12ª Parte: Desarrollo de biosurfactantes antibiofilm a partir de bacterias marinas contra patógenos Vibrio del camarón
Resumen
La enfermedad de Vibrio se describe como una enfermedad bacteriana importante, obviamente conocida como septicemia bacteriana peneida, vibriosis peneida, vibriosis luminiscente o enfermedades de las piernas rojas. Los signos de la enfermedad de Vibrio incluyen letargo, necrosis de tejidos y apéndices, crecimiento lento, metamorfosis larvaria lenta, malformación corporal, bioluminiscencia en camarones producida particularmente en sistemas de flóculos, opacidad muscular, melanización, intestino medio vacío y anorexia.
En Asia, V. alginolyticus y V. harveyi se consideraron los patógenos más importantes en los estanques de engorde del camarón tigre negro gigante Penaeus monodon. La supervivencia y la patogenicidad de Vibrio se asociaron con la formación de biopelículas y la detección de quórum. Por lo tanto, la interrupción de la formación de biopelículas y/o la detección de quórum sería una estrategia de gestión eficaz en los sistemas acuáticos en lugar de matar a los patógenos, lo que obviamente conduce al desarrollo de cepas resistentes. Los biosurfactantes son biomoléculas inteligentes de superficie activa que mostraron una fuerte actividad antibiopelícula contra los patógenos Vibrio. En este informe, los patógenos Vibrio que producen biopelículas incluyen V. harveyi VB1, V. alginolyticus VB2, V. vulnificus VB3, V. fischeri VB4, V. parahaemolyticus VB5 y Photobacterium damselae VB6 fueron aislados de las muestras de camarón moribundo recolectadas en granjas ubicadas en la costa sureste. de la India. Sobre la base de sus propiedades activas en la superficie, planteamos la hipótesis de que los biosurfactantes podrían alterar las biopelículas de los patógenos Vibrio.
Para probar la hipótesis, examinamos los efectos de los lipopéptidos extraídos de las bacterias marinas MSI-A 07 y MSI-A 08, sobre la capacidad de formación de biopelículas de la infección por biopelículas que causan Vibrio spp. (V. harveyi VB1, V. alginolyticus VB2, V. vulnificus VB3, V. fischeri VB4, V. parahaemolyticus VB5 y Photobacterium damselae VB6). Ambos biosurfactantes lipopeptídicos interrumpieron potencialmente la formación de biopelículas en condiciones dinámicas. El potencial de interrupción del biofilm de los biosurfactantes lipopeptídicos fue consistente frente a todos los patógenos del camarón. Con base en este hallazgo, se puede formular un alimento con biosurfactante incorporado para contener los brotes de Vibrio en la acuicultura del camarón.
Palabras clave: Biosurfactantes, vibriosis, acuicultura de camarones, disrupción de biopelículas.
Introducción
La acuicultura es la parte de sustento de más rápido desarrollo y se aventuró rápidamente en la industria multimillonaria. Sea como fuere, poco a poco, el verdadero inconveniente que enfrenta el negocio de la acuicultura en todo el mundo son las infecciones causadas por diferentes operadores biológicos y no biológicos. Los agentes biológicos bacterias, virus y hongos fueron aceptados como la causa de la desgracia financiera extrema en los centros de incubación y desarrollan lagos en todas las naciones creadoras de acuicultura (Ruangpan y Kitao, 1991). Entre los grupos de microorganismos que causan serias desgracias en el cultivo de camarones, los más conocidos son las bacterias debido a los impresionantes impactos económicos que tienen en los ranchos afectados (Lightner, 1996; Karunasagar et al. 1994).
Los vibrios patógenos son una de las principales fuentes de la enfermedad del camarón debido a su estrecha relación con las bajas tasas de supervivencia en los criaderos y lagos de cultivo. En muchas áreas de cultivo de camarones, las infecciones atribuidas a Vibrio spp. son vistos como los temas irresistibles más regulares y vitales (Ruangpan & Kitao, 1991; Sung et al. 2001). Los vibrios tienen la capacidad de crecer como biopelículas con resistencia a los desinfectantes y antibióticos que causan una variedad de enfermedades en los camarones en criaderos y estanques de crecimiento (Karunasagar., 1994, 1996; Álvarez et al. 1998). En 1996, Karunasagar et al. reveló el Vibrio harveyi resistente a los antibióticos retenido en los tanques de larvas de un criadero de camarones, muy probablemente como bacterias de biopelícula y, en consecuencia, no expulsado de manera efectiva por el tratamiento desinfectante.
Biopelícula de Vibrio
En la mayoría de las especialidades ambientales, los Vibrios se desarrollan en superficies regulares o artificiales como grupos de especies únicas o múltiples conocidos como biopelículas. Una biopelícula es un grupo microbiano sésil que comprende células que se unen irreversiblemente a un sustrato y se instalan en un marco polimérico extracelular (Donlan & Costerton, 2002). La gran mayoría de las investigaciones muestran que los biofilms son un punto fijo en un ciclo natural que se inicia con el vehículo y conexión de la bacteria a las superficies. Después de la conexión subyacente, la colonización de una superficie está intervenida por el desarrollo y desarrollo de microbios adjuntos. La colonización de la superficie en ese punto provoca el desarrollo de microcolonias, que a menudo están rodeadas por sustancias extrapoliméricas. Ayudar al desarrollo de bacterias y continuar con la creación de exopolisacáridos impulsar el avance del desarrollo de estructuras de biopelículas representadas por columnas y canales. Se ha demostrado que el avance de estas estructuras depende de la tasa de desarrollo de la biomasa, la motilidad nerviosa, las moléculas de señalización y la producción de exopolisacáridos (O'Toole et al. 1998: Costerton et al. 1995; y Parsek & Fuqua, 2004). Según O'Toole. (1998) la fisiología, las superficies celulares, la impermeabilidad a la degradación natural y las diferentes propiedades de las células del biofilm no son las mismas que las de sus compañeros planctónicos. El desarrollo de biopelículas se eleva como un componente esencial para la supervivencia microbiana en la naturaleza. Los vibriones son omnipresentes en situaciones en su mayoría entornos anfibios. El límite de encuadre del biofilm de V. cholerae está completamente archivado, tanto en entornos comunes como en condiciones de centros de investigación (Faruque et al. 2006; Watnick y Kolter, 1999; Yildiz y Schoolnik, 1999). Algunos descubrimientos de investigación revelan la importancia de las biopelículas en los componentes de supervivencia, nocividad y resistencia al estrés de Vibrio spp. (Watnick & Kolter 1999; Watnick et al. 2001; Zhu & MeKalanos, 2003; Faruque et al. 2006; You et al. 2007; Yildiz & Visick., 2009). Desde este punto de vista, la presente investigación tuvo como objetivo evaluar la capacidad de formación de biopelículas de Vibrio spp. patógenas, relacionadas con la enfermedad del camarón.
La enfermedad de Vibrio se representa como Vibriosis o infección bacteriana, septicemia bacteriana peneida, Vibriosis peneida, Vibriosis luminiscente o enfermedades de las piernas rojas y circula globalmente. Las indicaciones de la enfermedad de Vibrio incluyen pereza, putrefacción de tejidos y extremidades, desarrollo moderado, transformación larvaria moderada, deformidad corporal, bolitas negricans, bioluminiscencia, opacidad muscular, melanización, purga del intestino medio y anorexia (Karunasager et al. 1994; Lightner y Redman, 1994; Smith , 2000). En Asia, entre la recolección patógena de Vibrio, se contabilizaron 11 especies de los marcos de cultivo de camarones (Lavilla-Pitogo, 1995). De estos, V. alginolyticus y V. harveyi se consideran los más grandes en los lagos en desarrollo del camarón tigre negro gigante Penaeus monodon en India (Karunasagar et al. 1997; Selvin y Lipton, 2003; Manilal et al. 2010) . La patogenicidad de los intrusos microbianos en el hemocele carroñero radica finalmente en la capacidad de las formas de vida para evitar o evadir los sistemas de resistencia del huésped.
En este estudio, se describieron morfológica y bioquímicamente aislados de camarones desesperados en seis grupos. Entre los seis encuentros, se proyectaron los biofilmadores más dinámicos.
Fueron nombrados como V. harveyi VB1, V. alginolyticus VB2, V. vulnificus VB3, V. fischeri VB4, V. parahaemolyticus VB5 y Photobacterium damselae VB6. Con respecto a la resistencia a los antibióticos, todos los aislamientos fueron impermeables al coloranfenicol seguido de la oxitetraciclina. Los patógenos resistentes a los antibióticos y la acumulación de depósitos en el tejido del camarón han resultado ser normales en los ranchos de camarones indios (Selvin y Lipton, 2003). V. harveyi resistente a los antibióticos de larvas contaminadas mostró valores más bajos de LD50 para P. monodon post larval que los aislamientos de V. harveyi adquiridos del agua de mar (Karunasagar et al. 1997). En piensa por Karunasagar et al. (1994, 1996), Vibrio harveyi resistente a los antibióticos perseveró en los tanques de larvas de un criadero de camarones, muy probablemente como bacterias de biopelícula y, de esta manera, no se eliminó fácilmente mediante un tratamiento desinfectante. Estos descubrimientos propusieron el peligro potencial de la utilización estándar de agentes antiinfecciosos en la acuicultura y muestran que pueden desarrollar el Vibrio spp. nocividad, por ejemplo, el desarrollo de biopelículas.
Todos los aislamientos de camarones incurables (V. harveyi VB1, V. alginolyticus VB2, V. vulnificus VB3, V. Fischeri VB4, V. para haemolytic us VB5 y Photobacterium damselae VB6) en placa CRA crearon colonias negras. La producción de limo asume una parte esencial en la patogenia de las contaminaciones causadas por diversos microorganismos (Alcaráz, 2003; Abdallah et al. 2008), y se cree que es un factor de nocividad notable para algunos Vibrio alginolyticus y Vibrio parahaemolyticus (Abdallah et al. 2008) .
Capacidad de formación de biopelículas de los patógenos Vibrio
La detección de quórum asume un papel clave en la formación de biopelículas. Davis et al. (1998) publicó el estudio principal que mostró un papel mayoritario en la detección de la formación de biopelículas e impulsó una era de investigación dinámica de la comunicación de célula a célula en biopelículas. MacLean et al. (1997) han demostrado que los autoinductores de acil HSL son distinguibles en biopelículas que ocurren normalmente, proponiendo que los grupos de biopelículas en la naturaleza contienen poblaciones que pueden experimentar una regulación dependiente de la densidad celular. A la luz de la investigación, la presencia de moléculas de señalización de célula a célula se observó en solo 3 productores de biopelículas (VB3, VB4 y VB5) entre los 6 aislados seleccionados (VB1-VB6). A la luz del material de investigación anterior y la investigación que encontró el Vibrio spp. Los camarones separados de los moribundos son reconocidos como productores potenciales de biopelículas V. harveyi VB1, V. alginolyticus VB2, V. vulnificus VB3, V. fischeri VB4, V. parahaemolyticus VB5 y Photobacterium damselae VB6.
El microscopio estereozoom se utiliza principalmente para observar cómo se acumula la biopelícula en superficies sólidas. La biopelícula se creó sobre las placas de poliestireno de microtitulación y se observó con un instrumento de aumento estereozoom. Se observó la acumulación de biopelícula en la superficie fuerte y se tomaron fotografías. La acumulación de biopelículas en la placa de microtitulación fluctúa en función de la naturaleza de su conexión superficial. La fotografía se muestra en la Figura 1. El Vibrio spp. se entregaron medidas distintivas de biopelícula en las placas de microtitulación de poliestireno.
La formación de biopelículas se percibe como un factor destructivo imperativo tanto para los patógenos oportunistas como para los verdaderos (O'Toole et al. 2000). Las biopelículas bacterianas tienen un diseño y una forma básicamente intrincados y dinámicos en numerosas superficies abióticas (plástico, vidrio, metal y minerales) y superficies bióticas (plantas, criaturas y personas) (Stoodley et al. 2002; Hall-Stoodley et al. 2004) como uno o varios grupos de especies. La disposición del biofilm es un componente crítico para la supervivencia microbiana en la tierra. El desarrollo de biopelículas es un componente imperativo para la supervivencia microbiana en la tierra.
Los microorganismos formadores de biopelículas son menos susceptibles a numerosos compuestos antimicrobianos y diferentes biocidas. La formación de biopelículas en dispositivos médicos juega un papel importante en el problema de numerosas enfermedades nosocomiales y relacionadas con la salud y también el desarrollo de biopelículas favorece la supervivencia y el equilibrio de Vibrio spp. en el medio acuático y además dentro del huésped.
Figura 1. Imágenes de microscopio estereozoom que demuestran el potencial de formación de biopelículas de Vibrio spp. (VB1 a VB6).
A la luz de las razones anteriores, se requieren nuevos agentes antibiofilm para evitar/controlar todos los patógenos del camarón. Los biosurfactantes lipopeptídicos, específicamente MSI-A 07 y MSI-A 08 demostraron un magnífico impedimento contra las biopelículas de patógenos de camarón (VB1 a VB6).
El biosurfactante lipopeptídico liofilizado se utilizó para cuantificar la fijación inhibitoria del biofilm. Para determinar el BIC de estos dos biosurfactantes lipopeptídicos en camarones Vibrio spp., se utilizaron extractos con diferentes niveles de concentración (10–50 μg/mL). La reducción subordinada a la fijación en la disposición del biofilm de los patógenos de prueba se obtuvo con el tratamiento con los biotensioactivos lipopeptídicos. Los biosurfactantes obtenidos de MSI-A 07 indicaron la inhibición más extrema de la biopelícula de 75-80 % en una agrupación de 30 μg/mL (Figura 2.1) y el biosurfactante lipopeptídico aislado de MSI-A 08 reprimió el desarrollo de biopelícula de los patógenos del camarón hasta 70-75 %, en un foco de 40 μg/mL (Figura 2.2). Por lo tanto, 30 μg/mL y 40 μg/mL se fijaron como el BIC para los lipopéptidos MSI-A 07 y MSI-A 08 por separado y se realizaron medidas adicionales a esta concentración de extracto.
Potencial de disrupción del biofilm de los biosurfactantes lipopeptídicos
Las imágenes obtenidas del microscopio de contraste de fase del escenario revelaron que los biosurfactantes lipopeptídicos extraídos de MSIA-07 y MSI-A 08 presentaban una alteración potencial del biofilm. En el examen del cubreobjetos, la ruptura de la biopelícula fue clara y demostró una biopelícula rota bajo el microscopio de contraste de fase (Lámina 3.1). Estos resultados demuestran de manera legible que los biosurfactantes de lipopéptidos interrumpen la unión inicial a la superficie. Una de las características importantes de la biopelícula es la unión inicial.
Figura 2. 1. Eficacia del biosurfactante lipopeptídico (MSI-A 07) en el potencial de formación de biopelículas de patógenos de camarón.
Figura 2. 2. Eficacia del biosurfactante lipopeptídico (MSI-A 08) en el potencial de formación de biopelículas de patógenos de camarón.
En este sentido, la acción contraria de la conexión del biofilm provoca la interrupción del biofilm. Las imágenes adquiridas del microscopio óptico mostraron que las diapositivas de control mostraban una biopelícula bien formada de patógenos de prueba, mientras que los patógenos de prueba, tras el tratamiento con biotensioactivos lipopeptídicos, formaron una biopelícula deficiente que la prueba de control (lámina 3.3).Para decidir los resultados adquiridos en microscopía óptica (es decir, la descomposición de las estructuras de biopelícula por biosurfactantes), utilizamos microscopía de escaneo láser confocal (CLSM) para ilustrar adicionalmente la capacidad antibiopelícula de los lipopéptidos contra biopelículas de camarones patógenos Vibrio spp. (V. harveyi VB1, V. alginolyticus VB2, V. vulnificus VB3, V. fischeri VB4, V. parahaemolyticus VB5 y Photobacterium damselae VB6) (Lámina 3.4). CLSM demostró una fuerte capacidad de adherencia de los patógenos del camarón, lo que impulsó la mejora del desarrollo de una biopelícula gruesa en portaobjetos de vidrio de muestras de control, mientras que las muestras tratadas mostraron la capacidad antibiopelícula de MSI-A 07 y MSI-A 08 al desmoronar el diseño de biopelícula refractaria de los patógenos probados. sobre el tratamiento. La prueba de la placa de microtitulación también demostró la capacidad de disrupción del biofilm del biotensioactivo lipopeptídico MSI-07 y MSI-A 08 en placas de microtitulación bajo examen microscópico estereozoom (lámina 3.5).
Placa 3.1. Imágenes de microscopio de contraste de fase que demuestran los potenciales de alteración del biofilm de los biosurfactantes lipopeptídicos MSI-A 07 y MSI-A 08 contra los patógenos del camarón
Placa 3.2. Observación directa que demuestra los potenciales antibiopelícula de los biosurfactantes lipopeptídicos MSI-A 07 y MSIA 08 contra los patógenos del camarón
Placa 3.3. Imágenes de microscopio de contraste de fase que demuestran el potencial antibiopelícula de los biosurfactantes lipopeptídicos MSIA 07 y MSI-A 08 contra los patógenos del camarón
Los tensioactivos microbianos o biotensioactivos son partículas anfipáticas de superficie dinámica liberadas por varios microorganismos. Últimamente, se ha descubierto que los tensioactivos microbianos tienen algunas propiedades útiles y de importancia biomédica, p. Propiedades antibacterianas, antifúngicas y antivirales. Las propiedades antimicrobianas de los biosurfactantes se han detallado en general. Una propiedad valiosa de numerosos biosurfactantes que no se ha examinado ampliamente es su acción antibiopelícula.
Placa 3.5. Imágenes estereozoom que demuestran el potencial antibiopelícula de los biosurfactantes lipopeptídicos MSI-A 07 y MSIA 08 contra los patógenos del camarón
Placa 3.4. Imágenes CLSM que demuestran el potencial antibiopelícula de los biosurfactantes lipopeptídicos MSI-A 07 y MSI-A 08 contra los patógenos del camarón
Los glicolípidos suministrados por Brevibacterium casei (Kiran et al. 2010) y los ramnolípidos creados por Serratia marcescens (Dusane et al. 2010) han indicado un alto nivel de antibiofilm. Recientemente, Quinn et al. (2012) detallaron la capacidad antibiopelícula del lipopéptido separado de Paenibacillus polymyxa.
La capacidad de los tensioactivos para reprimir el desarrollo de biopelículas se representa para el tensioactivo ramnolípido de P. aeruginosa PAO1 (Davey et al. 2003) y para los lipopéptidos creados por los organismos microscópicos grampositivos Lactobacillus, Bacillus y Streptococcus (Busscher et al. 1997; Velraeds et al. . 2000; Mireles et al. 2001). Sea como fuere, la cantidad de informes sobre el avance de nuevos biosurfactantes antibiofilm es insignificante.
A pesar de que ha habido pocos informes de nuevos biosurfactantes antibiofilm, sus posibilidades de interrupción del biofilm no se han investigado en puntos de interés.
Con este punto de vista, el presente examen se dirigió a evaluar la capacidad de interrupción del biofilm de los biosurfactantes lipopeptídicos extraídos de la actinobacteria marina Nocardiopsis sp. MSI-A 07 y Streptomyces coeruleorubidus MSI-A 08.
El desarrollo bacteriano emerge rápidamente no mucho después de su conexión a un sustrato fuerte, que es la etapa subyacente en la formación de biopelículas. Para comenzar un par de horas de desarrollo a primera vista, el apego es reversible (Marshall, 1994, Hoiby et al. 2001). De esta manera, la anticipación de la unión bacteriana en la etapa extremadamente introductoria puede disminuir esencialmente el peligro de una mayor formación de biopelículas. Ambos biosurfactantes lipopeptídicos obstaculizaron la formación de biopelículas en su momento inicial al reducir las microcolonias enmarcadas por patógenos de camarones. Ambos biosurfactantes lipopeptídicos redujeron la formación de biopelículas hasta en un 75 y 80 % en una agrupación de 30 μg/mL y 40 μg/mL contra patógenos de camarones, por separado. Los resultados comparativos fueron explicados por Rodrigues et al. (2006), demostró que los ramnolípidos reprimen el enlace bacteriano en un rango que varía del 21 % al 81 %. La medida de la placa de microtitulación de 96 pocillos es el examen más utilizado para la identificación del desarrollo de biopelículas (Christensen, 1985). Tanto la inhibición del ensayo de biopelícula como las observaciones microscópicas demostraron obviamente que ambos biotensioactivos lipopeptídicos disminuyeron y alteraron de forma viable las microcolonias.