9ª Parte: Uso De Microorganismos Inmovilizados en Cultivos Camaronícolas y su Efecto en la Respuesta Productiva, Condición Fisiológica y Microbioma Intestinal
Resumen
Los microorganismos juegan roles importantes en el cultivo de especies acuáticas, incluyendo el mejoramiento de la respuesta productiva, condición fisiológica e inmune y calidad del agua en los sistemas de producción y sus efluentes. Nuestro grupo de trabajo se ha enfocado, además, en aspectos tales como su efecto en la modificación del microbioma intestinal y en la expresión de genes de importancia para propósitos acuiculturales.
El documento resume los resultados de nuestras investigaciones sobre caracterización, manejo y uso de microorganismos inmovilizados incluyendo: evaluación de materiales para la formación de biopelículas, efecto de biopelículas y bioflóculos en la respuesta productiva del camarón, en la expresión de genes relacionados con el sistema inmune y en la modificación del microbioma intestinal del camarón blanco.
Entre los resultados sobresalientes, se encontró: 1) que superficies sintéticas como la malla-sombra son más eficientes en la formación y estabilidad de las biopelículas; 2) que las biopelículas formadas en este material tienen una composición bioquímica adecuada para la nutrición del camarón; 3) que el consumo de biopelículas foto-autotróficas o heterotróficas, puede mejorar el crecimiento hasta en un 20%, la supervivencia alrededor de un 15 % y disminuir el FCA hasta en 0.5 unidades; 4) que la inclusión de biopelículas en sistemas de cultivo de camarón y tilapia reduce significativamente las concentraciones de nitrógeno amoniacal; 5) que el microbioma intestinal del camarón se ve notablemente modificado por el consumo de microorganismos asociados a biopelículas y 6) que genes relacionados con el sistema inmune se sobre-expresan en camarones que consumen microorganismos asociados a biopelículas.
Introducción
Ante la seria problemática que representa el alimento formulado para la acuacultura en términos de disponibilidad, costo e impacto ambiental, importantes y diversas investigaciones se han enfocado en la búsqueda de alternativas alimentarias más ecoeficientes y económicas. Los microorganismos han sido utilizados desde hace ya algunos años como un complemento alimenticio adecuado para organismos acuícolas como peces y camarones (Martinez-Córdova et al. 2015). La manera en que los camarones pueden aprovechar mejor a los microorganismos, es cuando se encuentran inmovilizados en superficies fijas (biopelículas) o flotantes (bioflóculos). La tecnología de bioflóculos se inició hace poco más de dos décadas (Avnimelech, 1995), pero actualmente ha sido optimizada y ampliamente utilizada para el cultivo de varias especies, pero mayormente en tilapia (Miranda-Baeza et al. 2017), y camarones peneidos (Emerenciano et al. 2017). Las
biopelículas se han empleado en menor medida y de manera más artesanal como por ejemplo el perifiton adherido a superficies de palos, bambú, etcétera (Anand et al. 2015). Como alternativa tecnológicamente más desarrollada de biopelículas, se tiene el uso de los llamados aquamats, los cuales son superficies artificiales teóricamente diseñadas para la adhesión de organismos específicos, pero con un costo que en términos generales no justifica su uso, ya que otros materiales menos costosos pueden dar un resultado similar (Audelo-Naranjo et al., 2015).
Los beneficios del uso de los microorganismos inmovilizados, no es solamente su aportación como alimento complementario, sino que además contribuyen al mejoramiento de la calidad del agua del sistema de cultivo (Miao et al., 2017), en algunos casos actúan como probióticos, inmunoestimulantes o inmunomoduladores (Kethi et al., 2017); adicionalmente pueden contribuir a mejorar la función enzimática digestiva de los organismos que los consumen por la aportación de enzimas exógenas (Anand et al., 2017).
Desde hace ya algunos años, la Universidad de Sonora, en colaboración con otras instituciones nacionales como el CIAD, la UES y el CIBNOR, se ha enfocado a la caracterización, uso y manejo de microorganismos y su contribución en el cultivo de camarón y tilapia en términos de respuesta productiva y condición fisiológica e inmune (Becerra-Dórame et al. 2012, 2014; Miranda-Baeza et al. 2016). Más recientemente, las investigaciones se han enfocado en estudiar el efecto que estos microorganismos tienen sobre la microbiota intestinal de los camarones, así como en la expresión de algunos genes relacionados sobre todo con el sistema inmune y la actividad enzimática digestiva. Hay evidencias documentales que sustentan la hipótesis de que la ingestión de microorganismos puede modificar el microbioma intestinal de diversos organismos incluyendo aquellos que son objeto de acuacultura (Vargas-Albores et al., 2017; Garibay-Valdez, 2017 En prensa).
Esta modificación puede tener efectos importantes en el desarrollo de los organismos en aspectos tales como crecimiento, supervivencia, FCA, eficiencia de asimilación proteica, entre otras (Martinez-Cordova et al. 2015). Igualmente está documentado que bacterias y otros microorganismos, al ser ingeridos, tienen un efecto sobre la expresión de algunos genes relacionados con respuesta inmune y actividad enzimática (Xu et al., 2013).
Algunos de los resultados más sobresalientes obtenidos por nuestras instituciones son presentados a continuación:
A. Evaluación de materiales naturales y sintéticos como superficies para la formación de biopelículas fotoautotróficas.
Se evaluaron tres materiales: madera, ixtle y malla-sombra plástica como superficies para la formación de biopelículas. Se utilizaron dos microalgas bentónicas: Navícula incerta y Navícula sp., ambas cultivadas en el laboratorio del DICTUS a partir de inóculos obtenidos del cepario del propio departamento. La fase experimental, se realizó al interior, con luz fluorescente a una irradiancia de 280 µml/m²/seg. Se utilizaron acuarios de plástico de 40 L en los que se colocaron los materiales a evaluar por triplicado. Después de cinco días se desprendió el material adherido a cada superficie de cada unidad experimental, resuspendiéndolo por agitación en 5 litros de agua. Se tomó una muestra de 300 mL, la cual se filtró en papel Whatman GFC. Por medio de la técnica de secado e ignición se estimó la materia seca y la materia orgánica. Se determinó además la composición químico proximal por los métodos convencionales (AOAC, 2010).
Tal como se muestra en la Figura 1, las mayores cantidades de materia seca (MS) y materia orgánica (MO), se obtuvieron con la microalga Navícula incerta, independientemente del material utilizado. Respecto a las superficies evaluadas, la mayor cantidad de MS y MO, se encontraron en el material de madera, sin embargo, mucha de esta materia provino de la propia madera, por lo que no se pudo constatar la cantidad real correspondiente a la biopelícula. La segunda mayor cantidad de MS y MO, se recuperó del material de tela de ixtle, aunque igualmente, mucho del propio material se desprendió y se contabilizó como biopelícula, además de que otra cantidad no se pudo recuperar debido a la naturaleza del material. La malla-sombra de plástico, aunque concentró la menor cantidad de MS y MO, mostró la mejor estabilidad y por lo tanto fue el material elegido.
Figura 1. Materia seca y materia orgánica en biopelículas de Navícula sp. (a) y Navícula incerta, en superficies de malla-sombra plástica, madera y tela.
Respecto a la composición químico-proximal de las biopelículas, la mayor concentración de proteína se obtuvo en madera con Navícula sp., muy similar al valor obtenido en malasombra con N. incerta. La concentración de carbohidratos fue mayor en la superficie de madera para las dos especies y el valor más bajo correspondió a la superficie de ixtle para N. incerta.
Figura 2. Composición químico-proximal (%) de las biopelículas formadas con Navícula sp. y Navícula incerta en superficies de plástico (1), madera (2) y tela de ixtle (3)
Los lípidos presentaron concentraciones más altas en ixtle para Navícula sp. y más bajos en madera para N. incerta.
B. Efecto del consumo de biopelículas fotoautotróficas y heterotróficas en la respuesta productiva y calidad del agua del sistema.
Se llevó a cabo un experimento al exterior, en donde se probaron tres tipos de biopelículas:
1. Foto-autotróficas; 2. Heterotróficas inespecíficas (consorcio marino) y 3. Heterotróficas con un probiótico comercial específico.
Las biopelículas tipo 1, se produjeron en tinas de 200 L, al exterior y cubiertas con plástico transparente, en donde se inoculó una microalga bentónica que fue promovida con fertilizante agrícola. Se introdujeron cortinas de malla-sombra plástica. Se mantuvo una aireación moderadamente fuerte y constante hasta la formación de las biopelículas.
Las biopelículas tipo 2 y 3, se produjeron en tinas de 200 L con aireación constante y ausencia de luz. Se enriquecieron con melaza y fertilizante agrícola en cantidades tales que se obtuviera una concentración de carbono orgánico de ± 50 mg/L y una relación C:N de 20:1.
Una vez que las biopelículas estuvieron formadas (al menos 1 mg de peso seco/cm²), se retiraron para ser probadas en acuarios de 60 L, en los que previamente se introdujeron 12 camarones con un peso promedio de 7 g. Cuando las biopelículas fueron consumidas casi totalmente, se reemplazaron por otras nuevas. Los camarones fueron además alimentados con un formulado comercial con 30 % de proteína, ajustando la ración de acuerdo al consumo aparente.
Diariamente se midieron los parámetros de calidad del agua: temperatura, salinidad, oxígeno disuelto, NAT y fosfatos, utilizando una sonda multiparamétrica YSI 6600 para los parámetros fisicoquímicos y un espectrofotómetro programable HANNA para los nutrientes.
Semanalmente se hicieron biometrías para conocer el peso promedio y la supervivencia, con estos datos se estimó el FCA.
Los resultados mostraron que las concentraciones de NAT y P-PO4 fueron significativamente menores en los tratamientos que incluyeron biopelículas (Figuras 3 y 4).
El crecimiento, la supervivencia, la biomasa final y el FCA fueron mejores en los tratamientos que recibieron biopelículas tanto autotróficas como heterotróficas (Figura 5).
Figura 3. Concentración de nitrógeno amoniacal en el control (rojo) y con biopelículas.
Figura 4. Concentración de fosfatos en el control (rojo) y con biopelículas.
La respuesta productiva del camarón mostró diferencias significativas entre los tratamientos.
La supervivencia fue mayor en los tratamientos con biopelículas de organismos heterotróficos inoculados con el consorcio marino y con organismos foto-autotróficos (microalgas), mientras que el control mostró la supervivencia más baja después de siete semanas (Figura 5).
Figura 5. Supervivencia del camarón en el control (C) y en los tratamientos con biopelículas inoculadas con un consorcio marino (M), con un probiótico comercial (P) y con microalgas (MA)
El crecimiento fue mayor en el tratamiento donde se usaron las biopelículas de organismos heterótrofos marinos, mientras que el control presentó los menores valores (Figura 6).
El factor de conversión alimenticia fue más bajo en el tratamiento con biopelículas del consorcio marino y más alto en el control (Figura 7).
Figura 6. Peso ganado (g) de L. vannamei en los tratamientos con biopelículas heterotróficas de un consorcio marino (M); heterotróficas de un probiótico comercial (P), fotoautotrófica de microalgas (MA) y Control (C).
Figura 7. Factor de conversión alimenticia de L. vannmei en los tratamientos con biopelículas heterotróficas de un consorcio marino (M); heterotróficas de un probiótico comercial (P), fotoautotrófica de microalgas (MA) y Control (C).
C. Diversidad microbiana intestinal del camarón alimentado con y sin biopelículas foto-autotróficas.
Se estudió el cambio en el microbioma de camarones después de ser alimentados con biopelículas basadas en microalgas bentónicas en comparación con camarones que no recibieron esta fuente de alimentación. El estudio se llevó a cabo al exterior en tinas de plástico de 60 L de capacidad, cubiertas con plástico transparente, aireación constante y sin recambio de agua (reposición por evaporación). Los camarones del tratamiento control, fueron alimentados con una dieta comercial, ajustando la ración diaria de acuerdo al consumo aparente; los organismos de los tratamientos fueron además alimentados con biopelículas formadas por microalgas (Navicula incerta), producida aparte. Una vez que los organismos consumían toda la biopelícula, ésta era cambiada por una nueva durante todo el bioensayo.
Se tomaron muestras de intestino de los organismos del control y de los tratamientos a los días 0, 15 y 30. Se extrajo el intestino de tres camarones por acuario, los cuales fueron juntados, homogenizados y colocados en tubos de 1.5 mL. Las muestras de biopelículas se tomaron por medio de raspado de superficie de manera aleatoria (4x4 cm). Las muestras se agruparon por cada acuario y se colocaron en tubos estériles de 1.5 mL.
Para la extracción de ADN de ambos tipos de muestras se utilizó el kit de aislamiento Power Biofilm (MP BIO Laboratories, Solana Beach, CA, EUA). La extracción se realizó según los pasos indicados en el protocolo del kit.
La detección de taxones se llevó a cabo mediante secuenciación masiva del gen ribosomal 16S (ARNr), considerando las regiones variables 3 y 4. Se utilizó un secuenciador de siguiente generación Illumina MiSeq.
Los resultados mostraron que la diversidad bacteriana de las biopelículas es bastante amplia a pesar de que se induce solo la adición de microalgas (Figura 8).
Los géneros de bacterias mayormente encontrados se muestran en la Figura 9, en donde se observa que la estructura poblacional bacteriana se basa en cuatro filos principales (Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes y Actinobacteria), mientras que a nivel de género destaca Vibrio.
Figura 8. Grupos de bacterias mayormente encontrados en las biopelículas foto-autotróficas introducidas a un cultivo de camarón blanco.
Figura 9. Géneros de bacterias mayormente encontrados en las biopelículas foto-autotróficas introducidas a un cultivo de camarón blanco.
La adición de biopelículas modificó la composición bacteriana intestinal de los camarones, aumentado la abundancia relativa de ciertas bacterias o favoreciendo su permanencia en el intestino del hospedero, y disminuyendo la abundancia de otras, tal como se muestra en la Figuras 11 y 12.
Los resultados de beta diversidad, mostraron que el consumo de biopelículas modificaba la microbiota intestinal del .
camarón, aunque se desconoce si estos cambios aportan nuevas funciones a la microbiota, por lo que se espera llevar a cabo estudios para inferir el potencial funcional de este tipo de consorcios y microbiota. Sin embargo, se vislumbra que el efecto positivo de las biopelículas sobre la supervivencia y crecimiento, podría deberse no solamente al aporte de nutrientes y mejoramiento de la calidad del agua, sino a un efecto a nivel fisiológico al tener incidencia sobre la microbiota intestinal, ya que esta se considera como un “órgano adicionado” a los organismos pertenecientes al reino animal, debido a las múltiples funciones que aporta (Clarke et al. 2014)
Figura 11. Abundancia relativa de la composición bacteriana intestinal de camarón blanco antes de la alimentación suplementada con biopelículas. a) A nivel de filo b) A nivel de género. Los géneros presentados son los que se encontraron con una proporción mayor a 0.5%
Figura 12. Abundancia relativa de la composición bacteriana intestinal de camarón blanco 15 días después de la alimentación suplementada con biopelículas. a) A nivel de filo en organismos control y b) A nivel de género en organismos control. c) A nivel de filo en organismos con biopelículas y d) A nivel de género en organismos con biopelículas. Los géneros presentados son los que se encontraron con una proporción mayor a 0.5%
D. Expresión de genes relacionados con el sistema inmune en camarones alimentados con bioflóculos. Se llevó a cabo un estudio para evaluar la expresión de dos genes relacionados con el sistema inmune en camarones a los que se les suministraron bioflóculos como complemento alimenticio, en comparación con aquellos que no lo recibieron.
Dos grupos de camarones, asignados cada uno a 3 acuarios de 60 L con 12 organismos por acuario, fueron cultivados al exterior por 3 semanas. El primer grupo (C o Control), se alimentó con un formulado comercial con 30 % de PC. El otro grupo (T o tratamiento), se alimentó, además, con bioflóculos basados en organismos heterotróficos (consorcio marino inespecífico). Al final del estudio, a 3 camarones de cada acuario, se les extrajo hemolinfa, la cual fue analizada para evaluar la expresión de los genes BGPB y ProPO.
Los camarones restantes fueron sometidos a un reto con Vibrio parahaemolyticus y virus de la mancha blanca, al final del cual se evaluaron nuevamente los mismos genes.
Para los análisis de expresión génica primero se extrajo el ARN de los hemocitos presentes en la hemolinfa por el método TRIzol®, del cual se cuantificó y analizó la integridad por espectrofotometría. A partir de las mediciones de cada muestra, todas se ajustaron a la misma concentración (4ng/μl). Seguidamente se realizó la retrotranscripción con el kit IScript Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR (Bio-Rad) siguiendo las instrucciones del fabricante, quedando finalmente el ADNc a una concentración de 1 ng/μl. Los análisis por PCR en tiempo real se llevaron a cabo en un termociclador StepOne de Applied Biosystem (Thermo Scientific, EUA Se analizaron los patrones de expresión de los genes profenoloxidasa (ProPO) y la Proteína beta de unión a glucanos (β-glucan binding protein (BGBP). Como gen endógeno (housekeeping) se usó un fragmento del gen de la proteína ribosomal L8, el cual sirvió para normalizar los datos de cada uno de los dos genes mencionados anteriormente. Los cebadores empleados se muestran en el cuadro 1. Para la mezcla de reacción se usó el kit “iTaq™ universal SYBR® Green supermix, (BIORAD, EUA) usando el protocolo estándar sugerido por el fabricante. Todas las reacciones fueron por triplicado y los resultados se analizaron con el método ΔΔ-Ct con curva estándar (Livak, et al. 2001). Finalmente, los datos fueron sometidos a una transformación logarítmica y se realizó un análisis multivariado (ANOVA), considerando el uso de dietas y el tiempo como factores (p<0.05).
Cuadro 1. Secuencia de los cebadores utilizados.
Los resultados mostraron que la incorporación de bioflóculos a la alimentación del camarón tuvo un efecto muy significativo en la expresión de los dos genes considerados (Figura 13).
Figura 13. Expresión relativa de los genes BGBP y ProPO en camarones control y alimentados con bioflóculos a la semana uno (1), dos (2), tres (3); 72 horas post-infección con WSSV (4) y 72 horas post-infección con V. parahaemolyticus (5)
Esta expresión de genes se vio reflejada en la supervivencia de los camarones sometidos al reto con Vibrio parahaemolyticus y virus de la mancha blanca (WSSV) tal como se puede observar en la Figura 14.
Figura 14. Supervivencia de L. vannamei alimentado con y sin bioflóculos, antes y después de los retos con V. parahaemolyticus y WSSV
Conclusiones
Con los resultados hasta hoy obtenidos es posible hacer algunas conclusiones importantes:
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Aunque la superficie de malla sombra fue seleccionada por mostrar el mejor desempeño en cuanto a la estabilidad y composición de las biopelículas, es factible que otros materiales pudieran ser iguales o mejores para tal propósito.
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La composición químico proximal de las biopelículas obtenidas en malla sombra con la microalga N. incerta es muy adecuada para la nutrición del camarón.
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La introducción de biopelículas y bioflóculos al sistema de cultivo, mejora la calidad del agua, sobre todo en términos de concentración de nitrógeno amoniacal.
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El consumo de microorganismos asociados a biopelículas o bioflóculos, ya sea basados en organismos foto-autotróficos o heterotróficos, mejora la respuesta productiva del camarón.
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El consumo de estos consorcios microbianos modifica la composición del microbioma intestinal del camarón lo cual puede traer efectos benéficos al hospedero. Esto es necesario investigarlo aún más.
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Los microorganismos asociados a biopelículas y bioflóculos, consumidos por el camarón modifican la expresión relativa de algunos genes relacionados con el sistema inmune y esto se traduce en mejor resistencia a patógenos.