aislar los virus IPN e .IPN-like» (Aorus et 1982, 1983; ARAK&WA et al., 1985; Department of Fisheries and Oceans, 1984; Hzmucx et al., 1986a, c; Hiu., 1978a; McAmians et al., 1987; Ovaisto et al., 1985; Swassos y GILLESPIE, 1982; WOLF y MANN, 1980; WOLP y QInMBY, 1973; Yu et al., 1982). Incubaciones prolongadas y varios pasajes pueden ser necesarios para aislar los virus IPN o •IPN-like» y la autointerferencia puede afectar adversamente el aislamiento del virus (Magua): y DEXTER, 1975; STEPRENS et al., 1980; YA/ángaro, 1974).
El titulo viral en los especímenes clínicos puede ir desde 1 UFP/ml en portadores del virus a títulos superiores a 10' UFP/ml en ejemplares en fase aguda de infección. Los virus se recuperan a partir de órganos internos más frecuentemente que de los productos sexuales, heces o lavados peritoneales (Bala y WOLP, 1969; Fruarrat y &IVAN, 19718; SWANSON y GILLESPES, 1979; WOLP et al., 1963, 1968b; Maullar°, 1975a, b). El segmento posterior de los riñones rinde más virus que los otros órganos y tejidos (Rima et a1., 1978; Swassos y GILLEBPIS, 1979; Mummaro, 1974, 1978a, b; YAIIMIOTO y Knisron, 1979). Cuando se practica un muestreo no destructivo, los productos sexuales (especialmente el componente particulado de los productos sexuales), la sangre y los componentes de la sangre y las heces respectivamente son los ensayados (McAmisrza, et al., 1987; SwAxsox y GILLESPIE, 1982; Yu et 1982). También se han recuperado virus del tejido cerebral (Sirxn*s et al., 1980). Ministril. y LEONO (1979) describieron un procedimiento para concentrar bajos niveles de virus en el agua y HEDRICK et al. (1986c) demostró que varios aparatos eran adecuados para dispersar los tejidos para el aislamiento vírico.
La detección de virus Infecciosos en especímenes clínicos está relacionado con las condiciones de almacenamiento de las muestras. Las muestras deben ser analizadas tan pronto como sea posible, preferiblemente dentro de las 24 horas de muestreo. La infectividad se preserva mejor si los tejidos se mantienen enteros a 4°C o en hielo que congelados a —20°C o —70°C. Contrariamente la infectividad de los homogenados de tejidos se conserva mejor con congelación a —20°C o —70 C que en hielo o a 4°C. Los fluidos ováricos pierden significativamente la infectividad a las 48 horas del muestreo particularmente si se mantienen congelados a —20°C. Si se añade albúmina serias bovina a una concentración final del 2%, los fluidos ováricos se pueden mantener en hielo o a 4°C o a —20°C o a —70°C con minina pérdida de la infectividad. FRAwrsi y SAVAN (1971a) sugirieron que la posibilidad de recuperación de virus de peces estresados fisiológicamente se incrementaba respecto a los peces no estresados Se ha observado una mayor prevalencia y mayor título viral en salmónidos en la época de puesta, posiblemente debido al stress de la mayor manipulación y a los cambios fisiológicos que acompañan a la puesta Boum y McKinowr (1978) describieron una epizootia de IPN mediada por stress, y Buscx et al. (1978) propusieron que los factores de stress asociados al sistema de vacunación contra bacterias por el método de la hiperosmosis en dos fases incrementaba la posibilidad de epizootias del IPN. No se observó incremento alguno en la frecuencia de aislamientos víricos en peces estresados por inyección o con inmunosupresores (Bucxx, 1977; Bucxz et 1979). Se han recuperado virus de peces que sufrían enfermedades tales como la enfermedad bacteriana del riñón, la enfermedad bacteriana de las agallas o infecciones por Pseudomonas fluorescens o infecciones víricos, tales como EVEX, HIN, VHS u otras (Anua y THOMSEN, 1985; Busca et 1978; Mucaury y Falta, 1978; ROBERTS y HORNE, 1978; Sanarratur y Facsr, 1975; YALIAM010, 1975c). Woir y JORGENSEN (1970) demostraron la acumulación simultánea de los virus 1PN y VHS en cultivo celular.
Los virus IPN e •PN-like• replican en una gran variedad de lineas celulares de salmónidos y no salmónidos, y se han utilizado muchas lineas celulares distintas para el aislamiento del virus (Mis y Marra, 1980). Las líneas más comúnmente utilinvisia son BF-2, CHSE-214, PG y RTG-2. Las lineas celulares varían en el grado de sensibilidad de la detección vírica. Varios estudios han demostrado la reducida y variable sensibilidad de las líneas EPC y FHM para la detección del virus de la IPN (Boyo et al., 1985; HEDRICK et 1988a; JOROENSEN y GRALTHALLE, 1971; JOROENSEN y KEHLET, 1971; KELLY et aZ, 1978; SCHER.RER y COHEN, 1975). &miman et al. (1980) describieron que el virus de la IPN de la lacha sólo podía ser aislado usando células de lacha, pero que podía ser replicado en otras líneas celulares después del aislamiento primario. Tanto factores del virus como factores asociados a las células afectan la sensibilidad de los virus IPN y •IPN-like•. SCHERRER y COHEN (1975) sugirieron que la adaptación de virus crecidos en la linea RTG-2 a crecer en las células FHM selecciona mutantes víricos, y que dicha mutación espontánea de relativa alta frecuencia (10• a 10°) altera las características de la superficie vírica. y permite mayor eficiencia de adsorción y penetración en las células FHM. Tests de neutralización en placa indican que el •mutante• permanece antigénicamente similar al virus parental y retiene su capacidad de replicar en la linea RTG-2. DAnuaon y Mac DONALD (1982) demostraron que el espectro de hospedadores está limitado por la unión del virus a la superficie celular y que el gen responsable de la restricción mapeaba en el gran segmento («Ii•) del genoma virad. Los virus IPN e •IPN-1fice• generalmente replican hasta un titulo de 10° a 10° UFP/ml. Los aislados de peces salmónidos replican bien- de 10 a 26° C, pobremente a 4° C y nada a 30°C. Los aislados de peces no salmónidos muestran un perfil de temperaturas similar, pero distinta capacidad de replicación a 30°C (Hamucx et al., 1986a; SORIMACHI y HABA, 1985). La cinética de replicaclón del virus IPN fue seguida por primera vez en las células RTG-2 a 24°C por MALSBEROER y CERINI (1963) y posteriormente otros investigadores utilizando otras lineas celulares han demostrado resultados semejantes. Después de un eclipse de 4 hr, los virus asociados a células incrementan exponencialmente durante 7 hr. Los virus extracelulares se hacen evidentes 7 hr después de la infección e incrementan exponencialmente durante 9 hr. Durante 18hr los títulos de virus liberados y virus asociados a células Permanecen casi iguales. Incrementando la multiplicidad de infección, se causa una más rápida acumulación de virus. mientras que disminuyendo la temperatura se enlentece la acumulación de dichos virus. La obtención de virus (880 a 1.030 TCIDScélula) parece independiente de la multiplicidad o de la temperatura durante un ciclo de replicación vista la acumulación de virus fue también descrita por microscopia frommotiluorescente y por microscopia electrónica. La fluorescencia especifica de virus se observaba en el citoplasma, apareciendo tan pronto como 34 hr después de la infección y obteniéndose un pico entre las 10-12 hr (Puto et sr., 1973; Tu et al., 1974). Morfológicamente, los viriones maduros aparecen en el citoplasma 6 hr después de la Infección (ticas y Gitana, 1989). Las relaciones serologicas entre loe virus 1.13N e •1)•like. son complejas y se dan múltiples serotipos de reacción cruzada entre los sisamos de salmónidos y no salmónidos mariscos (DOS:30N. 198N OKAMA70 et al., 1983). Loa serotipos básicos de salmónidos son el norteamericano VR-299 y los europeos Ab y Sp, también conocidos como serotipos 1. 2 y 3 respectivamente (Mac Donato y Gano, 1981). MEDRICIC et al (1986a) encontraron que los virus .1PN-11Xe• que replican a 30°C representan un cuarto serotipo. Otros grupos de virus denominados como .h4 y serogrupos 1, 2 y 3 han sido también descritos (Danzo«, 1983; Ruz 1976). Dentro de cada uno de los serot4pos existan una variedad de aislados con reacción cruzada. Se han utilizado ensayos de eméticas de neutralización para determinar relaciones serológicas más sutiles (MAC DONAW y 009711R, 1981; NICI(01,90N y PCCHEInt 1981). Antisueros polivalentes de uso para diagnóstico pueden estar compuestos de hasta 7 antisueros provenientes de diferentes aislados víricos, Los virus IPN e •IPN-like• son excepcionalmente inmunógenos, Y 10s antisueros han sido producidos en conejos, ratones, cobayas y peces. la mayoría de protocolos de inmunización especifican el uso de una sola inyección intramuscular do virus purificados en adyuvante completo de ?round, seguido de inyecciones múltiples intravenosas a intervalos de 2 semanas de virus purificados (Hm, et al, 1981). Se han desarrollado lineas celulares de Mbridomas secretoras de anticuerpos monoclonales (F. NI Harma, comunicación personal; R. L MICHOISON. comunicación personal). Doaso» y de lamczus (1974a, b), JOROKIM24 (1973b) y Ilaux y Natas (1988) describieron que el ~aro normal de trucha contenía una fracción 89 que neutralizaba el virus IPN. Wscistazo es al (1987) encontraron actividad neutralizante de virus en el suero de -striped bao• sólo en los peces expuestos al virus. Las identificaciones confirmativas de los virus del IPN e .1Pfl•like• se basan en la reactividad serológicas en los ensayos de neutralización, inmunofluorescencia, itlffIllrlOper03Cidaa. itMeláll del complemento, inmunoelectroforesia coagulación o el Uununoensayo enzimático (ELISA) (Ama, 1981; DEA y E1AZKARY. 1983; FAISAL y MINE, 1980 rimar y Hui- 1975; Enrula et al, 1984; LZENTZ y 8PRINWIR. 1973; PUMA es al. 1973; Estamos, 1981; SWANSON y GILUSPIL, 1981). Domo y Hui (1983), HATTORI et al. (1984) y Ntatowas Comas (1982) describieron sistemas de ELISA en placas de 96 pocillos y cubetas; las dos primeras referencias describen el ELISA con muestras canicas. MCALLISTER y Sana (1986) describieron un ELISA inmunobict para la identificación de virus procedentes de fluidos de cultivo celular (Fig. 13).
La neutralización es el método estándar de comparación en la identificación de otros virus Los resultados de la neutralización de IPN e •IPN-like• requieren una consideración cuidadosa Woll, y (May (1971) demostraron que algunos aislados del virus IPN eran sensibles a un único ciclo de congelación/descongelación y requerían unas condiciones de almacenamiento más ácidas para mantener la infectividad a 40°C. Mathaini. et al. (1978) demostraron que virus no infecciosos, resultado de la Inestabilidad de algunos viras IPN o de partículas autrenterferentes se unen eficientemente a anticuerpos y así influyen en el indice de neutralización.
Transmisión
Fig. 13. Inmunoblot-cruzado para la Identificación de los virus 1PN, HIN y VHS. Virus procedentes de cultivos celulares fueron diluidos en PBS. Colocada una gota (10 ni) sobre una matriz de nitrocelulosa y hechos reaccionar con diluciones 1/2000 de anticuerpos homólogos y heterólogos Como controles negativos se usaron o bien PBS, o medio de cultivo de células CHSE-214 (EMEM•10) o nada De ~mem Y Soma, (1088); reproducido con permiso de la Wildlife Di9088e ASSOCIatiOti.
La transmisión horizontal de los virus IPN e •IPN-like• ocurre como consecuencia de la diseminación de virus a través de las heces, orina y productos sexuales de animales Infectados. En periodos de epizootias el agua de una «bereber . puede contener de 10' a 106 o más unidades infecciosas de virus por litro (Ball y Wats, 1969; Diarauras y MacKm.vre, 1975; View, 1968). El virus probablemente inicia la infección por contacto con las agallas, ingestión de comida Infectada o pasando a través de poros sensoriales del sistema de la linea lateral. Algunos supervivientes a la infección se transforman en portadores de virus y son el reservorto de la infección durante la generación contemporánea y subsiguientes. La Prevalencia de los portadores varía, pero puede exceder el 90% de los supervivientes de una epizootia. No (»daten indicaciones de diferencias sexuales en el estado de portador. El estado de portador puede persistir durante muchos anos tanto en •atchene® como en ambientes naturales, pero algunos estudios sugieren que el estado de portador decrete con el tiempo (Raleo et al., 1978; RiSSIIIRID, 1977; Yiaturero, 1975a; Yalumaro y liamos?, 1979). El estado de portador puede estar afectado por la respuesta inmune del hospedador debido a que se encuentran niveles más os de virus en los peces con anticuerpos neutralizantas c (Orla y %az, 1989; Mas y Qwuev, 1969; YAII/agm), 1975b). La prevalencia del portador puede variar con las distintas especies de salmónidos.
La trucha arco Iris parece presentar una prevalencia menor de portadores y un estado portador más corto que la trucha salvelinus (Yaurasyro, 1974, 1976a; YAStAMOTO y 101.1siorn 1979). La más beda frecuencia de aislamiento de la progenie de portadores salvajes y de peces libres de virus introducidos en las poblaciones portadoras sugiere que la transmisión mediada por los portadores en la naturaleza no Juega un papel tan
importante como en las•harcheries• (Yamairoro, 1975a, b YA3mANOTD y ICILISTOM 1979). Las epizootias de 1211 ocurren regularmente en •hatcherles• que usan huevos de reproductores portadores de virus o usan aguas superficiales habitadas por peces portadores. Los peces no salmónidos pueden ser reservarlos de infección (Muimo y Mina». 1977: Sant et aL. 1982). McAunrza y Mear-liana (1987) demostraron que suspensiones de virus procedentes de lubinas americanas portadores infectaban truchas Salvelinus e Inducían la síntesis de anticuerpos neutralizantes. WECHSIER et al. (1987) especularon que lubinas americanas ea/vejes estaban expuestas al virus IPN por consumo de tachas portadoras de virus.
Tanto homeotermos como poiquilotermos pueden actuar como vectores mecánicos El virus IPN Sao recuperado de heces de pollee inoculados con el virus, del gran búho cornudo (Hubo ~anua), la gaviota (Leuzazs ndtbundus) Y visón (Mustella sp) (Estaireati y JOROENSEiI, 1974; SONS•eARD y McDevzorr. 1972). La intectIvIda,d persiste en dos especies de protozoos faflzunansts ovidus y Tetrai(ymena sp.) alimentados con células IITG.2 infectadas con virus (Mozwus-Kora, 1985; MORwtra 1982). La posible transmisión vertical asociada a los huevos Iba propuesta poco después del primer aislamiento del virus (Wat et aL. 1983, 1988b). Boucot eta/. (1978) describieron la transmisión del virus IPN de huevos con ojos de trucha arco iris y Szatev et al. (1977) encontraron que el virus IPN era transmitido a los huevos del pez cebra Desafortunadamente, ninguno de estos estudios puede diferenciar entre virus en el huevo y virus secuestrados en el huevo. Dome y lbactiv (1985) probaron sin éxito de transmitir el virus IPN a través de huevos de portadores de virus aducidos a la puesta en el laboratorio e incubando huevos con virus antes de la fertilización. Pudieron transmitir el IPN si el esperma era incubado con altas concentraciones de virus antes de su uso en la fertilización. El virus era aparentemente portado al interior del huevo con el esperma Ama y Nzorzz (1985a) describieron la afinidad del virus IPN por las cáscaras del huevo. El virus rodia ser recuperado de las cáscaras de huevos con ojos durante más de 3 semanas despees de la infección y podían también ser recuperados de las cáscaras después de la eclosión. Si los huevos eran expuestos al virus antes de la fertilización. los virus se perdían en el periodo de una hora. AM« y Neo= (1988a.) especularon que las cáscaras de huevos Infectadas podían ser un reservorio de virus. Anua y Nema (1988b) recuperaron el virus IPN de extractos de pituitaria y sugirieron que los reproductores podían haber sido infectados inadvertidamente por inyección con extractos contaminados. Experimentalmente, el virus IPN ha sido transmitido por inyección, inmersión y a través del alimento. Mcluttsrra y amas (1988) describieron un protocolo de infección experimental por inmersión utilizando trucha salvelinus como especie modelo. La virulencia en Infecciones experimentales estaba afectada por la especie de salmónido y la edad de los peces, el método de exposición y la historia del cultivo de los peces (Dome et al.. 1975b; Doma y TOacirv, 1981; Ha& y DIXON 1977; Joaorszs y Kunst, 1971; bleAuzsrest y Ovarta, 1988; Stuu et aL. 1982).
Factores que afectan la enfermedad
La infección aguda de peces salmónidos entre 1 y 4 Maree de edad puede resultar en una severa mortalidad, de hasta el 10041 mientras que salmónidos de 6 meses o mayores sufren infecciones subclínicas o raramente infecciones agudas sin excesiva mortalidad (Doleos y Tomer, 1981; ELAMARY et al, 1976; Fnnnsi y SAVAN, 1971b, McAtusraa y OWENS, 1988; ROMOS y McKatcarr. 1978).
Las condiciones ambientales y los factores de stress afectan la infección vírica. La temperatura Influye tanto la respuesta del hospedador corno la reputación del virus. Fan= y SAVAN (1971b), SANO (1973) y DOMON y lbncnv (1981) documentaron los efectos de la temperatura en la mortalidad inducida por el virus IPN. Aunque había variaciones en los resultados de los tres estudios, la tendencia general sugería que los niveles altos de mortalidad rápida ocurrían alrededor de 10 a 14°C. mientras que altos niveles, pero con mortalidad lenta, ocurrían a 8°C. A temperaturas superiores a 14°C. el nivel de mortalidad era Significativamente reducido. Doasoa y Toricaty (1981) indicaron que la susceptibilidad variaba con el número de grados X acumulados los días después de la eclosión. A mayor número de grados X, día menor mortalidad IVIAMIN y SAYA» (1971a) y Roanas y McKront (1976) describieron la recrudescencia de la infección en portadores de virus aparentemente sanos estresados por el transporte. masificación, elevada temperatura o baja concentración de oxigeno. McAtuarea y Muss (1986) demostraron que peces entesados nutricionalmente eran más susceptibles a la Infección. Paraturrrra et al. (1973) sugirieron que un factor inmunosupresivo soluble era liberado cuando los peces se hallaban en condiciones de sobrepoblación.
No todos los aislados del virus del LPN son Igualmente virulentos. Invuersi y SAYAS (1971b), Joaotoisraz y Kin= (1971), MoMusan y Osas (1988). Sima et a). (1982) y Sexo (1971b) compararon vanos eiSedoi y describieron un amplio rango de patogenidad Las cepas VR-299 y Sp eran virulentas; mientras que el serotipo Ab era virulento. Dentro de cada serotipo hay gradaciones de virulencia Domas et a). (1975b) y Me.Adasrsa y OSTENS (1986) demostraron que los múltiples pasajes en cultivo celular disminuía la virulencia. Hitt y Duces (1977) Indicaron que los efectos del pasaje de virus podían ser obviados incluyendo suero de trucha en el medio de cultivo celular. MCALLISTER y OVIENS (1988) observaron lo contrario con el serotipo VRr299 la virulencia era mejor preservada creciendo los virus en la presencia de suero bovino fetal.
Motriz si al. (1985) sugirieron que la resistencia a la infección del virus se correlacionaba con la ininunocompetencia desarrollada. En peces adultos infectados experimentalmente se demostró la presencia de anticuerpos neutralizantes, así como en peces adultos y jóvenes infectados naturalmente. YAlisliaTO (1975b) encontró que altos niveles de anticuerpos en portadores de virus correlacionaban con títulos virolos bajos en órganos y heces. Los anticuerpos neutralizantes producidos en respuesta a la infección natural o inoculación experimental estaban asociados con una inmunoglobulina perecida a la IgM (Dona 1974; JORGE:MEI, 1973b). El estado de portador puede representar un balance entre la replicación persistente de sima infecciosos y defectivos y la producción de anticuerpos especificas contra el virus, o simplemente mediado por las interacciones entre los virus Infecciosos y defectivos (Humea y Fans, 1982). DORMIR y de KW/MUR (1974a, b), JOROBASES (1973b) y KELLY y NIMBEN (1985) encontraron que el suero de peces salmónidos no expuestos contenía una fracción 6 S que neutralizaba el virus LPN. Estudios posteriores de DORSOS et al (1975b) y Har. y DIXON (1977) sugirieron una correlación entre virulencia y resistencia a la neutralización por la fracción 6 S.
Control de la enfermedad
La mejor forma de controlar la IPN es previniendo el contacto entre el hospedador y el virus. No existe tratamiento para la Infección vide& las instalaciones y •hatcheries• contaminadas pueden ser desinfectadas por tratamiento con cloro (200 mg/1 durante 1 hora). El tratamiento con cloro debe ser realizado entintado cloro periódicamente debido a que la materia orgánica y el pH afectan la concentración de cloro disponible (Dragneur y MAC KELYIE, 1975; Eimor y AMEND. 1978). El agua de entrada debe ser protegida y controlada utilizando siempre que sea posible agua de manantial o de pozo. Habitualmente se utilizan corrientes de agua abiertas, exponiendo las poblaciones de las •iatchertes• a las enfermedades infecciosas portadas por peces residentes en tales corrientes El ozono y la radiación ultravioleta puede ser usada para descontaminar grandes volúmenes de agua (MAc Ilmis y DMALTERLS, 1978; WEDEMETER et at, 1978). Les peces introducidos en las Instalaciones deben estar certificados como libres de patógenos y los huevos deberían provenir de stocks de reproductores certificados debido a que el virus de la IPN parece que puede transmitirse a través de huevos inadecuadamente tratados con iodóforos (Ekruom et al, 1978). Deseos y Itscarr (1986) sugirieron que los huevos deberían ser fertilizados en presencia de iodóforos.
No existe evidencia de inmunidad transferida maternalmente, pero alevines susceptibles pueden ser protegidos por transferencia pasiva de anticuerpos o interferón. La resistencia al virus de la IPN parece ser heredable y puede ser reforzada por reproducción selectiva.
El desarrollo de vacunas eficaces está. solamente empezando. Vacunas con el virus de la IPN inactivado presentan una respuesta protectora cuando se administran por inyección, pero no por inmersión infiltración hiperosmótica o a través del alimento (Daos nito. 1983; Damos, 1977; Hoz, y Daos, 1977; Hnt et a/. 1980; Saxo de aL, 1981). Los esiberzos para desarrollar una vacuna con virus de la IPN atenuados no han tenido éxito Sin embargo, salmónidos susceptibles pueden ser protegidos contra la administración de virus virulentos por una exposición previa a virus attirulentos. Las vacunas con virus vivos, ya sean atenuados o cepas naturalmente avirulentas presentan problemas a nivel de diagnóstico y regulación, y por ello han sido desechadas. Más prometedores son los ostiones para desarrollar vacunas de subunidades utilizando componentes donados de cepas virulentas del virus 1PN y de cepas avirulentas que presentan reacción cruzada con las cepas virulentas
Estrategias de manipulación, tales como mantener los peces a 16°C o por encima puede moderar la mortalidad de la IPN vírica (Densos y Tonga, 1981). La incidencia de IPN aguda y la consiguiente mortalidad puede ser reducida si se controlan los factores que promueven el stress fisiológico y los que Inducen la baja resistencia a la enfermedad. Procedimientos sencillos tales como mantener los peces a hoja densidad de población, protocolos óptimos de alimentación, mínima higiene de las instalaciones y hilo s:timón de tratamientos profilácticos de enfermedades bacterianas (particularmente la enfermedad bacteriana de las agallas) y parásitos han sido efectivos para moderar los brotes de IPN.
No existen productos quimioterapias para el tratamiento de la IPN. El nucleósido antivirus sintético virazole (1-D-Mhofluranost.1-1, 2, 4triazole-3carboxamIda) inhibe la n'Aleación del virus de la IPN en cultivo celular y reduce algo la mortalidad en alevines de truchas amo Iris infectadas (Miaus y Doses, 1980; SAVAN y Doses. 1980). Sin embargo, debido a que el virazole es un inhibidor reversible, la efectividad decrece con el tiempo y son necesarios tratamientos repetidos. Análisis de costos indican que la quimioterapia antivirica es demasiado cara. También se ha probado la inducción de la *Untaste de interferón con tllorone pero no se ha observado protección. La mortalidad debida al virus 1PN parece que se puede reducir con ácido polivinflpirrolldonwiedina eaminocaproioo y ácido tranexámico (Econonos. 1963. 1973: Diem, 1973), pero en experimentos de administración experimental estos medicamentos generalmente son ineficaces.
5.2. Biología del virus
Morrologia
Micrografías electrónicas de virus de la IPN e •IPN-11.103• muestran viriones icosaédricos, con una única capeida y sin envoltura con un diámetro de 55 a 74 nin (fig. 14). La cápsida, de una sola capa es una característica morfológica que distingue a los birnavirus de los reovirus (Doses et al. 1979). Hay poca variación tanto en morfología como en tamaño entre los virus aislados de peces salmónidos y no salmónidos y mariscos (Doescw, 1983; HILE, 1982: Mealnetra. 1979; Patalee y Pena 1980a; Hatea se al., 1988a; UNDERwOOD et aL, 1977). La capeada está compuesta de 180 subunidades estructurales distribuidas en 92 capsómeros hexagonales y pentagonales En micrografías electrónicas se pueden observar carpidas vacías y semivacías, así como estructuras subviricas que se perecen a los núcleos víricos. Los visiones infecciosos sedimentan a una densidad de 1,33 g/ml en CaCI y las partículas Incompletas defectivas-interferentes lo hacen a 1,271,29 giml (BOBOS et el, 1977; Haat= et al. 1978; Mac DOBAI]) y YAmem070, 1978). El trinen Infeccioso completo tiene un peso molecular aproximado de 138 >: 10* daltons y un coeficiente de sedimentación de 4.36 S, y está compuesto de un 8,7% de ácido nucleico y un 91,3% de proteína.
Por pasajes sucesivos de stocks no diluidos se desarrolla autointerferencia (MAissároza y CERTNI, 1963). Asimismo, se han obtenido cultivos de células persistentemente infectados mediante partículas defectivas interferentes (Hrsaucx y rana, 1982; HEDRICK et 81., 1978; MAc DONALD y KENNEDY, 1979). Las partículas autointerferentes son copurificadas con los virus infecciosos; son sensibles a la irradiación ultravioleta y a la congelación- descongelación y se unen a los anticuerpos específicos (MAC DONALD y YAMAMOTO, 1977, 1978; NICHOLSON y Dais, 1974). La infección persistente no implica síntesis de interferón, más bien parece reflejar un balance entre la replicación de virus infecciosos y la interferencia por partículas defectivas (Halan y FRYEA, 1982; MAC DONALD y KENNEDY, 1979). La interferencia es específica, y es más eficiente cuando las células son expuestas a partículas defectivas 24 horas antes de la exposición a virus infecciosos (MAC DONALD y YARAmoTo, 1978).
Fig. 14. Microfotografía al electrónico de partículas infecciosas del IPNV teñidos negativamente. De COHEN et a1. (1973); reproducido con permiso de Cambridge University Presa
Ácido nucleico vírico
M.A.IssracEa, y CBRINI (1966) y Aaraar (1989) demostraron que el genoma del virus IPN es ARN. Inicialmente surgieron serias divergencias en cuanto a las características del ARN del virus IPN. (Anear, 1969; Asear y MAISBERGER, 1972; KELLY y LOH, 1972; Nicamisos, 1971).
Investigaciones posteriores establecieron con claridad que el genoma del virus de IPN consiste de dos segmentos independientes de ARN bicatenario (fig. 16), lo que constituye una. característica distintiva de los birnavirus (Colas et at, 1973; DOBOS, 1976; DoBos et al., 1979; MAC DONALD y YAmAmaro, 1977a; MAC DONALD et al., 1977). HEDRICK et al. (1986a) y MAC DONALD y GOMA (1981) mostraron que uno o ambos segmentos del genoma de los serotipos de IPN o «IPN-like» eran únicos en cuanto a la movilidad electroforética y por tanto en peso molecular (fig. 15, cuadro V). El peso molecular del segmento mayor, «A», oscila de 2,1 x 10 6 a 2,5 x 10 6 daltons, y el peso molecular del segmento menor, «13», va desde 1,9 x 10 6 a 2,3 x 10 6 daltons. MAC DONALD est al. (1977) determinaron la composición de nucleótidos de los dos segmentos del virus de serotipo VR-299 y vieron que cada segmento tenía un patrón diferente por la técnica del «fingerprint».
En general, el ARN representa un 8,7% de la masa del virión. El ARN del virión sedimenta a una densidad de 1,80 a 1.815 gend en CatSO₂. tiene un punto de fusión (Tm) de 85 a 69°C y una longitud de 0,92 ♦ 0,07 pm (Coman et aL, 1973; DOBOS, 1971 Mac DONALID y tiliSMOTO, 1977).
Come (1975) demostró la existencia de una ARN poli:nansa ARN-dependiente asociada al virus 1PN, y Arana et el (1975) fueron los primeros en señalar el aislamiento de ARN específico del virus en lea células infectadas En células Infectadas se recuperan dos clases de ARN sintetizado como consecuencia de la infección: 14 a 15 8 y 23 a 24 8. El ARN 14 a 15 S es resistente a la digestión por ARNasa y sedimenta con el ARN extraído de los viriones. sugiriendo así que el componente 14 a 15 5 es ARN bicentenario que luego forma parte del visón sintetizado de nuevo. El ARN 23 a 24 8 es sensible a la ARNaza y ea, con toda probabilidad, el ARN-m tito. AlaYBE *S al. (1975) describieron que la transcripción vírica empieza aproximadamente a los 30 minutos y la replicación a la hora después de la Infección. Según Sous« y Dimos. la síntesis de ARN especifico del virus es másdnia a las 8-10 horas postinfección y finaliza a las 12-14 hora. Se pueden distinguir dos bandas del ARN-m de 24 S, seguramente una para cada segmento del genoma. El ABN-m 24 S no tiene secuencias poll.A y aparentemente también funciona como un molde para la síntesis de ARN complementarlo para la replicación del genoma bicatenario.
En las primeras investigaciones se describieron números variables de proteínas. Olmo et al. (1978) y Coas» et al (1973) describieron la presencia de tres proteínas en el vinario, y ton et al. (1974). de siete, mientras que Domos (1977) encontró diez proteínas especificas del virus en células infectadas y cuatro proteínas estructurales en el visión (fig. 18). La principal cuestión se centraba en la distribución de las proteínas menores del visión y en la relación entre les proteínas Vírica intracelulares y las proteínas estructurales. Los estudios de pulso y caza y el mapa tríptico de los péptidos descritos por DOBOS y Ron (1977) demostraron las relaciones existentes entre los precursores y las proteínas visitas (fig. 18). El gonoma mico codifica para cuatro productos génicos primarios llamados 2, /31, 71 y 72. La proteína de elevado peso molecular es estable en tanto que las otras sufren división proteolítica durante el proceso de morfogénesis del virus (cuadro 5). La Proteína 2 y los productos de la división de 11 y yl se convierten en elementos estructurales del vicien, Y 72 y sus productos de división San proteínas no estructurales. DOBC6 et al (1979) observó que el mapa tríptico de péptidos de proteínas estructurales Individuales de varios virus IPN e (IPN.1ike• eran similares.
Fig. 15. Comparación de los fragmentos del genoma ARN de doble cadena del virus del góbido (SGV) con aquéllos de 3 oepas de referencia de IPNV. Fragmentos del genoma de Reovirus 3 fueron añadidos al mismo gel como marcadores de peso molecular. De HEDRICIC et al. (1986a); reproducido con permiso de Inter-Research.
Mac Domó y Doses (1981) Identificaron las proteínas codificadas por cada segmento. El segmento codifica tres proteínas: la proteínas más importante de la capsida (fs). la proteína Interna (71) y una proteína no estructural (,2). El segmento E. codifica para la proteína estructural de mayor tamaño (a) y la presunta ARN polimerasa vírica Según Mansas y Dores (1982), el segmento -A. es pollcistrónico, mientras que el segmento -Ele es monocistrónico. El ARN-m del segmento podría tener múltiples puntos de iniciación y terminación para la traducción de proteínas leídas, HUMO et a/. (1988) donaron el genoma del virus IPN (genotipo 8p) y realizaron un mapa aleo de fragmentos obtenidos por digestión con endonucleesas de restricción. El segmento tiene un orden de genes lineal, que no se superponen, de 5'11-:2-71-3' y contiene unos 2.900 pares de bases, mientras que el segmento 43. contiene unos 28.000. Las características genéticas son semejantes para loa serotipos V8-299 y SP.
Proteínas víricas
Los virus IPN y .IPN-lik• están compuestos de tres o cuatro proteínas estructurales separadas en tres clases según tamaño, llamadas x, fi y y, según sean de peso molecular alto. Intermedio o bajo (Dolos. 1977; Doeas y Ron:, 1977, y Dowis et al, 1977). Una nomenclatura alternativa lista las proteínas estructurales como (VP) 1 a 4, siendo VP1 la de mayor peso molecular y VP4 la de menor (DOBOS et aL, 1979; Hemos et aL, 1l983a Mac Dom.]) Goma. 1981).
MAC DONALD y GOWER (1981) notaron que los pesos moleculares de las proteínas estructurales parecían ser diferentes para cada serotipo. HEDRICK et ad. (1983a, b, 1986a) demostró que los serotipos del virus INP pueden ser claramente diferenciados por los perfiles electroforéticos de sus polipéptidos, particularmente por la migración de la proteína fi3 (VP2) (fig. 17). Inmunoprecipitación de proteínas víricas recién sintetizadas en células infectadas mostró que los distintos serotipos del virus IPN comparten regiones homólogas en los péptidos distintas de aquellas asociadas con las regiones de neutralización específicas de serotipo (HEnrucx et ad., 1986a).
Dosos et al. (1977) describieron el significado estructural de las proteínas víricas. La proteína VP2 representa la porción más importante 60%) de la masa del virión, y es la, proteína de la cápsida. Las proteínas; ƴ1 y ƴ lA son proteínas internas. La proteína x es muy probablemente la polimerasa vírica (HUANG et al, 1986; MARTENSS et al., 1982; PERSSON y MAC DONALD, 1982). El significado funcional de las proteínas 71 y 71A no se conoce.
Estabilidad vírica
La infectividad del virus IPN es muy duradera, sobreviviendo durante largos períodos de tiempo bajo una extensa variedad de condiciones ambientales y de laboratorio. Los virus crecidos en cultivo celular normalmente se conservan a - 70° C y hay una pérdida de 1 Log 10 de infectividad por año. Algunos aislados de virus de la IPN son sensibles a un solo ciclo de congelación/descongelación y pueden requerir condiciones más ácidas para mantener la infectividad cuando se almacenan a 4°C (Wou y QUIMBY, 1971). Cuando son mantenidos en suspensión en tampón fosfato salino (P119), diluidos en medio de cultivo celular o en 20% ó 50% de glicerol y mantenidos a 4°C, se observa una bajada de 3 Log 10 de la infectividad en 1 año (MAC KELVIE y DESAUTELS, 1975). DESAUTELS y MAC KELVIE (1975) describieron que una suspensión del virus en agua dulce mantenida a 4° C resultaba en una pérdida de infectividad de 2 Log 10 en 12 semanas, mientras que una suspensión en agua de mar no mostraba pérdida ni a 4°C ni a 10°C. WEDEMAYER et (1978) encontraron una pequeña pérdida de infectividad cuando los virus eran suspendidos en agua destilada, agua lacustre blanda (30 mg/1 de CaCO₂) o agua lacustre dura (120 mg/1 de CaCO) y mantenidos durante 8 semanas a 10°C. WOLY et al. (1969) recuperaron infectividad a partir de peces enteros u homogenados de vísceras después de años de
Fig. 16. Autorradiografia de péptidos marcados de (A) células RTG•2 infectadas con IPNV irradiadas a las dos horas después de la infección y marcadas de las 4 a las 6 horas después de la infección, (B) IPNV marcados purificados, y (C) preparación de cápsida de IPNV marcado disuelta con sodium dodecil sulfato caliente sin mercaptoetanol antes de la electroforesis. H, proteínas especificas de la célula huésped. El dimero de B, está representado por el símbolo 2 x B,. Adaptado de Doftos y RowE (1977); reproducido con permiso de la American Soclety of Microbiology.
almacenamiento a —20°C o menos, o a 4°C en 50% de glicerol. El virus IPN no se inactiva, por exposición al éter, cloroformo o glicerol, pero es rápidamente inactivado cuando es expuesto al cloro, iodóforos, ozono o radiación ultravioleta (Amara), 1976; AMEND y Pirrscii, 1972; DESALMES y Mac KELVIE, 1975; ESIULDSEN y JORGENSEN, 1974; JOROENSEN, 1973a; MAC KELVIE y DESALMES, 1975). WEDEMAYER et al. (1978) encontraron que al incrementar la dureza del agua se requerían progresivamente mayores concentraciones y más tiempo de exposiciones para inactivar el virus con cloro y ozono. &moler y AMEND (1978) y AMEND y Paraca (1972) demostraron que la actividad virucida del cloro y iodóforos era reducida por materia orgánica y a niveles de pH por encima de 8.0. La exposición a rayos ultravioletas (ƴ = 254 nm.) a una intensidad de 200 AA/cma resultó en una pérdida exponencial de la infectividad muy rápida; en cambio, a intensidades de 440 µW/cm la inactivación era más lenta y curvilínea (Mac KELviz y DESAUTELS, 1975). El virus 1PN era progresivamente inactivado por exposición a 𝛽-proiolactona, formalina, secado, calentamiento a 60° C o pH 2 ó 9 (DESAUTELS y MAC KELVIE, 1975; DIXON y HILL, 1983; MAC KELVIE y DEsturns, 1975). Si el virus IPN era expuesto a una dilución 1:4.000 de formalina, la inactivación vírica seguía una curva multifásica y se detectaba infectividad residual después de 14 días de exposición a 4°C (MAc KELVIE y DESAUTELS, 1975). DISON y Hui, (1983) expusieron el virus IPN a mayores concentraciones de formalina y (𝛽-propionolactona. Cuando la dilución de formalina era de 1:200, el virus era completamente inactivado en 4 días a 20°C, mientras que se podía detectar infectividad residual después de 7 días a 4°C. Los virus expuestos a una dilución 1:200 de fi-propionolactona perdían toda la infectividad en 6 días a 4°C, pero se podía detectar infectividad residual después de 7 días a 20°C. El tratamiento con formalina causaba una débil reducción de la antigenicidad del virus, mientras que más del 50% de la antigenicidad se perdía con tratamiento con 𝛽-propionolactona la inactivación del virus a 60°C mostraba una cinética bifásica; durante los primeros 30 min. ocurría una inactivación de 3 Log 10 y una pérdida de calibre similar ocurría en las siguientes 41w. A pH 2 ó 9 los virus eran inactivados en un período de semanas (MAC KELVIE y Dli3AUTEL8, 1975).
6. Rabdovirus de peces
Los rabdovirus tienen una morfología muy característica, ya que se parecen a balas, de aquí la derivación del término rabdovirus del griego rhabdos que significa vara Son virus universalmente distribuidos y producen infecciones naturales en mamíferos, peces, crustáceos, insectos y plantas. Los rabdovirus replican en el citoplasma celular y su genoma de ARN se halla empaquetado en una nucleocápsida helicoidal. Se pueden distinguir dos subgrupos, los lisavirus y los vesiculovirus, según el perfil electroforético de las proteínas estructurales. En peces se han aislado doce rabdovirus distintos antieméticamente (cuadro VI): el virus de la necrosis hematopoyética infecciosa, el virus de la septicemia hemorrágica viral (Etgved virus), el virus de la viremia de primavera de la carpa (Rhabdovirus carpio), el virus de los alevines de lucio, los rabdovirus de la anguila (B12, EVA y EVEX), el rabdovirus de la perca de Río Grande (Cichlid), el rabdovirus del síndrome ulceroso ( =ulcus) del bacalao, el rabdovirus de Hirame (Rhabdovirus olivaceus), el rabdovirus de la perca y el rabdovirus de la hepatitis de salmónidos.
6.1. Biología de las enfermedades
Virus de la necrosis hematopoyética infecciosa
Las «hacheries» del Pacifico Norte de los Estados Unidos han tenido a lo largo de su historia devastadoras epizootias de etiología viral. Tres virus fueron aislados en asociación con diferentes epizootias: el virus del salmón sockeye de Oregon (Mirar= et al., 1969), el virus del salmón chinook del río Sacramento (Rosa et al, 1980) y el virus de la necrosis hematopoyética infecciosa (Ato= et aL, 1969). Los tres virus producían enfermedades con sintomatología clínica e histopatológica similar y los virus eran muy parecidos en sus características bioquímicas, biofisicas, morfológicas y antigénicas (AMEND et aL, 1973; Mcktoni et al, 1971; Yosanum). La designación única de virus de la necrosis hematopoyética infecciosa (1 W) comprende a los tres aislados.
GRISCHIOWSKY y MOND, 1976; MULCANY y WOOD, 1988; SANO, 1976; SANO et aL, 1977b). El salmón coho, las truchas salvelinus, fardo y «cutthrouto y la perca amarilla son consideradas especies resistentes a la enfermedad, aunque el virus ha sido iodato de portadores asintomáticos de salmón coho y truchas ?ario y ecutthrout» (honre et al., 1973; McMicoon et aL, 1973; NICHOLSON, 1983; %Voir, 1976). La enfermedad es endémica de la costa del Pacífico de Norteamérica, desde el norte de California hasta Alaska, y también está establecida en Japón. El virus ha sido diseminado a otras áreas de los Estados Unidos y del resto del mundo con peces y huevos procedentes de peces contaminados del Pacifico noroeste de Norteamérica.
Signos clínicos
Las epizootias de la enfermedad 1HN pueden dar lugar a grandes mortalidades en peces de 3 semanas a 6 meses de edad (Muicoihr et aL, 1983b; Wunom.s y MOND, 1976).
La mortalidad puede ocurrir en peces de 7 a 14 meses de edad, pero no presentan la sintomatología clínica típica de peces jóvenes (Arrostrare, 1978). Una gran variedad de signos clínicos son evidentes en los peces jóvenes (Amzwo et al, 1973; Porusor et al., 1965; Yes:From 1970).
Los peces toman un color oscuro y desarrollan exoftalmia. El abdomen está distendido y tiene ascitis; las agallas aparecen pálidas y cadenas de heces blancas salen del ano. Los peces estén letárgicos, pero esporádicamente hiperactivos. Se observan hemorragias en la base de las aletas pectorales y pélvicas Y en el ano, y sólo ocasionalmente en la piel. musculatura y boca Una prominente hemorragia subdérmica puede ocurrir entre la cabeza y la aleta dorsal. Internamente, los peces aparecen anémicos; el hígado, riñones y bazo están pálidos y el tubo digestivo se halla vacío de comida pero lleno de material mucoso. Hemorragias peto: Males son evidentes en la grasa. mesentéreo. vejiga natatoria y otras áreas viscerales Puede presentarse escoliasta y lordosis en un 1.6% de los supervivientes.
Fig. 17. Comparación de los polipéptidos específicos del virus del góbido (SGV) con aquellos de 3 cepas de referencia del IPNV. Los polipéptidos de los cuatro virus inmunoprecipitados de Usados de células infectadas migaron a zonas correspondientes a pesos moleculares que oscilaban de 46 a 60 ( x 103). Puesto que tanto los péptidos precursores como los productos resultantes del «cleavage» final (las pi-especies de migración mas rapicia) son precipitados con el anticuerpo antivirus, se observaron varias bandas generalmente 3) en la zona de pesos moleculares comprendidos entre 46 y 60 x 103 de cada virus. Las posiciones de los marcadores moleculares (x 103) se señalan en el lado izquierdo con barras; los polipéptidos-B de la capsida de viriones purificados de las tres cepas de referencia (señaladas a la derecha por flechas) fueron determinados por Unción con Coomassie Blue. De 1-Isrmarck et al. (1986a); reproducido con permiso de Inter-Research.
Cambios histológicos
En peces de menos de 8 meses de edad pueden observarse cambios patológicos extensivos en los riñones, bazo. fugado y páncreas y en las células granulares del tracto alimentarlo (Amara a al, 1969. 1973: Yasunucc, 1970. 1978: Yestroom et al, 1955). El unido hematopoyético renal, que es el foco infeccioso inicial, sufre necrosis severa, pero los tubulos y glomerulos se ven poco afectados. De Igual forma el tejido hematopoyético esplénico está severamente necrotizado. Las células de los islotes pancreáticos presentan evidencia de inclusiones intracitoplasmáticas e intranucleares pleomórficas. Puedo darse necrosis focal en el hígado. En cuanto al tracto alimentario, se distinguen características patológicas típicas de la enfermedad IHN en animales de tres a cuatro meses de edad pero no más Jóvenes (tararais: es al, 1978) que se pueden resumir como necrosis de las células granulares de la lámina propia del estrato compacto y del estrato granuloso. Los tejidos contienen grandes números de células polimorfonucleares y linfociticas. y la hiperemia contribuye a la petequización y hemorragias. En la musculatura se acumulan eritrocito& pero no se observa necrosis de los músculos estriados ALIEW) y &cm (1974, 1976) describieron las características hematológicas y químicas de sangre de peces Infectados de IIINV y sugirieron que el mal balance de electrólitos y fluidos debido a una deficiencia renal era probablemente la causa de muerte. YASUTAKE y AMENO (1972) demostraron la fuerte correlación entre el incremento de cambios histopatologloos y la concentración de virus la microscopia electrónica revela virus en el riñón anterior. bazo, páncreas y ciego Moño° (AMERO y Csamattes, 1970) En peces de 7 a 14 meses de edad los cambios histopatológicos no son severos (Yasteaucr, 1978). El riñón anterior y el bazo muestran sutiles amas focales de degeneración celular y necrosis. En una zona posterior al ciego se produce un ligero desprendimiento del epitelio interior del intestino delgado.
Aislamiento e Identificación del virus
El vino IHN generalmente sólo se alela de peces menores de un año con enfermedad aguda y de adultos en época de puesta Aunque poco frecuentemente, el virus se ha aislado de peces enfermos y asintomáticos de 12 a 18 meses de edad (arma y OFUSCKKOT/SKY, 1984; MULCAY et al, 1984a). El virus es raramente aislado de huevos o ale fines en ausencia de enfermedad aguda (Mimar y PAIKHO. 1985; Minar et al, 1983b) y no ha sido recuperado en forma de Infección latente en fases marinas de peces de agua dulce. Los supervivientes de epizootias se transforman en portadores latentes de virus. Los virus latentes son ostensiblemente activados por el atas asociado a la puesta Macar et al. (1984a) sugiere que la replicación del virus se incrementa debido a que el sistema inmune y los mecanismos de resistencia en general se hallan debilitados en los peces en puesta.
Se han estudiado las frecuencias comparativas de aislamiento del virus a partir de órganos y productos sexuales de un mismo individuo en época de puesta y la prevalencia de la infección y el titulo vira' son generalmente más altos en las hembras que en los machos (Muicay et a/., 1982, 1983a. o, 1984a). En los estadios tempranos de la prepuesta la prevalencia de la infección vírica en los peces es muy baja, pero los virus pueden ser aislados más frecuentemente de las agallas y en menor frecuencia del bezo y el ciego pilórico y raramente de otros órganos. La infección temprana de las agallas no parece ser la responsable de la posterior infección sistemática La prevalencia de la infección puede Incrementar de Indecectable al 100% en dos semanas. En peces en freza, el virus se halla presente en todos los órganos y fluidos excepto en el suero. La mayor prevalencia ocurre en las agallas, fluidos ováricos, intestino inferior, bazo y ciego pictórico se han realizado algunos aislamientos del cerebro. Los fluidos ováricos de peces en puesta o preferiblemente de individuos que ya han puesto es la muestra de elección para los ensayos de diagnóstico debido a la alta prevalencia de virus y la facilidad de manipulación y procesamiento. El tapo de muestra, la temperatura de almacenamiento y la duración afectan la retención de la infectavIdad Generalmente la 'afectividad se preserva mejor si los tejidos y fluidos se mantienen a 4°C y se procesan a la mayor brevedad posible arma y Macar, 1983; Gósnuo y Gana 1981).
El virus DEN replica en cultivo celular a temperaturas que van desde 0.5 a 20°C. El rango óptimo se halla a 1015°C, pero las características de replicación varían mucho (Macar/ et 1984b). La reparación del virus IFEN se da en una extensa gama de lineas celulares de peces. Las más comúnmente usadas son: CH8E-214, EPC, FHM, RTG-2 y STE-137; el virus, sin embargo, puede replicar en otras lineas celulares de peces de agua dulce y marinos (McAinsna. 1979; NICHOLGON, 1983; WATAIIABE et al, 1981). Prainecic et al. (1982) describió que la linea celular EPC era la más sensible a los efectos citopáticos inducidos por el virus DEN Y que otras linees celulares mostraban sensibilidad inconsistente. Challa y SORIANO (1974) cultivaron el virus DEN en células de mamífero (BHK-21 y W1-38) y reptiles (614-1 y FH-2), pero los títulos obtenidos eran más bajos que en lineas celulares de peces.
Buen y lanzan (1980) y Osaren» a al. (1985) definieron procedimientos para ensayar el virus 11114 en cultivo celular, especificando la incubación, el medio, la densidad celular• el volumen a Inocular, las condiciones de tampón, el tiempo de adsorción y la temperatura de Incubación.
Aunque los distintos perfiles electroforéticos de proteínas estructurales víricas sugieren la existencia de cepas de virus 'MI, los tests de neutralización indican la existencia de un solo serotipo de virus IHN. El virus puede ser Identificado por neutralización y reacciones con anticuerpos fluorescentes (Hitt et aL, 1975; McAlasrea et al., 1974; MCCAIN et 1971) por inmunoblot y por inmunoblobELISA (fig. 13) (Dime y Haz, 1984: Hm y &ONO. 1986; Mcfausite y Sama 1986).
El suero htperinmune se prepara generalmente en conejos, pero los títulos de neutralización de la 'afectividad son normalmente bajos debido a que el virus ¡KR es un inmunógeno débil (Ana 1981b). La comparación entre el titulo de anticuerpos que pueden unirse al virus y los anticuerpos neutralizantes da un saldo a favor de los primeros (Hsu y Lioso, 1985; McALLISTER y SCH11.1. 1988). aman et al. (1986) desarrollaron un hibridoma que secreta 103 especifica contra el virus Dial El anticuerpo monoclonal se une al virus, pero tiene propiedades neutralizantes débiles. ARAKAWA et s.1. (1986) describieron anticuerpos monoclonales neutralizantes del virus.
Transmisión
La transmisión horizontal se da cuando animales infectados con el IIDTV esparcen el virus a través de las heces, orina y productos sexuales, contaminando huevos. alevines y peces adultos. El virus puede permanecer infeccioso durante meses en el agua (TORANZO y Hrnucx 1982; Wrnaartes et aL, 1978) y se une a sedimentos de ríos y canales y a los limos de las paredes de los incubadoras de huevos. El contacto efectivo con el hospedados se establece a través de las agallas y del tracto gastrointestinal y los supervivientes a la Infección se convierten en portadores de virus. Marcan( et al. (1983c) Indicaron que la enfermedad no podía progresar hacia los órganos hasta que no se alcanzaba un titulo de aproximadamente 106 UFP/gramo en las agallas y que los virus del agua probablemente no afectaban el nivel de infección durante la puesta
El titulo vírico en los fluidos de ovario varia desde indetectables hasta alrededor de 1.010 OFP/m1. Los virus se hallan presentes en los huevos a las 3 h, pero no a les 24h después de la fertilización (Mtrecexv y PASMO, 1988). Los huevos son al menos superficialmente contaminados por los virus. Los virus lambían se unen con alta eficiencia al esperma (MricArnr y Pascua, 1984). La transmisión vertical probablemente ocurre, pero afecta a una muy pequeña proporción de huevos (Mtricaur y PASOS), 1986; Merecure et al., 1983c). les virus han sido recuperados de huevos muertos y de embriones muertos parcialmente desarrollados, indicando que los huevos fueron infectados antes o durante la fertilización y que el virus replica en tejidos embrionarios. Macean* y PASCHO (1985) sugirieron que los huevos muertos por el virus HIN pueden ser un reservorio de infección para los alevines, Los enseres de la •hatchery• y los ectoparásitos (sanguijuelas) pueden ser vectores mecánicos del virus HEN. A pesar de los intentos fallidos de Bussesaci et al (1978) de demostrar la replicación visita en la mosca DrOSoPhila melanogaster, SCOTT et al (1980) volvieron a sugerir la idea de que posiblemente los insectos eran vectores potenciales o reservorios de infección.
Experimentalmente la infección puede ser inducida por cohabitación, exposición por inmersión, inyección y alimentación.
Factores que afectan la enfermedad
La sintomatología &Mica de la enfermedad puede manifestarse a los 21-35 días después del destete (Aman. 1971 Mincarre el al, 1983a). La mayor incidencia de mortalidad ocurre en peces de 3 semanas a 6 meses de edad. Aunque la mortalidad se ha dado en peces de 12-16 meses de edad, las epizootias en éstos y peces de mayor edad son infrecuentes (Amarro et al, 1973; SUME y GaISCHICOwSKY, 1984).
La temperatura a la que se da mas mortalidad asociada a epizootias es 12-15°C, como se juzga por la alta mortalidad y el bajo tiempo medio en llegar la muerte (Emita et al.. 1979a). Altos niveles de mortalidad ocurren a temperaturas más bajas. pero la epizootia aparece más tarda AMENO (1970) indicaba que los brotes de enfermedad no ocurren naturalmente por andina de loa 16° C. Al igual que con otros RabdovIrus de peces, el efecto de la temperatura del agua puede estar relacionado con la producción de Interferón (de Karates< y Le BARRE, 1974a). AME= y Surco (1974) y Parra et al (1976) demostraron la existencia de anticuerpos neutralizantes en supervivientes tanto de infecciones naturales como experimentales, pero blueceirv et a! (1984a) vio poca evidencia de anticuerpos neutralizantes del virus en peces adultos en puesta
La «hatchery» Introduce factores de sonsa masificación, manipulación, nutrición y exposición quimba, que incrementa el potencial para la expresión del virus y los brotes de enfermedad epizoótica. Multar( et al (1983a) encontraron altos niveles, relativos, de virus en el agua cuando los peces eran mantenidos a alta densidad durante la puesta Manten es al (1979b) encontraron que peces estrenados por exposición a niveles subletales de cobre en el agua eran significativamente más susceptibles a la infección vírica. Aunque Mireccry y BatTERSIT.LD (1983) no observaron efectos estadisticamente significativos de los cargamentos de huevos en la mortalidad, sugirieron que las altas densidades de alevines en lee cajas de huevos permitían el máximo contacto entre los animales para favorecer la transmisión del virus, una situación contraria a las condiciones de puesta natural. El sures asociado a los rigores y cambios fisiológicos de la puesta promueve la recurrencia de la infección por el virus de IHN en los adultos.
Control de la enfermedad
La forma más eficaz y barata de controlar la IHN es previniendo el contacto entre los virus y los hospedadores; sin embargo. prevenir el contacto es un proceso difícil de conseguir. Desechar los stocks de reproductoras infectados y desinfectar los huevos con iodóforos seria parcialmente efectivo, pero se han producido numerosas epizootias a pesar de estas estrategias de control. WEDMILYER et al. (1978. 1979) demostraron que las entradas de agua podían ser efectivamente desinfectadas utilizando ozono. Mem (1970. 1976) indicaron que manteniendo los peces a temperaturas elevadas (17"C o mas) se reducía la mortalidad, pero no necesariamente se prevenía el desarrollo de estados portadores. Posteriormente. estudios de Harma et al. (1979a) y alcioany cc al. (1984b) demostraron que probablemente sólo la cepa del virus IHN aislado por COLEMM4 podría ser controlado por elevación de la temperatura.
AMIIM) y Nnsox (1977) y MCIMYRE y /941270 (1978) demostraron que la resistencia a la ¡KM podía ser heredable y reforzada por cruces selectivos. PARSONS et al. (1986) encontraron que híbridos triploides (hembras de trucha arco fría triploide X machos de salmón sobo) son viables y resistentes a administraciones experimentales del virus IHN.
Se han probado antiviricos en cultivo celular para inhibir la replicación ~lea (Mem, 1976: Rosas y SABEYCSHI, 1985). Dos compuestos fueron probados en animales vivos y loa animales tratados mostraron un mayor porcentaje de supervivencia (64Moirosina y 1-13-D-ribolbranosil-5- 111droxluracii) (Hmost y 8MIEYOSHI, 1986). Farra et aL (1978) demostraron la eficacia de una vacuna con un virus avirulento de la DIN. Niammuas et al. (1988) demostraron la eficacia de una vacuna con un virus Inactivado y LIMPIO (1984) demostró la eficacia de una vacuna con una subunidad del virus de la DIN. las investigaciones con virus vivos atenuados van progresando lentamente. Los intentos de Inmunización con vacunas reactivadas o con subunidades víricas mostraron que los peces eran protegidos contra administraciones letales cuando eran Inmunizados por inmersión o inyección Intraperitoneal.
Virus de la septicemia hemorrágica vírica (Virus Egtved)
La septicemia hemorrágica vírica (VHS) te una enfermedad muy seria descrita inicialmente en la trucha arco tris. La enfermedad inicialmente descrita, probablemente, por SCHAPERMAUS (1964) y ha sido citada bajo varios nombres. entre los cuales destacan •Intekticee Nterenschwellung und Leberdegeneration (INUL).. y «Egtved (112/1112/». Por consenso internacional la enfermedad fue designada como Adral hemorrhagic septicemia. La etiología vira] de la VHS fue establecida cuando aisló el virus de VHS, utilizando cultivos celulares primarios de ovario de trucha arco Iris
Hospedadores y distribución geográfica
El virus de la VHS produce infecciones naturales en la trucha arco iris, la trucha fano, tímalo y lucio. Bajo condiciones naturales, los siguientes peces son generalmente resistentes a la infección, pero han sido infectados experimentalmente: trucha Salvelinus, trucha «golden», híbridos de trucha arco iris X salmón coho, salmón atlántico, carpin dorado, lubina y rodaballo. Los salmones coho y chinnok, la carpa común, el leucisco cabezudo, la perca eurasiática, el rutilo común y la tenca son resistentes a la infección por el virus de VHS. En caregonos y truchas lacustres americanas se sospechan brotes de VHS. Hasta la fecha, la VHS sólo ha sido diagnosticada en Europa del Este y Oeste. Muchos países han instaurado rígidas normas de importación para limitar la diseminación del virus.
Sintomatología clínica
Los síntomas clínicos que aparecen en una epizootia de VHS varían según el grado de severidad de la infección (BELLE'', 1965; GinTrim, 1973; MEIER, 1980; YASUTAKE, 1970). Los síntomas agudos están asociados a una, rápida aparición de alta mortalidad. Los peces están letárgicos, oscuros, exoftálmicos y anémicos. Las hemorragias son evidentes en los ojos, piel y agallas y en la base de las aletas. Internamente se observan hemorragias puntiformes en los tejidos perioculares, milsculo esquelético y vísceras; el hígado aparece moteado y hemorrágica y los rifiones se hallan enrojecidos y delgados. En peces con infecciones crónicas, la mortalidad es moderada, pero persistente. Los peces están letárgicos, con color oscuro, exoftálmicos y anémicos.; la hemorragia es moderada y el abdomen se halla marcadamente distendido debido al edema del hígado, riñones y bazo. El hígado aparece pálido y con áreas patequiales y los riñones están grisáceos. En las infecciones latentes, la mortalidad es baja y los peces tienen una, apariencia normal, pero pueden estar hiperactivos. Los portadores inaparentes de virus no muestran signos clínicos de VHS.
FLONDRO et ad. (1984), GEORGIEV y KAMENOV (1980) y HOFFMAN et ad. (1979) estudiaron parámetros hematológicos en infecciones naturales y experimentales. Los peces con VHS tienen disminuidas las proteínas totales sanguíneas, pero la fracción de inmunoglobulinas se halla incrementada. Los cambios en la relación cuantitativa de proteínas se refleja en los perfiles electroforeticos sanguíneos. Los valores bajos de hematocrito y hemoglobina son indicadores de severa anemia que ya ocurre en las fases iniciales de la enfermedad. Cuando va progresando la enfermedad, incrementa el número de eritrocitos inmaduros.
Cambios histológicos
Los cambios histologías suelen estar conformados al hígado, riñones, bazo y musculo (AMLACHER et ad., 1980; ELGER y HENTSCHEL, 1983; HOFFIVIAN, 1971; YASU'TAKE, 1970). El hígado y los sinusoides están congestionados de sangre y los laepatocitos presentan cambios necrobioticos extensivos y focales, vacuolas citoplasmáticas, picnosis, cariolisis invasión de linfocitos y ocasionalmente inclusiones intracitoplasmáticas e intranucleares. Cambios similares se dan en el bazo y en el tejido hematopoyético y elementos renales de los ritiones. La necrosis del tejido linfoide lleva a la leucopenia. Se acumulan células sanguíneas, principalmente eritrocitos, en las fibras y haces musculares, pero se da poca lesión del tejido muscular. En peces infectados cronicamente los sinusoides hepáticos permanecen abiertos, pero contienen coágulos plasmáticos; los tejidos hematopoyéticos renal y esplénico y las células linfoides mononucleares devienen hiperplasicos. Los cambios de los glomerulos renales se parecen a la glomerulonefritis membranosa de los mamíferos. En los portadores asintomáticos no se han observado cambios histopatológicos.
HOFFMAN et ad. (1979), WIZIGMANN y HOFFMAN (1982) y YASUTAKE y RASMUSSEN (1968) estudiaron los cambios histopatológIcos en las infeccionas inducidas experimentalmente. Los cambios mas tempranos ocurren en el endotelio del corazón, rifiones y bazo, seguido de destrucción de los tejidos hematopoyéticos y linfoides de los riñones, bazo y páncreas, y degeneración del tejido parenquimatoso del hígado. Cuando la infección va progresando, se observa disminución de macrófagos y recuperación de los elementos hematopoyéticos esplénicos y renales. La degeneración tisular correlaciona con la prevalencia del antígeno viral. La microscopia electrónica revela virus en sangre, agallas y riñón anterior, pero no en secciones de hígado, bazo, cerebro o corazón (AMLACHER et ad., 1980; CHILMONCZYK, 1980; OzEL y SCHWANZ-PFITZNER, 1975; ZWII .1-;FINBERG, 1964).
Aislamiento e identificación del virus
El virus VHS puede recuperarse de homogenados de órganos internos, productos sexuales y orina. El riñón anterior y bazo rinden una mayor concentración de virus que el hígado, corazón y musculo (HOFFMAN et al., 1970; JORGENSEN, 1970, 1982a; de KINKELIN, 1983; MENEZES, 1977; NEUKIRCH y GLASS, 1984). Las muestras de cerebro pueden ser también incluidas cuando se ensayan portadores asintomáticos (CARTRic y de KINKELIN, 1980). De las heces se pueden recuperar títulos insignificantes de virus y la detección de anticuerpos anti-VHS no es un indicador fiable de la presencia o ausencia de infección (DoRsoN y TORCHY, 1979; JORGENSEN, 1982b; NEUKIRCH y GLASS, 1984). Se han detectado infecciones víricas mixtas en las cuales el virus de la VHS se ha aislado de peces infectados a la vez con el virus IPN (CAsTmc y DE 1UNKELIN, 1980; SCHLOTFELDT y FROST, 1975). El aislamiento del virus VHS en cultivo celular es el método de elección para el diagnóstico. El virus replica en una gran variedad de lineal celulares de peces, BF-2, Ca Pi, CHSE-214, EPC, FHM, PG, RTG-2, RTM, STE, y en lubina al igual que en cultivos primarios de tenca, ovario de carpa y carpin dorado (de KINKELIN, 1983; MCALLISTER, 1979). CLARK y SORIANO (1974) demostraron que el virus de la VHS replicaba en células de mamífero (BHK-21 y WI-38) y reptiles (GL1 y TH-1). La temperatura Optima para la replicación del virus en cultivo celular es 14-15°C; las producciones se reducen mucho a 6° C y solo una ligera replicación ocurre por encima de 20° C (de KINKELIN y SCHERRER, 1970). Debido a que la replicación vírica en cultivo celular esta muy influenciada por la concentración de hidrógeno, se debe mantener un pH de 7,4-7,8 durante los ensayos de diagnóstico. (CAMPBELL y WOLF, 1969). La replicación vírica no se ve afectada en cultivos celulares doblemente infectados con el virus IPN (WOLF y JORGENSEN, 1970). La sensibilidad de la detección vírica puede ser reforzada por la adición de DEAE-dextrano (50 leg/ml) durante la adsorción vírica (CAMPBELL y WOLF, 1969). La detección en secciones de tejido mediante tinción con anticuerpos fluorescentes es menos sensible que el aislamiento de virus en cultivo celular (JORGENSEN y MEYLING, 1972; PFEIL y WIEDEMANN, 1977).
Entre las tecnicas serologicas existentes para la identificación del VHS se pueden citar la neutralización vírica, la inmunofluorescencia, la inmunoperoxidasa, la fijación del complemento, la Inmunoprecipitación, inmunoelectroforesis a contracorriente e .inmunoblot. ELISA (fig. 13) (AHNE, 1981b; de KINKELIN, 1983; MCALLISTER y ScRILL, 1986; ENZ/VIANN y KONRAD, 1985). Por medio de la neutralización serica se pueden distinguir tres serotipos del virus de la VHS (F1, F2 y 23,75) (LE BERRE et al., 1977). Para la identificación vírica, se utiliza un antisuero polivalente compuesto o tres antisueros. MEIER y JORGENSEN (1975) describieron un ensayo de fluorescencia indirecta por anticuerpos y FAISAL y AENE (1980) un procedimiento de tinción por inmunoperoxidasa para la detección del antigen viral en cultivos celulares inoculados. MCALLISTER y SCHILL (1986) describieron un ensayo de Rinmunobloto para la detección e identificación del virus VHS en fluidos de cultivo celular (fig. 13) y.MCALLISTER y OWENS (1987) citaron que los tres serotipos del virus VHS pueden ser identificados por un ensayo de 1<imnunobloto utilizado solo antisuero del serotipo Fl.
El suero hiperinmune para la identificación del virus suele producirse en conejos, pero, al igual que el virus IEN, el virus VHS es un débil iru-nunOgeno y es por ello que los títulos de anticuerpos son generalmente bajos (ANNE, 1981b). Se han desarrollado hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales específicos contra el virus de la VHS (P. E. MCALLISTER, comunicación personal).
Transmisión
El virus de la VHS puede ser transmitido a peces de prácticamente todas las edades como resultado de la effusion del virus. El virus se ha aislado de peces salvajes de aguas que reciben efluentes de hacheries)■ (JORGENSEN 1980, 1982a; ENZMANN y KoNRAD, 1985). El virus entra en el pez a través de las lamelas secundarias de las agallas CHILMONCZYK, 1980; CHILMONCZYK y MONGE, 1980). Los supervivientes de la infección pueden actuar como portadores y esparcir el virus en la freza; sin embargo, parece que el virus solo se encuentra contaminando la superficie del huevo y se puede dispersar muy fácilmente. JORGENSEN (1970) pudo aislar virus de huevos de 3 o 4 horas después de la puesta, pero no pudo demostrar una verdadera transmisión vertical. La transmisión experimental se ha conseguido a través de cohabitación, inmersión, inyección intraperitoneal e intramuscular, depositando suspensiones víricas en las agallas y por alimentación (CAsTrac y DE KINKELIN, 1984; DE KINKELIN y CASTRIC, 1982; JORGENSEN, 1980, 1982b; NEUKERCH, 1984).
La transmisión por vectores pasitos fue propuesta por BELLET (1965) y ZWILT,ENBERG y ZWILIENBERG (1986) y ha sido demostrada en otros virus de peces (CusAcx y CONE, 1986), pero no existen datos que avalen la hipótesis en el caso del virus VHS. La posibilidad de que ayes o insectos actúen como vectores ha sido también considerada. OLESEN y JORGENSEN (1982) y PETERS y NEUKIRCH (1986) demostraron que las garzas (Ardea cinerea) podían ser vectores mecánicos de transmisión del virus VHS. ESKILDSEN y JORGENSEN ( 1973) encontraron que el virus era inactivado en el tracto gastrointestinal de gaviota. (Laurus ridibundus). BUSSEREAU et al. (1975) describieron que el virus no podía replicar en la mosca Drosophila, melanogaster. La diseminación mecánica por medio de objetos contaminados de la piscifactoría representa un peligro.
Factores que afectan la enfermedad
Peces de todas las edades son susceptibles a la infección, aunque alevines con saco vitelino y anti-hales de mas de 6 meses de edad pueden presentar cierta resistencia ( BELLET, 1965; Giirrri No, 1965). La mortalidad es mayor a temperaturas de 3 a 5° C, mientras que a temperaturas por encima de los 15° C raramente ocurre la enfermedad. Los brotes de epizootias de la enfermedad ocurren desde 6 a 12°C, pero la mortalidad y la proporción de portadores de virus decrece a altas temperaturas (de KINKELIN, 1983; NEUKIRCH, 1984). Los peces infectados experimentalmente muestran una alta síntesis de interferón, pero finalmente suelen sucumbir a la infección (DoRsoN et al., 1975a; de KINKELIN, 1973; de KINKELIN et al., 1977a). El interferón puede jugar su papel en la reducción de la incidencia de la VHS a altas temperaturas (DoRsoN y de KINKELIN, 1974a; de KINKELIN et al., 1982). Se ha demostrado la síntesis de anticuerpos neutralizantes en peces infectados experimentalmente, pero la respuesta de anticuerpos en los supervivientes de la epizootia y en las infecciones inaparentes es variable (DoRsoN y ToRCHY, 1979; DORSON et al., 1979; JORGENSEN, 1971, 1974b; de KINICELIN et al., 1977a).
Aunque en peces salvajes se han detectado infecciones inaparentes (ENzmANN y KONRAD, 1985; JORGENSEN, 1982b), la enfermedad es muy infrecuente en los ambientes naturales. Esto sugiere que el stress asociado a las condiciones de cultivo y factores ambientales puede reforzar la susceptibilidad o inducir la recurrencia de la infección (de KINKELIN, 1983; GHIMNO, 1965, 1973; TESARCIK et al., 1968).
Control de la enfermedad
Para controlar la VHS el método mas eficaz es evitar el contacto entre el virus y el hospedador. JORGENSEN (1974a) y KEHLET (1973) describieron un programa sistemático de desinfección de las hatcheries o combinado con una reposición de huevos y peces certificados específicamente como libres del patógeno. El programa ha tenido, al menos parcialmente, exit() (ENzmANN, 1983). Los huevos utilizados para la reposición han sido descontaminados por tratamientos con iod6foros (CoNRoY y SANTACANA, 1980; ESTULDSEN y JORGENSEN, 1974; FUHRMANN y SAVVIDIS, 1984). El agua aportada debe estar libre de virus; MAISSE et ad. (1980) utilizaron radiaciones ultravioletas para inactivar los virus VHS en el agua de entrada. Las condiciones que promueven el stress fisiológico deben ser identificadas y evitadas. Aunque la VHS raramente ocurre por encima de los 15° C, el control de la enfermedad por manipulación de la temperatura no ha sido descrito. El intento de selección de los reproductores para incrementar la resistencia del hospedador no ha funcionado (MARGARITOV, 1969; ORD et ad., 1976).
JORGENSEN (1976), de KINKELIN y LE BERRE (1977) y GERARD (1977) indicaron la posibilidad de desarrollar una vacuna, con virus avirulentos de VHS. Se ha seleccionado en la linea EPC e incrementando progresivamente la temperatura (de KENKELEN et al., 1980; de KINRELIN y BEARZOITI, 1981). Dicha cepa (F25) replica a 25°C, mientras que el virus tipo salvaje del cual procede no. JORGENSEN (1982b) prepare) un virus de baja patogenicidad (Reva) por pasajes seriados en la linea celular RTG-2. Ambas cepas, F25 y Reva, inducen un efecto protector, pero retienen patogenicidad residual. El mecanismo de la respuesta protectora es poco claro. JORGENSEN (1982b) describe) una protección parcial a 5-15° C, pero no a 20°C, mientras que los anticuerpos neutralizantes se forman de 5 a 20° C. BERNARD et al (1985) sugirieron que ocurría un mecanismo temprano en las 48 h postinmunizacion y que era el responsable de la protección y que la producción de anticuerpos ocurría mas tarde. La estimulación de la síntesis de interferón podía ser la responsable de la protección temprana. Los alevines pueden ser protegidos por la inyección de interferón (de KINKELIN et al., 1982). Aunque se ha demostrado el efecto protector de las vacunas avirulentas, en el laboratorio existen pocos datos que demuestren la eficacia de la vacuna bajo condiciones de producción (de KINKELar, 1982; ENZMANN, 1983). Tas vacunas avirulentas pueden tener un valor limitado para controlar las poblaciones de peces sanos (ENZMANN, 1983).
Virus de la viremia primaveral de la carpa (Rliabdoviru,s carpio)
Una enfermedad conocida por nombres tales como hidropesía infecciosa, rubeola, septicemia hemorrágica y ascites infecciosos, ha causado serial perdidas en carpas cultivadas. La enfermedad es ahora conocida como un complejo de al menos dos enfermedades: la forma ascética aguda o la viremia primaveral de la carpa (SVC), causada por el Rhabdovirus carpio o virus SVC (FIJAN et al., 1971), y la forma ulcerativa crónica, eritrodermatitis de la carpa, causada por una bacteria asignada al grupo de las Aeromonas salmonicida (BooTsmA et al, 1977).
Un rabdovirus designado como SB1 o 10/s ha sido aislado de carpas que presentaban signos de inflamación de la vejiga natatoria; el virus es antigenicamente indistinguible del R carpio (BACHMANN y AHNE, 1973; HILL et al., 1975; DE KINKELIN y LE BERRE, 1974b).
Hospedadores y distribución geográfica
El virus SVC ha sido aislado de larvas, alevines, juveniles y adultos infecta,dos natural o experimentalmente de carpa ormino y carpa hervivora y de infecciones naturales de la carpa plateada, el carpin y alevines de ,,sheatfish,, (FIJAN, 1976; FIJAN et al., 1981). Lucios y olominas son susceptibles a la infección experimental (BACHMANN Y AI E, 1974; DE KINKELIN et al., 1973). Otras especies de peces pueden ser susceptibles a R carpio (BoursmA y EBRET, 1983). BUSSEREAU et al. (1975) describieron que el virus replicaba en la mosca Drosophila melanogaster. La enfermedad ha sido identificada en Gran Bretaña y posiblemente en el Medio Este y en la mayoría de países del Este y Oeste de Europa (BucKE y FINLAY, 1979; FIJAN, 1976; HINES et al., 1974).
Signos clínicos
FIJAN (1972) y FIJAN et al. (1971) describieron los síntomas clínicos de la enfermedad SVC. Los peces afectados aparecen oscurecidos y exoftálmicos. Las agallas están pálidas, el abdomen esta distendido y con hidropesía, y una cadena gruesa mucoide puede desprenderse del ano inflamado. Los peces respiran débilmente y están letárgicos; en ocasiones pueden presentar perdidas del equilibrio natación descoordinada, fibrilaciones musculares e hiperactividad esporádica. Se da peritonitis y enteritis y en las agallas aparecen petequias al igual que en la piel, Órganos internos, cerebro, musculo esquelético y la pared interna de la vejiga natatoria. Prácticamente todos los Órganos internos se encuentran edematosos. El rition anterior y el intestino son los primeros tejidos macroscopicamente afectados.
Cambios histológicos
Los cambios histopatológIcos asociados con la enfermedad SVC han sido descritos por RUDIKOV et al. (1975) y NEGELE (1977). En el tejido subcutáneo y musculo esquelético pueden presentar edema inflamatorio y diapedesis focal. En el hígado se disocian los hepatocitos y subyacen cambios necrobioticos multifocales y citolisis; los vasos sanguíneos también pueden presentar diapedesis difusa y necrosis. En el bazo se incrementan los elementos linfáticos y hemostáticos , y hay una considerable hiperplasia del sistema reticulo-endotelial. El páncreas presenta infiltración leucocitaria, inflamación y citolisis. En los rifiones se da necrosis focal del epitelio tubular y el lumen ester repleto de células degeneradas. Se acumula fluido serio en los glomerulos y el tejido hematopoyético se necrotiza. Se observa también edema vascular e infiltración celular en los tejidos cardíaco y cerebral y en las membranas intestinales.
Aislamiento e identificación del virus
El Rhabdovirus carpio ha sido aislado de la mayoría de órganos y tejidos (AHN-E, 1978a; BAUDOUY et al., 1980a, b; BEKESI y CSONTOS, 1985; y BOOTSMA y EBREGT, 1983; FIJAN et al., 1971). Los órganos que dan títulos mas consistentes de virus son el hígado, rifiones y bazo, pero se pueden aislar virus de sangre, cerebro, agallas, corazón, intestino, musculo, fluidos mucosos y heces, vejiga natatoria y productos sexuales. El virus no se ha aislado nunca del tejido de la piel.
Una gran variedad de lineas celulares de peces, ayes, mamíferos y reptiles permiten la replicación del R carpio, pero los títulos virales obtenidos varían. El virus replica bien en las lineas BB, BF-2, CaPi, EPC y FHM, y en cultivos primarios de ovario, corazón y vejiga natatoria de carpa, pero pobremente en células derivadas de trucha arco iris (BACHMANN y Am\TE, 1974; BoarsmA y EBREGT, 1983; FIJAN et al., 1971; DE KINKELIN y LE BERRE, 1974b; RIBEIRO y Aim, 1983). La replicación del virus ha sido también conseguida en embriones de polio, lineas celulares de mamíferos (ninon fetal de ternera, MDCK, SK, BHK-21, HEp-2, WI-38 y Vero) y reptiles (GL1, TH-1, VSW y VH-2) (BACHMANN y ASE, 1974; CLARK y SORIANO, 1974). Rhabdovirus carpio replica en cultivo celular a temperaturas de 4 a 32° C. La temperatura Optima de replicación en la linea FHM es 20-22° C, en la BHK-21 24-26° C y en la GL1 17-32° C.
Para identificar el virus se han utilizado ensayos de neutralización, inmunofluorescencia, inmunoperoxidasa, Inmunoprecipitación y hemaglutinación indirecta (AR NE, 1982; FIJAN, 1976; HILL et ad., 1975; SULIMANOVIC, 1973). Para las reacciones serológicas se utiliza suero hiperinmune de conejo y carpa. FAISAL y AHNE ( 1984) utilizaron tecnicas de inmunoperoxidasa e inmunofluorescencia indirecta para detectar e identificar el antigen del virus SVC en trotes congelados de hígado, ritiones y bazo.
La detección de anticuerpos neutralizantes en el suero de carpa ha sido extensamente utilizado para determinar la distribución del virus (HoPpE y WERNERY, 1985; WIZIGMANN et al., 1980, 1983).
Transmisión
La transmisión del R carpio se da por medio de virus que se hallan en el agua y por el desprendimiento de virus en las heces y mucus (Alms, 1978a; PFEIL-PUTZIEN y BAATH, 1978). Las agallas son la principal vía de entrada del virus y la subsecuente viremia esparce el virus al resto de órganos y tejidos (AHNE, 1977a, 1978; BAUDOUY et al., 1980a, b). En la puesta los huevos pueden contaminarse con virus que se hallan en los productos sexuales (BEK-zasi y CSONTOS, 1985). La enfermedad ha sido producida experimentalmente por cohabitación, inyección intraperitoneal e intracraneal, por intubacion del virus en el intestino y por inmersión, pero no por aplicación del virus en lesiones epidérmicas (FIJAN, 1972; FIJAN et ad., 1971; HILL, 1977).
Los piojos de la carpa (Argulus foliaceus) y la sanguijuela (Piscicola geómetra) son vectores mecánicos de R carpio (AHNE, 1985a; PFEIL-PUTZIEN, 1977), pero los virus no replican en los parásitos. BUSSEREAU et ad. (1975) demostraron que el virus replica en la mosca Drosophila melanogaster, pero no se ha descrito una transmisión vía un insecto como vector. La diseminación mecánica del virus por medio de objetos contaminados de la piscifactoría representa un peligro (FIJAN, 1973).
Factores que afectan la enfermedad
Peces de todas las edades son susceptibles a la infección de SVC, pero las perdidas mas severas se dan durante el primer ano de vida. La severidad de la enfermedad ester influenciada por una, variedad de factores del hospedador, virus y ambiente. BAUDOUY et ad. (1980b) concluyeron que el estar en las condiciones térmicas fisiológicas Optimas es lo que determina el progreso de la enfermedad. A temperaturas bajas (<10°C) la respuesta inmune del hospedador esta reducida o no se produce y la replicación del virus es lenta, pero la patogenicidad viral no se reduce y la enfermedad es fatal. A temperaturas desde 11 a 18° C la sintomatología clínica típica se produce, pero algunos peces sobreviven. A temperaturas por encima de los 18° C, una respuesta inmunitaria prolongada hace que la probabilidad de sobrevivir aumente al aumentar la temperatura (ABNE, 1980; FIJAN, 1976; FIJAN et ad., 1971). Como respuesta protectora, encontramos ya en estadios tempranos de la enfermedad la producción de interferón; sin embargo, la producción de interferón al igual que la de anticuerpos neutralizantes esta directamente afectada por la temperatura (BAUDOUY, 1978; DE KINKELIN et al., 1982). La síntesis de interferón se da ya en las primeras 48 horas después de la infección; mientras que la producción de anticuerpos neutralizantes ocurre semanas después de la infección (Kum, 1980; BAUDOUY, 1978).
HILL (1977) encontró que carpas cultivadas eran mas resistentes a la enfermedad del SVC que las carpas salvajes cuando eran infectadas por inmersion o por inyección intraperitoneal. No se ha investigado muy extensamente la susceptibilidad de distintas cepas de carpas a la infección vírica.
Las condiciones de cultivo que promueven el stress, tales como la masificación, excesiva manipulación, mala calidad del agua, malnutrición o cambios repentinos de temperatura, incrementan la susceptibilidad a la enfermedad (FIJAN, 1972; STANKEEWICZ, 1979).
Control de la enfermedad
Los métodos convencionales del cultivo de la carpa, en los males se utilizan enormes estanques abiertos can aportes de agua de rio, hacen difícil el control de la enfermedad del SVC. Medidas profilácticas tales como la desinfección de los estanques y equipamiento y descontaminacion de los huevos por tratamientos can iodóforos tienen mas probabilidades de exit° en pequeñas granjas con aportes de agua controlados (Am y HELD, 1980).
FIJAN (1973, 1976) sugirió que el mantenimiento continuo a 20-22° C protegería a los peces de la enfermedad, pero tales condiciones ambientales no son económicamente plausibles a no ser que se utilicen aguas provenientes de fuentes termales o efluentes de plantas eléctricas.
Numerosos estudios de laboratorio han demostrado que la inmunización induce una respuesta inmune protectora que se desarrolla rápidamente a temperaturas por encima de los 20° C (AHNE, 1980; BAUDOUY, 1978; FIJAN y MATASIN, 1980). Los peces han sido inmunizados con preparaciones de virus infecciosos e inactivados (FIJAN, 1981) "as vacunas de virus inactivados deben ser administradas por inyección intraperitoneal debido a que la captación de virus es demasiado baja para una vacunación por inmersión eficaz (de KINKELIN et ad., 1984). Los peces deben ser inmunizados en verano y °ton° para prevenir la enfermedad, aguda en primavera (FIJAN et ad., 1977a, b; KOELB y KAINz, 1977). TESARCIK y MACURA (1981a, 1981b) describieron que la inmunización es ineficaz si los peces están infectados ya con R carpio o si están filosóficamente estresados. MAGMA et ad. (1983) desarrolló una vacuna de virus inactivados que fue utilizada con éxito en experimentos en plantar piloto. Después de la vacunación no se produjo la enfermedad del SVC y se podían detectar anticuerpos neutralizantes aun a los 18 meses (TEsARcrx et ad., 1984).
Rabdovirus de las anguilas
Al menos se han aislado tres rabdovirus antigenicamente distintos de anguilas. Dos virus (EVA y EVEX) han sido aislados de anguilas importadas por Japón. El EVA fue aislado de ejemplares moribundas de anguilas americanas de Cuba y el EVEX de anguilas europeas de Francia aparentemente sanas (SANo, 1976; SANG et ad., 1977a). Dos virus (C30 y B12) fueron aislados de anguilas salvajes aparentemente sanas en Francia (CABTRic y CHASTEL, 1980; GASTRIC et ad., 1984). CASTRIC et ad. (1984) demostraron que el EVEX y el C30 eran probablemente idénticos. HILL et ad. (1980) demostraron que el EVA y EVEX estaban fuertemente relacionados, pero que eran antigenicamente distintos, y lo mas probable era que se tratase de cepas del mismo virus. EVA y EVEX son del subgrupo de los vesiculovirus y el B12 pertenece al subgrupo de los lisavirus.
Signos clínicos y cambios histológicos
Los signos clínicos de la enfermedad en peces infectados con EVA y EVEX son muy similares y se parecen a los cambios histopatológicos de la IHN y VHS (HILL et ad., 1980; NismNruRA et al., 1981; SANG, 1976). Los peces se vuelven oscuros y letárgicos; se producen hemorragias en las aletas pectorales y anales, en la piel abdominal, en el músculo esquelético y en los rifiones. Los cambios histopatológIcos incluyen degeneraciones hemorrágicas del imisculo esquelético, y hemorragia intensa y necrosis del tejido hematopoyético renal, hemorragias en los túbulos renales y en el espacio de Bowman y necrosis focal del hígado, bazo y páncreas. Los alevines de trucha arco iris son susceptibles al EVA y EVEX por inyección intraperitoneal. La mortalidad debida a inyección del EVA es mayor a 20° C y al EVEX es mayor a temperaturas por encima de los 10° C (NisHimuRA et ad., 1981). No se observo mortalidad en anguilas y angulas japonesas inyectadas con EVEX. Anguilas americanas infectadas naturalmente, mantenidas a 20-27° C, sufrieron alrededor de un 60% de mortalidad (SANo, 1976). CASTRIC et al. (1984) sugirieron que los virus EVEX y B12 son endémicos en la población de angulas del estilario del Loira (Francia). Los aislamientos víricos de angulas sanas sugiere que son portadores asintomáticos. CASTRIC y CHASTEL (1980) encontraron que la administración experimental con B12 y EVEX a varias temperaturas por inmersión e inyección intraperitoneal no producía mortalidad ni en angulas ni en anguilas jóvenes.
Aislamiento vírico e identificación
Los virus EVA y EVEX fueron aislados en las lineas celulares FHM y RTG-2 a 15° C y además replica en la linea EPC dice 10 a 25° C. El virus B12 replica en las células EPC a 10-14°C, pero no a 20° C, y no replica en la linea RTG-2. Los virus EVA, EVEX y B12 pueden ser detectados utilizando las células EPC incubadas a 14°C. SORIMACHI (1982) estudió varios aislados víricos de anguila en varias lineas celulares de anguila y otros peces.
Los aislados EVA y EVEX son serológicamente distintos por el ensayo de neutralización de la infectividad de los virus IHN, VHS, B12, e IPN y del rabdovirus de la perca (HILL et al, 1980). GASTRIC y CHASTEL (1980) y GASTRIC et al. (1984) demostraron que el virus B12 es serológicamente distinto por el ensayo de neutralización de los virus IHN, VHS, SVC, EVA, EVEX e IPN y del rabdovirus de la perca.
Rabdovirus del síndrome ulceroso ( =ulcus) del bacalao
Signos clínicos y cambios histológicos
El síndrome ulceroso es una enfermedad infecciosa que ocurre principalmente en bacalaos de 1-2 &nos de edad en la costa báltica de Dinamarca. Las lesiones papulo-ulcerativas se encuentran principalmente en las superficies laterales del cuerpo. Las lesiones aparecen mas frecuentemente durante el verano y otoño temprano y la cura de las lesiones se observa a finales de otoño cuando las temperaturas del agua son de aproximadamente 7°C. JENSEN y LARSON ( 1979) documentaron el desarrollo progresivo de las lesiones de la piel desde erupciones papulo-vesiculares múltiples de 2-8 mm de diámetro hasta, las erosionadas ulceraciones de 2-8 cm de diámetro y finalmente las pequeñas cicatrices sanadas Los cambios histopatológIcos aparecían inicialmente como perdidas severas de tejido conjuntivo, edemas en la epidermis y dermis que progresaba hasta edema y necrosis e infiltración celular de la musculatura subyacente antes de sanar. JENSEN y LARSEN ( 1982) sugirieron que el stress ambiental puede ser un factor importante en la aparición de brotes del síndrome ulceroso.
JENSEN et a1. (1979) aislaron un rabdovirus y un iridovirus de bacalao con el síndrome ulceroso. El rabdovirus fue aislado por inoculación de pápulas homogeneizadas sobre la linea PS. El virus no fue aislado de Órganos internos. Partículas típicas de rabdovirus fueron observadas en micrografias electrónicas de cultivos celulares infectados, pero no se observaron virus en las pápulas. A 15° C el virus replicaba hasta un titulo de 10 TCID50 en la linea PS, pero replicaba muy poco en la linea EPC. Lo contrario se observe con el iridovirus. El síndrome ulceroso fue transmitido experimentalmente por cohabitación y aplicando homogenados de pápulas a heridas de la piel (JENSEN y LARSEN, 1982). Con la inoculación intraperitoneal de homogenados de pápulas se observe una transmisión variable mientras que no hubo transmisión por inoculación intranasal. El síndrome ulceroso no puede ser transmitido por inoculación intracardiaca de rabdovirus crecidos en cultivo celular. El papel de los rabdovirus en el síndrome ulceroso es desconocido (JENSEN y LARSEN, 1982).
Rabdovirus hirarne (Rhabdovirus olivaceus)
Los brotes de enfermedad se dan en hirameso (platija japonesa) y alevines de 4, ayu., ambos cultivados en agua de mar en las prefecturas de Hyogo, Kagawa y Hokkaido. Un virus, designado como Rhabdovirus olivaceus o rabdovirus hirame (HRV), fue aislado de peces afectados (G-osJE y NAKAMOTO, 1986; KimuRA et al., 1986).
Signos clínicos
Las muertes en los ejemplares juveniles de fihirame” variaban del 3,3 al 25 %, ocurriendo la mayor mortalidad en invierno con temperaturas del agua de 2-5° C. Los “hirames), infectados muestran hemorragias focales del musculo esquelético y las aletas, acumulación de ascitis, congestión de las ganadas y picnosis y necrosis del tejido hematopoyético. Los alevines infectados de oayuo presentan exoftalmia y petequias en el opérculo.
Aislamiento vírico
El HRV fue originalmente aislado en la linea RTG-2, pero replica en una gran variedad de lineas celulares de salmónidos y no salmónidos a temperaturas de 5 a 20° C. A 25° C o mas no hay replicación vírica. Los efectos citopáticos se desarrollan mas rápidamente en las lineas y RTG-2, mientras que no se observan efectos citopatologicos o se recuperan títulos virales ínfimos en las lineas CHH-1, CHSE-214 y KO-6. El HRV es serológicamente distinto a los otros rabdovirus de peces (IHNN, VHSV, SVCV, EVA y EVEX) y del herpesvirus OMV.
Transmisión
KimuRA et al. (1986) llevaron a cabo tests de patogenicidad del HRV utilizando varias especies de peces. Los alevines de trucha arco iris son letalmente infectados por inyección intramuscular, mientras que los de salmón omasuo, no; sin embargo, se recuperan virus de todas las truchas y de algunos salmones. Poca o nula mortalidad ocurre en alevines de salmones chum, coho, y masu y alevines de oayu» expuestos al HRV por inmersión, pero el virus fue recuperado de algunos peces muertos y de algunos supervivientes. KuvruRA et ad. (1986) se reservaron conclusiones acerca de los ensayos de inmersión debido a que la temperatura del agua podía no haber sido la Optima. GORIE y NAKAMOTO (1986) expusieron juveniles de ohirame» al HRV por inoculación intramuscular e intraperitoneal. Se dio mortalidad en ambos grupos a 10°C y en ninguno a 15° C. El virus fue recuperado en los tejidos renales de los peces que murieron.
Rabdovirus de la hepatitis de salmónidos
Aislamiento vírico, identificación y transmisión
OSADCHAYA (1981) describió un rabdovirus aislado de alevines moribundos y peces de un añil de truchas arco iris y adultos de la misma especie en freza. La enfermedad, que ocurre a 1822° C, fue denominada hepatitis rabdoviral de salmónidos (RHS). Clinicamente, los peces están oscuros e hiperactivos.
El hígado tiene un color de amarillo a gris; el bazo este oscuro y rojizo, y presenta un mayor tamaño del habitual, y los ritiones se presentan moteados y deleznables. Las truchas en freza producían descendencia que desarrollaba hepatitis. Los virus fueron aislados utilizando las células FHM y EPC. Los ensayos de neutralización de la infectividad demuestran que el virus de la RHS es antigénicamente distinto de los virus IHN, VHS e IPN, pero no se han realizado ensayos con otros rabdovirus de peces.
6.2. Biología de los virus
Morfología
Los rabdovirus tienen una forma muy característica de varilla con un extremo de la partícula plana y el otro semiesférico (fig. 18). El virión consiste de una capsida helicoidal interne y una envuelta externa, con peplomeros o espiculas. La envuelta es adquirida cuando la nucleocápsida gema a través de la superficie celular o en las vacuolas citoplasmáticas. Tratamientos con enzimas y detergentes degradan la envuelta liberando la nucleocápsida. Las dimensiones estructurales de los rabdovirus de peces están listadas en el cuadro 6. Las dimensiones de las partículas son afectadas por las técnicas de preparación y por la diferente estabilidad estructural de los diferentes aislamientos de virus. En rabdovirus se ha demostrado la autointerferencia Las partículas autointerferentes son mas cortas que las normales.
Ácido nucleico vírico
Los rabdovirus contienen un genoma de ARN monocatenario que sirve como molde para la síntesis de ARN-m por la polimerasa del virión (proteína L). El genoma de ARN de los rabdovirus tiene un coeficiente de sedimentación de 38 a 40 S, un peso molecular de 3,7 x 106 a 4 x 106 daltons, y una densidad de 1,59 a 1,69 g/mi (KuRATH y LEONG, 1985; MCALLISTER, 1979; PILCHER y FRYER, 1980a). Las condiciones para la transcripción en vitro han sido determinadas para los siguientes virus: IHN, VHS, SVC y PRF (McAnisTER y WAGNER, 1977; ROY y CLEWLEY, 1978; ROY et ad., 1975).
Aislamiento vírico, identificación y transmisión
OSADCHAYA (1981) describió un rabdovirus aislado de alevines moribundos y peces de un añil de truchas arco iris y adultos de la misma especie en freza. La enfermedad, que ocurre a 1822° C, fue denominada hepatitis rabdoviral de salmónidos (RHS). Clinicamente, los peces están oscuros e hiperactivos.
El hígado tiene un color de amarillo a gris; el bazo este oscuro y rojizo, y presenta un mayor tamaño del habitual, y los ritiones se presentan moteados y deleznables. Las truchas en freza producían descendencia que desarrollaba hepatitis. Los virus fueron aislados utilizando las células FHM y EPC. Los ensayos de neutralización de la infectividad demuestran que el virus de la RHS es antigénicamente distinto de los virus IHN, VHS e IPN, pero no se han realizado ensayos con otros rabdovirus de peces.
6.2. Biología de los virus
Morfología
Los rabdovirus tienen una forma muy característica de varilla con un extremo de la partícula plana y el otro semiesférico (fig. 18). El virión consiste de una capsida helicoidal interne y una envuelta externa, con peplomeros o espiculas. La envuelta es adquirida cuando la nucleocápsida gema a través de la superficie celular o en las vacuolas citoplasmáticas. Tratamientos con enzimas y detergentes degradan la envuelta liberando la nucleocápsida. Las dimensiones estructurales de los rabdovirus de peces están listadas en el cuadro 6. Las dimensiones de las partículas son afectadas por las técnicas de preparación y por la diferente estabilidad estructural de los diferentes aislamientos de virus. En rabdovirus se ha demostrado la autointerferencia Las partículas autointerferentes son mas cortas que las normales.
Ácido nucleico vírico
Los rabdovirus contienen un genoma de ARN monocatenario que sirve como molde para la síntesis de ARN-m por la polimerasa del virión (proteína L). El genoma de ARN de los rabdovirus tiene un coeficiente de sedimentación de 38 a 40 S, un peso molecular de 3,7 x 106 a 4 x 106 daltons, y una densidad de 1,59 a 1,69 g/mi (KuRATH y LEONG, 1985; MCALLISTER, 1979; PILCHER y FRYER, 1980a). Las condiciones para la transcripción en vitro han sido determinadas para los siguientes virus: IHN, VHS, SVC y PRF (McAnisTER y WAGNER, 1977; ROY y CLEWLEY, 1978; ROY et ad., 1975).
La estructura del genoma y la síntesis de ARN-m de los virus IHN y SVC han sido extensamente caracterizados. GuprA y ROY (1980, 1981) han descrito los mecanismos de ocappingo y metilación de los productos de transcripción del virus SVC, así como también de la estimulación de la transcripción. GuPTA et al. (1979) y ROY et al. (1984) determinaron la secuencia de nucleótidos en los extremos 3' y 5' de ARN-m sintetizado, (in vitro), y Krucm et al. (1985) clonaron y secuenciaron el ARN-m de la proteína M del virus SVC.
KuRATH y LEONG (1985) y KuRATH et ad. (1985) analizaron el genoma del virus II IN y las especies de ARN-m mediante diferentes técnicas. El genoma vírico codifica para 6 especies de ARN-m y el orden de genes del virus IHN es (3') N-M1-M2- G-NV-L (5'). La transcripción tiene lugar en la dirección 3' a 5'. La secuencia de aparición, modulación y tasa relativa de turnover de las especies de ARN-m no ha sido claramente establecida.
Los rabdovirus de peces se parecen muchísimo a los de mamíferos en cuanto a especies de ARN-m, y tamaño y organización del genoma. Hasta el momento, el virus IHN es único en cuanto que codifica para una sexta especie de ARN-m para una proteína especifica del virus que no es un componente estructural del virión maduro.
Proteínas víricas
Fig. 18. Microfotografía al electrónico mostrando partículas del virus de la septicemia hemorrágica vírica (VHSV) gemando de células RTG-2 y otras libres en el espacio intercelular. De DE KINTICELIN y SCHERRER (1970); reproducido con permiso del Institute National de la Recherche Agronomique.
Los rabdovirus están compuestos de cinco proteínas estructurales especificas del virus. Se diferencian dos subgrupos de rabdovirus en base a los perfiles electroforéticos de las proteínas estructurales.
El subgrupo de los lyssavirus (el prototipo es el virus de la rabia) tiene la estructura proteica L, G, N, M1 y M2 (fig. 19), y el subgrupo de los vesiculovirus (el prototipo es el virus de la estomatitis vesicular tiene la estructura L, G, N, NS y M. Los rabdovirus de peces tienen la misma diversidad estructural descrita en los rabdovirus de mamíferos (McALLIsTER, 1979; FILCHER y FRYER, 1980a). Los valores mas representativos de pesos moleculares de las proteínas estructurales de rabdovirus de peces se encuentran reseñados en el cuadro 6. Tas proteínas L. N, NS y M1 están asociadas con la nucleocápsida vírica. La proteína L es la ARN polimerasa del virión. Tas proteínas N :r MI están asociadas al genoma de ARN. La proteína NS ester también asociada con el genoma y es esencial para la síntesis de ARN. Las proteínas N, NS y MI están fosforiladas. La proteína G y las proteínas M y M2 están asociadas con la envuelta vírica. Los peplomeros víricos están compuestos de la proteína G, y las proteínas M y M2 son proteínas matriz en la envoltura. KURATH y LEONG (1985) encontraron una proteína adicional (NV), que es codificada por el genoma del virus IHN, pero que no esten presente en el virión maduro.
La proteína G, una glucoproteína, es necesaria para la unión del virus. la secuencia de la parte glucidica de la proteína G se ha determinado para el virus VHS, y aparentemente la glucosilaclón normal podría no ser necesaria para la infectividad o virulencia (Bnerass et aL. 1983, 1985). En la envoltura lipídica también se encuentran carbohidratos. Medidas de microviscosidad de la membrana Eligieren que determinados lípidos específicos del hospedador forman parte de la envoltura vírica (Mocas et al., 1978). BERNARD et at. (1984) separaron colesterol y fosfolipido de los cultivos de células de peces y de los virus VHS por cromatografia en capa fina de elevada sensibilidad. La proteína O es la proteína estructural contra la cual se dirigen los anticuerpos neutralizantes. Aunque por neutralización de la infectividad se pueden diferenciar unos rabdovirus de peces de otros, se han descrito cepas de HIN y SVC muy relacionados. También existen muchas relaciones entre cepas de rabdovirus de anguilas y diferentes serotipos del virus VHS. Pruebas necrológicos con virus VHS no muestran distinciones de cepas o serotipos (McAudsras y Ornen, 1987). Lsouc et si. (1981) y Visó et al. (1985) sugieren que se pueden diferenciar cepas según las variaciones en los perfiles electroforéticos en geles de poliacrilamida. Asimismo, ENZICAND a sr. (1981) y Einuami y Mane (1983) señalaron la posible relación serológica entre la proteína L de los virus VHS y SCV, basándose en el análisis de preparaciones del segundo precipitadas por antisuero anti-VHS.
Fig. 19. Electroforetograma de las proteínas estructurales de IIINV crecido en presencia de 'H-glucosamina y aminoácidos marcados con '4C. Las flechas indican las proteínas L, g, N, M y M. De MCALLISTER y WAGNER ( 1975); reproducido con permiso de la American Society for Microbiology.
Estabilidad vírica
Los rabdovirus de peces son moderadamente estables bajo una variedad de condiciones ambientales y de almacenamiento. Cuando se hallan suspendidos en medio de cultivo celular que contiene del 2 al 10% de suero, la infectividad puede ser mantenida durante meses o años a —20°C o a más baja temperatura Los virus pueden también preservarse por liofuracion. El nivel de virus inactivados Incrementa al aumentar la temperatura. En ausencia de suero, los virus son más biblias a la temperatura y la congelación/descongelación. pero pueden permanecer infecciosos en el ambiente durante meses. Los rabdovirus de peces son inactivados por exposición al éter, cloroformo, formalina, glicerol. dietilprocarbonato, ozono. hipoclorito sódico, iodóforos orgánicos, radiaciones gamma y ultravioleta, gis extremos (por debajo de pH 4 y por encima de pH 10), y por calor (60°C durante 15 mun. Los virus inactivados por formalina permanecen serológicamente reactivos durante meses y pueden ser utilizados como controles positivos en ensayos serológicos. Los virus inactivados con formalina han sido utilizados para vacunar pecas.
7. Reovirus de peces
Los reovirus infectan a mamíferos, aves, peces, insectos y plantas, pero la infección generalmente no produce enfermedad. El virus esta formado por una doble °Sonda icosaédrica que contiene de 10 a 12 segmentos de ARE bicatenano en el citoplasma. Se han clasificado como reovirus cuatro virus aislados de peces y uno de ostras, pero que es patógeno de peces Los virus aislados de peces son virus del brillo de oro (GSV), virus del salmón churo (CSV), reovirus del pez gato (CM), reovirus de la carpa herbívora y el aislado de ostras es el 13p1. Estos virus de peces y mariscos podrán representar un nuevo subgrupo de reovirus.
7.1. Biología de las enfermedades
Virus del salmón chum
Signos clínicos, cambios histológicos y transmisión
Mirtos et al. (1980. 1981) aislaron un reovirus designado como virus del salmón chum (CSV) de ejemplares adultos y aparentemente sanos en la época de freza en una •hatchery• de Japón. El virus lie experimentalmente transmitido a alevines de salmón cima salmón chinnock y salmón kokanee por inyección intraperitoneal de virus crecidos en cultivo celular. El virus replicó en lea tres especies. Pero no produjo sintomatología clínica ni mortalidad. Se observaron cambios histopatológicos solo en el hígado. En el salmón churo aparecieron pequeños focos de necrosis en el hígado después de 8 días de infección; a los 14 días la necrosis se hizo más aguda y extensa y a los 21 sanaron. Cambios similares, pero menos agudos, ocurrieron en los alevines de salmón chinnock, y en los alevines de salmón kokanee no se observaron cambios patológicos.
Aislamiento vírico
El CSV fue aislado de un conjunto de riñones y bazos procedentes de 5 ejemplares de salmón chum, y no se aisló de fluidos ováricos o semen Aparecen efectos citopáticos en la linea CHSE-214 después de 8 días de incubación a 18°C. Las células Infectadas adyacentes se 'talonea pero no así sus núcleos intactos y acumulados en la periferia del sincicio. El CSV replica también en otras lineas celulares tanto de salmónidos como no salmónidos El título vírico más alto ( •=10* TC1Delml) se da en las células CHH-1 y CHSE-214; en las lineas EPC, 113F-2, SFE-137 y Wal se obtienen títulos moderados (10•-10* TClajm1) y en las lineas Ea EF-S. FIIM y RTG2 se obtienen títulos videos bejtsey sin producción de efectos patológicos (10* Talkal) (Manos et aL, 1981, 1987). El virus replica a temperaturas de 10 hasta 20°C y óptimamente a 15-20°C Ensayos de neutralización cruzada muestran que, aunque el CSV, GSV y CRV tienen antígenos comunes, el CSV es serológicamente distinto de loa 05V y CRV (Amero et al, 1984; Rens= et al., 1984). El CSV es distinto del virus 1PN (Vimos et al. 1981).
Reovirus del pez gato
Aislamiento vírico y transmisión
Durante revisiones de rutina para detectar el virus del pez gato en diversas piscifactoría del sur de California (USA), fuese aislado un reovirus designado como ~virus del pez gato (CRV) (Ataran et si, 1984; HEDRICX et al, 1984). Aparte de una pequeña mortalidad ( <5%) crónica no se observaron signos de enfermedad clínicos o histopatológicos. El virus Rie recuperado de homogenados de riñón hígado y bazo de juveniles de pez gato en la linea celular ('CO a 26°C. Después de 12-38 horas de incubación se observaron áreas focales sinciciales que contenían numerosos núcleos El virus replica a 2830°C (25°C es la temperatura óptima)• se detecta una replicación Virica, mínima a 18, 20 y 35°C Los ITIAXIMOS rendimientos víricos (10*-100 TaDedird) se obtienen en las lineas BB y CCO, pero el virus también replica en las lineas BF-2 y CILH-1. En las células CHSE-214 se forman focos de efecto citopático, pero la replicaclón vírica se retarda o no progresa. En las células Fall no se observa efecto citopático y el crecimiento ea mínimo (Amaso es al, 1984; Warren et al., 1987). Ensayos de neutralización calzada demuestran que el CILV tiene algunos antígenos comunes con el CSV y el GSV, pero que es un serotipo distinto. Ensayos de infectividad preliminares demuestran que el CRV replica durante un prolongado período de tiempo en los peces, pero que no causa sintomatología clínica y que produce una mortalidad minina.
Reovirus de la carpa herbívora
Signos clínicos, aislamiento vírico y transmisión
En China se observó una enfermedad hemorrágica que causaba epizootias con pérdidas de alevines y juveniles y algo menos en peces de un año de carpas herbívoras cultivadas (NiE y PAN, 1985). La enfermedad ocurre cuando las temperaturas del agua son de 25-30°C. La sintomatología clínica incluye exoftalmia y hemorragias de las agallas y opérculos, en la cavidad bucal y en la base de las aletas. Internamente, se observan hemorragias del músculo esquelético, tracto intestinal, hígado, riñones y bazo (section of Virus Study, 1978, 1980). El virus fue aislado en las lineas celulares de músculo, nariz y gónoda de carpa herbívora, a partir de peces afectados, y fue transmitido a carpas herbívoras sanas por inyección de filtrados libres de células preparados con tejidos de peces infectados (CHEN y WANG, 1983; Section of Virus Study, 1978). N'E y PAN (1985) describieron que Gao preparó una vacuna con virus inactivados procedentes de tejidos infectados y que era eficaz en la protección de la enfermedad cuando era administrada por inyección a alevines de carpa herbívora.
Reovirus 13p2
Signos clínicos, cambios histológicos y transmisión
Mzvess (1979) aisló un virus designado como 13p2, a partir de ostras americanas Juveniles aparentemente sanas. las ostras americanas, las truchas arco iris y loe •bluegills• fueron Inoculados con virus crecidos en cultivo celular para comprobar su patogenicidad Cuando las ostras Juveniles americanas eran expuestas al virus por Inmersión, no se observó ni cambios histopatológicos• ni incremento en el número de virus, ni mortalidad y tampoco se observaron virus en micrografias electrónicas de cortes de tejidos de ostra. (Marees, 1980). Alevines y adultos de truchas arco iris expuestos al virus 13p, por inoculación intraperitoneal y subcutánea tampoco mostraron mortalidad. pero si síntomas de enfermedad subclinica Se detectaron incrementos del título viral en el hígado, riñones, bazo y páncreas, y los peces sintetizaron anticuerpos específicos del virus. La infección vimos provoca hepatitis granulomatosa con multit000s reticuloendotellales y penan:etnia fibrosa ocasional (MEYERS, 1983). También se expusieron alevines de •bluegill. al virus 13p2, por Inoculación intraperitoneal y el resultado fue el desarrollo de una enfermedad aguda con alta mortalidad (Mareas, 1980). Los peces infectados no muestran eintornatologia externa, pero se hallan letárgicos e inapetente& con pérdida de equilibrio, y permanecían postrados al fondo del acuario. Los cambios histopatológicos se dan solamente en el hígado y flie descrito como una hepatitis multifocal difusa con formación de grandes sincicios, necrosis coagulativa de hepatocitos e infiltración &lisa. de macrófagos tagocitarlos. Lite lesiones primarias se observan alrededor de los vasos sanguinos hepáticos mayores, pero, a la vez que la necrosis progrese, se observa una regeneración hepática. El titulo viral incrementa en el hígado y se observan acúmulos intracitoplasmáticos de virus en micrografias electrónicas de tejido hepático. En los •bluegrili• expuestas a inyección intraperitoneal la mortalidad empieza a los 13 días después de la Inoculación y el 44% de los peces mueren después de loe 50 días Poste exposición. No se produce mortalidad en •bluegWs• expuestos al virus por Inmersión, pero se observan lesiones hepáticas e incremento del titulo viral.
El hospedador natural del virus 13p2, es desconocido. MEYERS (1980, 1983) concluyó que las ostras meramente acumulaban suficientes virus por filtración para permitir el aislamiento y que el virus ere posiblemente de origen piscícola debido a su patrón de virulencia, enfermedad y mortalidad en los peces Infectados.
Aislamiento vírico
El virus 13p2 fue aislado de homogenados de ostras Juveniles enteras Inoculadas sobre las células BF-2 e incubadas a 18°C. Se desarrollaron grandes sincimos a los 8 días después de la Infección que progresivamente invadió toda la monocapa En pasajes subsecuentes los efectos histopatológicos aparecieron de los 2 a los la días después de la Infección, dependiendo de la. linea celular. El virus replica en las células EFE, BE, AS, 0E4, CHSE-214, CH11-1 y W•B Se observa un efecto °Repetido limitado en las células ASH y las lineas RTG.2. FEZ ETS y cultivo primario de linón de mono y seis lineas de mamífero son resistentes a la infección. El virus replica de 16 a 23°C y no a 9 ni a 30° C. El máximo titulo virar es de 10' a 10* TCID„,/ml
8. Retrovirus de peces
Los retrovirus están universalmente distribuidos en la naturaleza y son especialmente conocidos por la Inducción de tumores en mamíferos y aves. Los retrovirus tienen unos 100 nm de diámetro y poseen un genoma de ARN monocatenario. El virión se ensambla en el citoplasma y madura por gemación a trames de las membranas citoplasmáticas Existen dos morfologías típicas en los retrovirus: las partículas del grupo B, que se caracterizan porque la nucleocápsida densa a los electrones es excéntrica, y les partículas tipo C. en las que la nucleocápsida está. localizada centralmente. Los retrovirus se caracterizan principalmente por poseer un enzima ADN —polimerasa ARN— dependiente o transcriptasa inversa.
En peces. los retrovirus se han asociado a 9 enfermedades neoplásicas (cuadro VII). Los virus han sido visualizados en micrografias electrónicas. pero no han sido aislados. La actividad transo:notase inversa se ha demostrado en extractos del linfosarcoma del lucio y en el papiloma epidérmico del •white sucker..
8.1 Biología de las enfermedades
Fibrosercoma del salmón Atlántico
Se ha descrito un fibrosercoma de la vejiga natatoria en salmones atlánticos mantenidos en jaulas marinas con una prevalencia de alrededor del 5% (Mataran 1978). Las microgranas electrónicas revelan partículas semejantes a retrovirus asociadas a los tejidos afectados (Durs:as. 1978).
Signos clínicos y cambios histológicos
El tumor Ase detectado en salmones atlánticos muertos o moribundos de uno a dos aúne de edad en Escocia 1978). Los peces afectados no mostraban lesiones externas. pero los peces moribundos aparecían letárgicos. Internamente, se observaban múltiples tumores nodulares en la vejiga natatoria de 5 a 30 mm de diámetro que perturbaban en la cavidad abdominal. No se detectaba Invasión o metástasis, El tumor se desarrollaba en la interfase del tejido areolar y el interior del músculo liso de la pared de la vejiga natatoria Por lecciones histoquimicas se detecta muy poco colágeno. El neoplasia Die clasificado como un leimiosarcoma.
Detección vírica
En 1978 se observaron unas partículas semejantes a retrovirus, esferoidales y densas a electrones en preparaciones de cortes finos del elido neoplásico. Las partículas aparecían como geminando de la superficie celular. Dichos viriones parecían del tipo C y tenían un diámetro de 120 nm aproximadamente y contenían un nucleoide central de unos 90 nm de diámetro. Se observaron agregados extracelulares de partículas asociados a fibrillas semiordenadas de unos 20 nm de grosor cada una La significación etológica de tales retrovirus es desconocida, ya que el virus no ha sido abalado y los tumores no han sido transmitidos experimentalmente.
Papiloma del salmón Atlántico
En salmones atlánticos de Gran Bretaña, Noruega, Suecia y Estados Unidos se ha descrito un papiloma epidérmico benigno . La prevalencia puede alcanzar el 55% en animales de «hatcheries» de 1 a 2 años de edad, el 10% en peces de 2 a 3 años de edad capturados en aguas saladas y 1,5% en animales maduros sexualmente. El papiloma también ha sido detectado en salmones salvajes de 1 a 2 años de edad. La ocurrencia de epizootias de lesiones sugiere una etiología infecciosa, pero los exámenes bacteriológicos y virológicos han dado resultados negativos. El examen de los tejidos lesionados al microscopio electrónico reveló partículas intracitoplasmáticas y extracelulares semejantes a virus (CARLISLE, 1976, 1977; WIREN, 1971). CARLISLE (1977) sugirió que factores genéticos y hormonales podían afectar la frecuencia de los papilomas.
Signos clínicos
Los papilomas epidérmicos aparecen en el verano tardío y regresionan en otoño en los peces jóvenes de agua dulce; en cambio, los ejemplares mayores y de agua salada el tumor persiste incluso un año Las proliferaciones pueden ser únicas o múltiples y tienen una textura de lisa a nodular y una apariencia de translúcida a blanca (fig. 20). Los papilomas pueden aparecer en cualquier parte del cuerpo y tienen un grosor de 2 a 5 mm hasta 4 cm El tumor puede desprenderse y el tejido epidérmico sana sin dejar huellas de invasión o metástasis. La mortalidad ocurre principalmente como resultado de infecciones secundarias bacterianas o fúngicas.
Cambios histológicos
La epidermis correspondiente a los papilomas son de 5 a 15 veces más gruesas que las normales y están compuestas de células derivadas de la epidermis media. Las células epidérmicas son espirales y alargadas y débilmente interdigitadas, tienen desmosomas pobremente formados y contienen un núcleo redondeado con nucléolos prominentes y cromatina agregada y marginada Se observan numerosas figuras mitóticas atípicas y ocasionalmente células degenerativas que contienen inclusiones intracitoplasmáticas. Faltan las células mucosas, una capa basal subyacente diferenciada y la membrana basal, pero, en cambio, aparecen ramificaciones fibrovasculares de origen aparentemente dérmico, penetrando en la masa papilomatosa Se asocia al papiloma una cierta actividad inflamatoria. Los tejidos adyacentes al tumor se hacen hiperémicos y las lesiones están infiltradas por linfocitos, macrófagos y neutrófilos. Camara (1976, 1977) sugirió que la lesión se desprendía en una reacción regenerativa como resultado de la inmunidad mediada por células
Detección vírica
Fig. 20. Papiloma del salmón Atlántico. El ejemplar de la parte superior procedente de Maine (USA) muestra una única lesión dorsolateral. mientras que el inferior procedente de Suecia muestra numerosas lesiones. De WOLP (1988); reproducido con permiso de Academie Presa.
Exámenes al microscopio electrónico de tejidos tumorales han revelado, aunque infrecuentemente, partículas intracitoplasmáticas y extracelulares semejantes a retrovirus de 125-150 nm de diámetro, que contienen nucleoides densos a los electrones de 70-95 nm de diámetro localizados centralmente (Gamma 1976, 1977).
Los intentos de aislamiento de un virus de homogenados de papilomas, riñones y bazos y de cultivos primarios de células papilomatosas no han tenido éxito como tampoco lo han tenido los intentos de transmisión experimental del papiloma ( CARLISLE, 1978, 1977; WIREN, 1971).
Virus de peces no clasificados
Paramyxovirus del salmón chinook
1985 aislaron un virus no descrito de ejemplares adultos de salmón chinook que regresaban para la puesta a Oregón (USA) y que parecían aparentemente sanos, al menos sin signos clínicos evidentes o cambios histopatológicos. El virus fue aislado en años consecutivos de diferentes ríos sin ninguna conexión. El virus no se recupera en la progenie y no se ha descrito transmisión experimental. Las características biológicas, bioquímicas y ultraestructurales del virus lo relacionan con los paramixovirus.
Detección vírica
El virus fue aislado de homogenados de riñones y bazos, pero no de fluidos ováricos. Las muestras fueron inoculadas sobre las lineas CHSE-214 y la EPC, incubadas a 18°C y pasadas 14 días después de la inoculación. A los 14 días del segundo pasaje se observaron efectos citopáticos en la linea CHSE-214, que consistían en grupos de células redondeadas s y retráctiles que eventualmente se desprendían. El virus replicaba con efectos citopáticos en las lineas CHH-1, CHSE-214, KO-6 y CSE-119 y se obtenían títulos de 10 a 10 TCID, ml. En la línea FHM no se observa efecto citopático, lo que corresponde a un bajo nivel de replicación (aproximadamente 10` TCID50/m1). El virus replica a temperaturas de 6 a 21°C (18°C es la óptima). No replica a 24°C y los efectos patogénicos sólo se observan de 15 a 21°C. micrografias electrónicas de células CHH-1 Infectadas muestran viriones envueltos, pleomórficos de 125 a 250 nm de tamaño. Los viriones aparecen formando agregados y maduran por gemación. Se observan agregados de nucleocápsidas en el citoplasma Tinciones negativas de preparaciones de virus parcialmente purificados muestran que la nucleocápsida es una hélice con giro contrario a las agujas del reloj de alrededor de 18 nm de diámetro y hasta 1.000 nm en longitud con un poro central de 5 nm.
Estabilidad vírica y características biológicas
El virus se inactiva por exposición a cloroformo, pH 2 y calentamiento (56°C durante 6 h o 37°C durante 24 h), pero es estable frente a pH de 3 a 11 y a ciclos de congelación/descongelación a —20 y —70°C. El virus aglutina eritrocitos de 11 a 14 especies de pájaros, peces y mamíferos. Los eritrocitos de cordero, cabra o vacunos no eran aglutinados. El virus tiene una densidad de flotación de 1,20 g/ml en esa. Su genoma es de ARN según se deduce de la inhibición de la replicación ejercida por 5-iodo-2'- deso2duriclina. El virus ha sido tentativamente clasificado como un paramixovirus.
Papiloma de la dorada Signos clínicos y cambias histológicos En 7 de 39 doradas de salinas de la costa de España se observaron tumores maxilares. Los tumores aparecían como papilomas flbroepiteliales benignos.
La membrana basal del tumor estaba intacta y no se observaba ni invasión ni metástasis. La gran disparidad en la relación longitud/peso en los peces portadores de tumores Indicaba que posiblemente el tumor interfería con la alimentación.
Detección vírica
Micrografías electrónicas de tejidos tumorales mostraban partículas semejantes a virus que se encontraban solas o formando agregados en vacuolas citoplasmáticas asociadas posiblemente a la gemación de las membranas celulares. Las partículas tenían un diámetro de 35 a 65 nm y parecían poseer una envoltura con peplómeros. Muchas partículas eran translucidas a los electrones, pero algunas teman un nucleoide denso a los electrones y localizado centralmente Guiñara= et al, 1977). No se han descrito intentos de aislar el virus.
Virus intraeritrocitario de la trucha arco iris
Signos clínicas y cambios histológicos
LANDOLT et al. (1977) describieron un desorden hemorrágico fatal en la cepa Donaldson de la trucha arco iris, particularmente en hembras adultas. Los signos clínicos eran hemorragias, hipoxia y muerte repentina Internamente los peces mostraban tanto hematomas expansivos en el hígado como sangre extravascular en la cavidad del cuerpo. El examen histológico mostró hepatitis necrótica difusa, inclusiones intracitoplasmáticas eosinófilas en hepatocitos y en los túbulos del epitelio renal, coagulación vascular diseminada, disfunción y deterioración del músculo esquelético. La sangre periférica contenía altos niveles de eritrocitos inmaduros y los eritrocitos frecuentemente contenían inclusiones citoplasmáticas pleomórficas, pequeñas y basófilas.
Dirección vírica
El examen al microscopio electrónico de inclusiones intracitoplasmáticas de los hepatocitos y los túbulos del epitelio renal mostró que las inclusiones estaban rodeadas de membrana y que contenían material amorfo. En contraste, las micrografías electrónicas de las inclusiones de los eritrocitos mostraron que, además de las estructuras densas a los electrones de 1.000 nm de diámetro ligadas a membrana, había numerosas vesículas de alrededor de 900 nm de diámetro que contenían partículas semejantes a virus. Las partículas eran esféricas de 80-90 nm de diámetro con una membrana externa densa a los electrones y un nucleoide reticulado y aún más denso a los electrones. Los intentos para aislar el virus en las líneas FHM y RTG•2 no han tenido éxito y la significancia etológica del posible virus es desconocida.
Hiperplasia epidérmica de la trucha lacustre americana
Las •hatcheries• de salmónidos de la zona del Lago Superior y del Lago Michigan de los Estados Unidos han sufrido mortalidades en epizootias esporádicas que afectan a alevines y juveniles de la trucha lacustre americana. Debido a que la causa especifica no se pudo determinar, las muertes eran generalmente atribuibles a una supersaturación de nitrógeno o a toxicidad. La transmisión experimental demostró que un agente infeccioso estaba implicado en la mortalidad (Mcknársa y HERMAN, 1987).
Signos clínicos y cambios histológicos
Los peces afectados están letárgicos y nadan cerca de la superficie mostrando esporádicas y repentinas inmersiones y natación en espiral Las hemorragias se desarrollan en los ojos y ocasionalmente en la boca y aparecen acúmulos irregulares de mucus en la piel. En los supervivientes se observan infecciones secundarias de hongos en los ojos, aletas y otras áreas diferenciadas en el resto de la superficie del cuerpo. Los valores del hematocrito son elevados (alrededor de 45,8) en los peces con infecciones agudas y la mortalidad es prácticamente del 100%.
El examen histopatológico muestra lesiones consistentes en el epitelio de la cabeza y en los riñones. Es característica la presencia de hiperplasias en la nariz, y dentro y fuera de la boca, y en algunos casos muy severos la hiperplasia se da sobre todo el cuerpo. En el riñón y en los sinusoides hepáticos se ven fagocitos llenos de restos celulares. Los capilares de los túbulos proximales y glomerulares están dilatados.
La enfermedad se transmite experimentalmente por cohabitación a alevines de truchas lacustre a partir de alevines, juveniles o adultos En cambio, son resistentes los alevines de trucha fario, salvelinus y arco iris y salmón atlántico.
Detección del agente infeccioso
Muestras de epitelio respiratorio, agallas, riñones y bazo fueron ensayadas sobre las lineas CHSE-214, EPC, FHM y RTG-2 e incubadas a 9, 15 y 18°C. No hubo evidencia de efecto citopático ni en la primera inoculación ni en los pasajes subsiguientes. Micrografias electrónicas de epitelio respiratorio muestran dos tipos de partículas elipso-esferoidales (fig. 21). Un tipo de partículas, vistas en el exterior de la célula, es de alrededor de 100 nm de anchura y 175 nm de longitud y tiene un nucleoide denso a los electrones y una cola de alrededor de 140 nm de longitud El segundo tipo de partículas visualizadas en el citoplasma tienen un diámetro de alrededor de 150 a 200 nm y un nucleoide electrón-denso difuso de 75 a 100 ¡un de diámetro. Aunque con sólo la mitad de la talla, las partículas se parecen a las clarrudias de la enfermedad de la epiteliocistis descrita por Romea et al (1984). Sin embargo, el perfil clínico e histológico de la epiteliocistis es muy diferente del de la hiperplasia epidérmica de la trucha lacustre y además no se observa epiteliocistis en los peces infectados. Los herpesvirus tienen dimensiones similares al agente de la trucha lacustre y han sido descritos asociados a colas y a hiperplardas epidérmicas en peces. El agente de la trucha lacustre no ha sido aún aislado y no se conoce su significado ni la hiperplasia epidérmica ni en la mortalidad. Por tanto, una clasificación tentativa del Mente de la, trucha lacustre no es aún posible.
Papiloma epidérmico de los pleuronéctidos
Varias especies de peces planos (Pleuronectiformes) de Europa y Norteamérica están afectadas por un papiloma epidérmico benigno (Coma y Hacas, 1969; Nioasin et al, 1965; ~mas et al, 1965, 1976). El tumor parece tener sólo importancia en la costa del Pacifico de Norteamérica, donde tiene una incidencia del 5 al 10%, y puede aproximarse al 50% en algunas poblaciones. El tumor se da en peces de los dos sexos y las edades con mayor prevalencia son de 8 meses a 3 años (Maza y WELLINGS, 1971; WELLINGS, 1970; WEInNGS et al., 1964). Factores ambientales pueden afectar la tumorogénesis, pero no parece ser la causa directa de la formación del tumor (Main y WELLINGS, 1971; WELLINOS et al., 1976). En lugar de esto se sospecha una etiología viral en el papiloma epidérmico Las micrografías electrónicas revelaron inclusiones citoplasmáticas y partículas semejantes a virus en las células tumorales (NIGR.ELLI et al, 1965; WELLINGS, 1970, WELLINGS y CHU1NARD, 1964; WELLINGS et al., 1966, 1976), pero los intentos para aislar el virus a partir de tejidos tumorales no han tenido éxito.
Signos clínicos y cambios histológicos
Se observan tumores epidérmicos únicos o múltiples sobre la superficie corporal y muestran cierta invasividad, pero no metástasis (fig. 22). El marcado retraso en el crecimiento y la extensión del tumor parecen disminuir la probabilidad de supervivencia (aorza y KELLER, 1969; MILLER y WELLINGS, 1971; WELLINGS et al., 1964).
Fig. 21. 'Nido de una hiperplasia epidérmica de la trucha lacustre americana mostrando acúmulos intracelulares de partículas parecidas a virus. En la parte superior Izquierda se muestra una partícula con •cola. vista en el espacio intercelular.
Durante el desarrollo del tumor se pueden observar varios tipos de lesiones (CooPsa y Kzusa, 1969; MILLER y WELLINGS, 1971; NIGRELLI et al., 1965; ~ros, 1970; WELLINGS et al., 1964, 1965, 1976).
Hiperplasia epidérmica de la trucha lacustre americana
Las •hatcheries• de salmónidos de la zona del Lago Superior y del Lago Michigan de los Estados Unidos han sufrido mortalidades en epizootias esporádicas que afectan a alevines y juveniles de la trucha lacustre americana. Debido a que la causa especifica no se pudo determinar, las muertes eran generalmente atribuibles a una supersaturación de nitrógeno o a toxicidad. La transmisión experimental demostró que un agente infeccioso estaba implicado en la mortalidad (Mcknársa y HERMAN, 1987).
Signos clínicos y cambios histológicos
Los peces afectados están letárgicos y nadan cerca de la superficie mostrando esporádicas y repentinas inmersiones y natación en espiral Las hemorragias se desarrollan en los ojos y ocasionalmente en la boca y aparecen acúmulos irregulares de mucus en la piel. En los supervivientes se observan infecciones secundarias de hongos en los ojos, aletas y otras áreas diferenciadas en el resto de la superficie del cuerpo. Los valores del hematocrito son elevados (alrededor de 45,8) en los peces con infecciones agudas y la mortalidad es prácticamente del 100%.
El examen histopatológico muestra lesiones consistentes en el epitelio de la cabeza y en los riñones. Es característica la presencia de hiperplasias en la nariz, y dentro y fuera de la boca, y en algunos casos muy severos la hiperplasia se da sobre todo el cuerpo. En el riñón y en los sinusoides hepáticos se ven fagocitos llenos de restos celulares. Los capilares de los túbulos proximales y glomerulares están dilatados.
La enfermedad se transmite experimentalmente por cohabitación a alevines de truchas lacustre a partir de alevines, juveniles o adultos En cambio, son resistentes los alevines de trucha fario, salvelinus y arco iris y salmón atlántico.
Detección del agente infeccioso
Muestras de epitelio respiratorio, agallas, riñones y bazo fueron ensayadas sobre las lineas CHSE-214, EPC, FHM y RTG-2 e incubadas a 9, 15 y 18°C. No hubo evidencia de efecto citopático ni en la primera inoculación ni en los pasajes subsiguientes. Micrografias electrónicas de epitelio respiratorio muestran dos tipos de partículas elipso-esferoidales (fig. 21). Un tipo de partículas, vistas en el exterior de la célula, es de alrededor de 100 nm de anchura y 175 nm de longitud y tiene un nucleoide denso a los electrones y una cola de alrededor de 140 nm de longitud El segundo tipo de partículas visualizadas en el citoplasma tienen un diámetro de alrededor de 150 a 200 nm y un nucleoide electrón-denso difuso de 75 a 100 ¡un de diámetro. Aunque con sólo la mitad de la talla, las partículas se parecen a las clarrudias de la enfermedad de la epiteliocistis descrita por Romea et al (1984). Sin embargo, el perfil clínico e histológico de la epiteliocistis es muy diferente del de la hiperplasia epidérmica de la trucha lacustre y además no se observa epiteliocistis en los peces infectados. Los herpesvirus tienen dimensiones similares al agente de la trucha lacustre y han sido descritos asociados a colas y a hiperplardas epidérmicas en peces. El agente de la trucha lacustre no ha sido aún aislado y no se conoce su significado ni la hiperplasia epidérmica ni en la mortalidad. Por tanto, una clasificación tentativa del Mente de la, trucha lacustre no es aún posible.
La primera lesión es el nódulo angioepitelial (AEN), el cual posee un diámetro de 1 a 2 mm, es liso y de color rosado a rojo. El AEN sólo se da en peces de 6 a 12 meses de edad y está compuesto de un estroma de tejido conjuntivo altamente vascularizado con una capa subyacente de una delgada epidermis hiperplásica. La transición del estado AEN al papiloma epidérmico maduro o al menos frecuente pólipo angioepitelial ocurre en peces de 8 a 12 meses de edad. Tanto el papiloma maduro como el pólipo angioepitelial tienen un diámetro de 0,5 a 5 cm y un grosor de 0,5 a 1,5 cm, tienen una textura nodular ondulada y un color de rosado a gris marrón. El papiloma está formado de capas gruesas de epidermis hiperplásica recubriendo un tejido conjuntivo vascularizado de volumen medio. En contraste, el pólipo está, formado principalmente de tejido conjuntivo vascularizado recubierto por una capa muy delgada de epidermis. Los componentes epidérmicos y conjuntivos de los tres tipos de lesiones contienen únicamente células tumorales patogenomónicas, •células X» (Baooxs et al, 1969) Las células X muestran una encapsulación parecida al glicocalix y WELLINGS et al. (1976) propusieron que las células X eran células transformadas.
Detección vírica
El examen al microscopio electrónico de las células X especificas de los tumores revela partículas semejantes a virus intracitoplasmáticos y posiblemente una estructura virogénica (fig. 23). Un tipo de partícula es esferoidea y con envoltura de unos 45 nm de diámetro y un nucleoide electrodenso localizado centralmente y de unos 6 nm de diámetro. Este tipo de partícula se observa frecuentemente asociado con estructuras amorfas electrodensas de unos 150 nm de diámetro. WELLINGS et al. (1965, 1976) especularon que estas estructuras representaban la zona de síntesis de las partículas de 45 nm o un estado de desarrollo de un segundo tipo de partículas designado como cuerpo granular. El cuerpo granular también está rodeado de membrana y tiene un diámetro de aproximadamente 160-200 nm y contiene numerosos gránulos densos a los electrones.
Fig. 22. Lenguado, del grupo de edad 1, con papiloma epidérmico localizado en la parte posterior del lado pigmentado. De Witt.uNos et al. (1965); reproducido con permiso de la New York Academy of atienes.
Un tipo de partícula similar al cuerpo granular se había ya observado en el papiloma epidérmico del góbido (Pro et al., 1976). Hasta el momento no se han purificado partículas víricas de homogenados de células tumorales y tampoco se han detectado ácidos nucleicos específicos de las células tumorales en gradientes de CsC1. la inoculación de cultivos celulares de pleuronéctidos con células del papiloma no origina efectos citopáticos ni transformación celular (Writrbras et al., 1976). Los intentos de transmitir el tumor a jóvenes pleuronéctidos salvajes por inyección de células tumorales u homogenados de tejidos dio resultados equívocos (Wzamos st al., 1976). En todos los casos la frecuencia del papiloma epidérmico fue igual en los controles y en los lotes inyectados.
Virus de la anemia de salmónidos
Signos clínicos y detección vinos
Hour y Ftosonc (1984) y LE= (1985) describieron ejemplos repetidos de anemia severa en determinadas poblaciones de salmón coho y salmón. chinnock (25 g) en Oregon y Washington (USA). La enfermedad denominada anemia de salmónidos o también síndrome del cuerpo de inclusión eritrocitarlo resultaba algunas veces en serias pérdidas de peces. Se observan inclusiones intraeritrocitarias en extensiones de sangre teñidas por la técnica de Giemsa y las micrografias electrónicas demuestran partículas solas o agregadas rodeadas de membrana en el citoplasma de los eritrocitos afectados. Las partículas vinosa tienen un diámetro de aproximadamente 80 nm y son distintas de las partículas observadas en la necrosis eritrocitica vírica. El virus ha sido tentativamente clasificado en el grupo de los togavirus. LEEK (1985) transmitió la enfermedad a alevines de salmón chinnock (8 g) por incubación de homogenados de tejidos Infectados.
Se tomaron muestras de sangre a varios intervalos de tiempo hasta un máximo de 28 días después de la exposición. Se observaron inclusiones en eritrocitos 4 días post-exposición y 28 días después de la misma, y los eritrocitos del día 28 mostraban acúmulos víricos en el citoplasma.
Fig. 23. Micrograma electrónica de células de un papiloma epidérmico de un lenguado mostrando partículas vesiculares parecidas a virus (a), cuerpos homogéneos densos (b), y cuerpos granulares (c). De WEILINGS st ei (1965); reproducido con el permiso de la New York Acaderny of Sciences.
Estomatopapiloma de la anguila
Un neoplasma epidérmico benigno conocido como estomatopapiloma o coliflor ha sido descrito en anguilas de Europa. Esta enfermedad fue reconocida en el mar Báltico a principios del siglo XX, pero no se puso interés en ella hasta los años 1940 cuando la prevalencia y distribución geográfica de la enfermedad empezó a ser económicamente significativa (Cinusnassnr y JEME, 1950; Mon., 1907; WOLFF, 1912). La etiología del estomatopapiloma es desconocida, pero se ha sospechado de los contaminantes ambientales; se han observado partículas semejantes a virus en los tejidos tumorales y se han aislado varios virus de anguilas enfermas.
Hospedadores y distribución geográfica
El estomatopapiloma sólo ha sido observado en anguilas europeas, y nunca en peces americanos o japoneses. La enfermedad fue inicialmente descrita en el mar Báltico y posteriormente en el mar del Norte y el mar Negro, y parece estar limitada a la Europa Norte-Central. Más recientemente se han encontrado anguilas con stomatopapillorna en ríos de Inglaterra y Escocia.
Signos clínicos
Las anguilas con estomatopapiloma presentan proliferaciones epidérmicas, principalmente alrededor de la boca y cabeza (fig. 24). En algunas áreas hasta un 40% de las anguilas capturadas están afectadas por la enfermedad (Koops y Marx, 1989; Prrns et al., 1972b). Los pesos del tumor son despreciables en los primeros estadios de la enfermedad, pero pueden incrementas hasta volúmenes de varios cientos de milímetros cúbicos en un período de semanas (antas, 1977). Las proliferaciones son de redondas a ovaladas; tienen una textura nodular ondulada y presentan una consistencia blanda o esponjosa (Primas y PETERA 1977). La pigmentación aparece de débilmente rojizagris a rojo carne o azul pizarra, dependiendo del grado de vascularización (araisrians= y Justa, 1950). El papiloma puede obstruir la ingesta y las anguilas pueden estar muy delgadas (Boom y Man; 1988). Cuando el desarrollo del tumor se para suelen quedar marcas.
Cambios histológicos
Asociados a los cambios patológicos del estomatopapiloma, están confinados a la epidermis. El tumor raramente invade los tejidos adyacentes ni metastatiza. La epidermis normal está formada por células banales bien diferenciadas, células mucosas y células "club". El tumor va desplazando a la estructura normal y reemplazándola por células epidérmicas indiferenciadas que empiezan en la lámina basal. Las células habituales de la piel raramente se encuentran en el tumor. Se desarrollan espacios intercelulares extensivos y las interdigitaciones celulares se reducen. Las cédulas tumorales son de forma estrellada a oval y contienen núcleos y mitocondrias irregulares y raros. Los tumores en regresión presentan una marcada infiltración de linfocitos.
Fig. 24. Cabeza de una anguila europea con estomatopapiloma De KCOPS es al (1970); reproducido con el permiso de la American Fisheries.
Transmisión
Los intentos de producción de tumores por implantación de tejido tumoral o por inyección o introducción a través de heridas de homogenados tumorales, sangre de anguilas afectadas o fluidos de cultivos celulares infectados no han tenido éxito. La transmisión por cohabitación u otras técnicas ha sido difícil de interpretar debido a que el historial clínico de los animales utilizados no era conocido. La evidencia empírica sugiere que el tumor ocurre con más frecuencia en anguilas de 15 a 35 cm de longitud (Husma y Mima 1982; PETERS y Parras, 1977). PETERS y Wnxe (1972) y Parras y PETERS (1970) describieron la inducción de proliferación epidérmica en anguilas y anguilas jóvenes expuestas a floruro sódico (15 mm) y monoiodoacetado sódico (1,5 a 1,75 nal). La proliferación no se produce si simultáneamente se exponen los peces experimentales, a difosfato inorgánico (1 mil), piruvato sódico (5 a 20 mM) u oxigeno a una presión parcial doble de la atmosférica (320 mm Hg).
Factores que afectan la enfermedad
Los factores ambientales influyen marcadamente sobre el desarrollo de la enfermedad. El tumor se expande rápidamente a temperaturas de 15 a 22 °C y regresiones (aunque se cree que persisten algunos remanentes) de 5 a 8 °C y por encima de 22 °C (Farsas, 1975, 1977; Perms y Prisas, 1977; PPITZNEP, 1973). Esta dependencia de la temperatura se refleja en las fluctuaciones anuales de la prevalencia de la enfermedad; la frecuencia y talla del tumor son bajas en otoño, invierno y primavera y altas en verano (Hussam y Mías, 1982). Las fluctuaciones de la temperatura, oxigeno disuelto, salinidad y agentes polucionantes, pueden incrementar el stress fisiológico e inducir el desarrollo del tumor. (Dan, 1976; Prisas, 1975, 1977; Prisas y Panas, 1977; SCHWANZ-PMZNER, 1976). Debido a sus hábitos, la anguila está en contacto prolongado con las condiciones ambientales aparentemente desfavorables de los sedimentos de los ríos.
Control de la enfermedad
Se han descrito varios tratamientos efectivos para la regresión de los tumores. Farsas y Primas (1979) citaron que se producía una regresión tumoral y una rediferenciación celular transitoria cuando las anguilas eran mantenidas en un ambiente salino. PETERS et al. (1972a, b) describieron que el sulfato de quinina (15-60 mg/l) promueve una rediferenciación celular y una reducción de la talla del tumor, pero que la proliferación y la desdiferenciación celular se recuperan si el tratamiento es discontinuo. Prisas et al. (1972a, b) propusieron que la regresión del tumor implica una interacción entre la quinina y las vías metabólicas productoras de energía de las células. Prisas y Prraas (1970) describieron que el difosfato inorgánico (Na„P,0,PP1) a una concentración 2 mM promueve una rediferenciación celular al igual que una destrucción y desprendimiento del tumor. El acúmulo de linfocitos y macrófagos en los tejidos adyacentes podrían ser resultado de la respuesta Inmune al tejido tumoral.
Detección vírica
Se han aislado virus y se han visualizado partículas semejantes a virus en anguilas con estomatopapilomas, pero la etiología viral de la enfermedad no ha sido comprobada PFIT2XER y SOMBRAR` (1969) intentaron aislar el virus de homogenados de tejidos tumorales y anguilas enteras, pero no tuvieron éxito. Sin embargo, pudieron aislar un virus de la sangre de anguilas afectadas. El virus fue designado virus de la anguila (Berlín) y causaba efectos citopáticos líticos en las células RTG-2 incubadas a. 16-18°C. La microscopia electrónica reveló agregados de virus poliédricos de unos 55 nm de diámetro rodeados por membranas en el interior de las células. Los viriones fueron visualizados en cortes de células RTG-2, pero no en los tejidos tumorales. la aparición secuencial de estructuras semejantes a virus intranucleares y agregados de virus citoplasmáticos en las células RTG-2 sugirió que la virogénesis empieza en el núcleo (Firrizszs, 1969, 1973; &HUBERT, 1969). Scswasz-Prrrzszs (1978) clasificaron tentativamente el virus como un papovirus, pero ahora está, considerado un birnavirus (Sarwasz-Pnraws et al, 1984).
El examen al microscopio electrónico de tejidos tumorales revela en algunos casos, numerosas partículas icosaédricas intracelulares de unos 30 fan de diámetro y grumos de 100 nm o más de longitud y diámetro de estructuras parecidas a agujas de 2,5 nm (KooPs et al., 1970; SCHUBERT, 1969). Estas estructuras aparecen algunas veces en un quiste en el núcleo de las células tumorales (Dura, 1969; Pintara 1973; SCHUBERT, 1989). El significado de estas estructuras no ha sido todavía determinado.
WOLF y Quncav (1970) aislaron un virus designado como EV-1 de anguilas con estomatopapilomas. Cuando se inocularon homogenados de tumores y órganos internos sobre las lineas RTG-2 y FHM se observó la aparición de focos picnóticos y neuróticos en asociación con sincicios masivos en las dos líneas celulares. Estos efectos citopáticos son distintos de los descritos para el virus de la anguila (Berlín).
Micrografías electrónicas de células infectadas muestran acumules de pequeños virus icosaédricos. El virus no ha sido caracterizado y no se han realizado intentos de infectividad. Cuando los stocks de EV-1 congelados fueron reexaminados algunos años más tarde, se aisló un virus distinto al EV-. El virus, designado como EV-2, multiplica en las lineas celulares FILM hasta un título de 10° TCIDechnl, y no replica en las líneas RTG-2, BB o BF-2. El rango de temperaturas que permite la replicación del virus es de 10 a 25°C (óptimo a 15°C). A 15°C se observa picnosis de masas de células, sincicios y lisis celular, mientras que a 20-25°C sólo se observa picnosis y lisis celular. El EV-2 sedimenta a una densidad de flotación de 1,19 g/ml Las micrografias electrónicas de Unciones negativas de virus purificados muestran partículas pleomórficas de 90-140 nm de diámetro con peplómeros de aproximadamente 10 nm de longitud distribuidos radiantemente (fig. 25). La replicación del virus no es inhibida por la adición de desoxiuridinas halogenadas al medio, indicando que el genoma es de ARN, pero también es inhibida por la adición de antiomicina D. La microscopia de fluorescencia indirecta muestra que el virus replica en el citoplasma., pero los gránulos fluorescentes citoplasmáticos no son afectados por el tratamiento con ARNasa o con pepsina seguida de ARNasa. Los concentrados de virus aglutinan eritrocitos de pollo y cordero, pero no humanos (tipo 0), de conejo o de trucha. NAGABAYASHI y WOLF (1979) consideran que el EV-2 tiene características similares a las de los ortomixovirus. El EV-2 es inactivado por exposición a disolventes orgánicos, pH ácido (pH 3) y calor (50°C durante 30 min) y por liofización, y no es afectado por ciclos sucesivos de congelación/descongelación o por sonicación. Cuando los stocks víricos son mantenidos a 4-15°C, la infectividad decrece alrededor de 3 Log 10 en 15 días y 4 días respectivamente. A 26°C se pierde toda la infectividad en 30-48 horas. Los resultados de las experiencias de infectividad son difíciles de interpretar, pero nunca se han podido inducir lesiones papilomatosas claras. Un 50% de las angulas (7 cm de longitud) inyectadas con virus crecidos en cultivo celular murieron en los 3 meses subsiguientes a la infección, pero sólo se recuperaron virus de un 25% de los ejemplares muertos.
Fig. 25. Micrografías electrónicas de panicuias pleomórficas de EV-2. De NAGABAYASH1 y WOZY (1979); reproducido con el permiso de la American Society of Microbiology.
Se aislaron ejemplares portadores entre anguilas jóvenes (20-30 cm de longitud) utilizadas en los experimentos de infección de un virus similar al EV-2, pero dicho virus no es neutralizado por antisueros contra el EV-2. Ama y 'Now= (1985d) también aislaron un virus formador de sincicios a partir de anguilas europeas con estomatopapilomas. El virus replica hasta un titulo de alrededor de 10 4,5 TC1Dejml, es inactivado por disolventes polares y no es neutralizado por antisuero contra el EV-2. No se han descrito ni otras características ni ensayos de patogenicidad. Las relaciones entre los varios virus que se han relacionado de alguna manera con el estomatopapiloma no están todavía bien clarificadas.
Signos clínicos y cambios histológicos
La necrosis ulcerativa. dérmica (UDN) es una enfermedad de la piel que se da en salmones atlánticos adultos y truchas fario y que ha sido descrita en Gran Bretaña, Irlanda, Francia y Suecia Las lesiones se desarrollan en especies anadrómicas cuando regresan a las aguas dulces.
Las lesiones inicialmente aparecen como pequeñas áreas grisáceas de piel rugosa o úlceras poco profundas, pero a medida que se desarrolla la enfermedad las úlceras se hacen profundas (Roszars, 1972). Las úlceras aparecen principalmente en la cabeza y aleta adiposa, pero también pueden formarse en otras áreas del cuerpo. La enfermedad se caracteriza por una progresiva necrosis focal de las células epiteliales. La degeneración de la capa media de las células de Malpigi de la epidermis induce la formación de ampollas que llevan al desprendimiento de las capas epidérmicas con erosión de la capa y la membrana basal. No se producen lesiones en los órganos internos a no ser que haya infecciones secundarias. La mortalidad que a veces se produce se debe a los efectos de infecciones secundarias bacterianas o fúngicas de las heridas. Las células afectadas tienen el núcleo granular y extensamente indentado y la membrana nuclear separad& Las mitocondrias tienen mayor tamaño y el retículo endoplasmático tiene mayor volumen. Los desmosomas no están afectados, pero las interdigitaciones celulares normales se hallan muy separadas.
Detección vírica
El examen al microscopio electrónico de lesiones de salmón atlántico, semejantes a UDN, muestra partículas de forma esferoideal a hexagonal de unos 30-33 nm de diámetro. Las partículas se presentan libres en el citoplasma. y en agregados rodeados de membrana. En las células Usadas se observan pequeños cuerpos gemando de la membrana nuclear. Estos cuerpos parecen formarse en asociación con el material cromatínico. LOUNATMAA y JANATULNEN (1978) sugirieron que estos cuerpos podrían corresponder a las »vesículas envueltas» descritas por Ploman (1972). En cortes de tejidos epidérmicos de animales controles no se observan nunca tales estructuras. No se ha aislado ningún virus en cultivo celular y el significado de tales partículas, semejantes a virus en la etiología del UDN, no está. claro. LOUNATMAA y JANATUINEN (1978) citaron que las partículas citoplasmáticas podrían ser depósitos de glucógeno y no virus.
Papilomatosis de la platija
Signos clínicos y cambios citológicos
EMERSON et al. (1985) observaron unas lesiones tipo papiloma en la superficie dorsal de platijas capturadas en la bahía de la Concepción (Newfoundland), un estuario que recibe altas descargas de hidrocarburos mutagénicos. Las lesiones eran irregulares, como grandes ampollas en las que los espacios intercelulares estaban muy distendidos y las células sólo se hallaban en contacto por los desmosomas. Las células afectadas tenían el núcleo lobulado y una gran membrana nuclear; el citoplasma se hallaba lleno de vacuolas y numerosas y enormes mitocondrias degeneradas. la cisterna del retículo endoplasmático estaba distendida y los tonofllamentos en poca cantidad. &amos et al. (1985) observaron que los cambios citológicos y las partículas semejantes a virus vistas en las lesiones eran muy similares a las células X de los tumores de los peces planos del Pacifico y la necrosis dérmica ulcerativa del salmón atlántico.
Detección vírica
Micrografías electrónicas de células de lesiones mostraban partículas semejantes a virus no envueltas en el citoplasma y núcleo. Las partículas citoplasmáticas eran de alrededor de 30 nm de diámetro y se observaban libres o en agregados rodeados de membranas o en vacuolas. EMERSON et al. (1985) observó partículas degeneradas en vacuolas y especuló que las partículas eran segregadas y mantenidas en agregados rodeados de membranas como respuesta de los mecanismos de defensa celulares. En el núcleo se observaban acúmulos de gránulos parecidos a partículas, y ocasionalmente agrupaciones cristalinas de partículas de 25 nm en áreas próximas a las partículas de 30 nm del citoplasma adyacente. EMERSON et al. (1985) sugirió que las agrupaciones cristalinas intranucleares eran «factorías víricas•. A raíz de las tinciones citoquímicas, distribución de las partículas en la célula y efecto del tratamiento con ADNasa, EMERSON et al. (1985) sugirieron que las partículas no eran gránulos de glucógeno u otros productos celulares, sino que eran virus de ADN que se parecían a los papovirus o a los parvovirus. El virus no ha sido aislado en cultivo celular.