15ª Parte: ARN no codificantes: descubrimiento de su relevancia potencial en la nutrición de los peces
Resumen
La optimización de la producción industrial sólo sería posible con el descubrimiento, identificación y caracterización de los procesos biológicos en los que actúa un nutriente o cualquier otro factor, así como cuando se revelan sus genes y redes genéticas. Con el advenimiento de las tecnologías de secuenciación de próxima generación, el descubrimiento de ARN no codificantes que tienen un papel clave en el control de un conjunto diverso de funciones biológicas en organismos multicelulares permitirá un conocimiento más profundo sobre los genes y las redes genéticas que controlan dichos procesos en peces de cultivo. especies.
Aquí, se revisarán brevemente los conceptos básicos de los ARN no codificantes con respecto a sus características, biogénesis y modo de acción, mientras que los trabajos de investigación realizados específicamente hasta ahora sobre la identificación de ARN no codificantes en diferentes especies de peces de cultivo, etapas de desarrollo y tejidos utilizando se describirán y compararán tecnologías de alto rendimiento. Varios ARN no codificantes se han asociado con eventos de desarrollo temprano, respuesta inmune a infecciones por patógenos, diferenciación y maduración sexual y nutrición. Si bien la investigación sobre miARN es la más abundante, los nuevos esfuerzos en la caracterización de los perfiles de ARN largos no codificantes y ARN que interactúan con PIWI proporcionaron nuevos conocimientos sobre cómo estos ARN no codificantes también están involucrados en la nutrición de los peces. Finalmente, se señalarán las perspectivas y consideraciones futuras sobre el uso potencial de ARN no codificantes (principalmente los que se encuentran en circulación) en especies de peces cultivadas relevantes como nuevos biomarcadores confiables de la condición fisiológica.
Palabras clave: ncRNAs, miRNAs, nutrigenómica, transcriptómica, NGS.
1. Más allá del dogma central: el complejo mundo de los RNA no codificantes.
La optimización de la producción industrial sólo sería posible con el descubrimiento, identificación y caracterización de los procesos biológicos en los que actúa un nutriente o cualquier otro factor, así como cuando se revelan sus genes y redes genéticas. En los genomas eucarióticos, solo una pequeña fracción del ADN codifica proteínas, pero el ADN que no codifica proteínas alberga elementos genéticos importantes que dirigen el desarrollo y la fisiología de los organismos, como promotores, potenciadores, aislantes y genes de ARN no codificantes. Durante años, se creyó en el dogma central de Crick: el ADN se transcribe en ARNm y el ARNm se traduce en proteínas (Crick, 1970). Mientras que el ADN que codifica proteínas representa el 2% del ADN de los mamíferos, el ADN restante son secuencias no codificantes (el ADN "basura"). Más recientemente, entre este 98 %, se descubrió que, aunque no se transcriben, algunas secuencias de ADN albergan información básica para regular la transcripción de genes que codifican proteínas (p. ej., promotores, potenciadores, aislantes, etc.), mientras que otras regiones se transcriben activamente en ARN no codificantes. que son esenciales para ayudar en la traducción de genes que codifican proteínas (p. ej., ARN ribosomal y ARN de transferencia). Con el advenimiento de las tecnologías de secuenciación de próxima generación (NGS), la noción de ADN "basura" fue rechazada y abrió una nueva puerta hacia la comprensión de la complejidad de los organismos multicelulares superiores que la región codificadora de proteínas no logra explicar (Lozada-Chávez et al. 2011). Hoy en día, los análisis transcriptómicos de alto rendimiento han revelado que los genomas eucariotas transcriben hasta el 90% del ADN genómico (The ENCODE Consortium, 2004). La gran mayoría de este ADN genómico se transcribe como ARN no codificante (ncRNA), ya sea como ncRNA infraestructurales, incluidos ribosómicos (rRNA), de transferencia (tRNA), pequeños nucleares (snRNA) y pequeños nucleolares (snoRNA); o como ncRNA reguladores, clasificados principalmente en microRNA (miRNA), RNA interactuantes con testículos debiluchos inducidos por Peelement (PIWI), RNA pequeños de interferencia (siRNA), RNA largos no codificantes (lncRNA), RNA circulares (circRNA), ARN asociados a promotores (PAR) y ARN potenciadores (ARNe; Kaikkonen et al. 2011).
2. ARN no codificantes: familias, orígenes y funciones.
Durante las últimas dos décadas, se obtuvieron varias evidencias que respaldan el papel clave de estos ncRNA reguladores en un conjunto diverso de funciones biológicas en organismos multicelulares.
Aunque la mayor parte del conocimiento provino de estudios en especies de mamíferos, el uso generalizado y rentable de las tecnologías NGS permitió la identificación de estos ncRNA, así como los genes codificadores de proteínas involucrados en su biogénesis e interacciones de proteínas en varios grupos taxonómicos, incluidos los virus, bacterias, plantas, Cnidaria, Platyhelminthes, insectos y vertebrados no mamíferos (peces, aves y reptiles; Rosani et al. 2016). Aunque ya se han realizado pocos estudios funcionales para demostrar la poderosa acción reguladora de los ncRNA, la aparición de todos estos ncRNA a lo largo de la evolución, algunos de ellos con regiones parcialmente conservadas entre diferentes taxones, ya es una fuerte evidencia del importante papel que juega cada tipo de Los ncRNA podrían tener. Las acciones más conocidas de los ncRNA se ocupan de la regulación de la expresión génica, la traducción y la actividad del transposón. Los ncRNAs más estudiados debido a la acción reguladora sobre genes eucariotas y otros elementos genéticos son los ncRNAs pequeños (sncRNAs): siRNAs, miRNAs y piRNAs (Ghildiyal and Zamore, 2009; Kim et al. 2009; Malone and Hannon, 2009), siendo estos últimos los sncRNAs menos estudiados. Mientras que los siRNA y los miRNA participan en la misma maquinaria de silenciamiento, los piRNA están particularmente involucrados en el silenciamiento de los transposones de la línea germinal, entre otras funciones. El silenciamiento de ARN proporciona una inhibición altamente específica de la expresión génica a través del reconocimiento complementario de objetivos de ARN. El complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) forma el núcleo de la maquinaria de silenciamiento de ARN y consta de una proteína de la familia Argonaute (AGO) y un pequeño ARN que actúa para guiar a RISC hacia sus objetivos (un ARN "guía"). Una vez cargadas con un sncRNA, las proteínas AGO inhiben la expresión de sus objetivos, ya sea mediante la escisión mediante la actividad de la endonucleasa SLICER o mediante la atracción de proteínas adicionales que pueden afectar la traducción, la estabilidad del ARN o la estructura de la cromatina. La mayoría de los organismos eucariotas poseen más de una proteína AGO y las funciones de los miembros individuales de la familia a menudo no son redundantes (Siomi et al. 2011). Por otro lado, los ARN largos no codificantes (lncRNA) pueden participar en procesos fisiológicos y patológicos a través de la inactivación cromosómica y modificaciones epigenéticas, el control de la descomposición y traducción del ARNm y/o el secuestro de ADN de factores de transcripción. Más recientemente, se ha descubierto que los ARN circulares (circRNA) y los ARN endógenos competitivos (ceRNA) regulan la función de miARN a nivel transcripcional/postranscripcional. Además de su modo de acción, esos ncRNA también diferían en su biogénesis. Las características, la biogénesis y los mecanismos de acción de las clases de ncRNA reguladores más comúnmente estudiadas se describirán brevemente. descrito abajo
2.1. Pequeños ARN de interferencia (siRNA)
El siRNA canónico es un RNA lineal de doble cadena (dsRNA) perfectamente apareado de 21 a 23 nt de longitud, que contiene una secuencia de mRNA (cadena con sentido) y su complemento (cadena activa antisentido; revisado en Wittrup y Lieberman, 2015). Los siRNA son procesados por la endonucleasa DICER (así como los miRNA) que silenciarán directamente el objetivo cuando se cargan en RISC. En este sentido, los siRNA pueden mediar en el silenciamiento de los objetivos de mRNA (i) a nivel postranscripcional; (ii) a nivel transcripcional aumentando las marcas epigenéticas (p. ej., metilación) de la heterocromatina, en particular silenciando los ARNm del mismo locus del que se derivan; y/o (iii) suprimir la retrotransposición (revisado en Castel y Martienssen, 2013). Esas funciones de los siRNA lideran su uso en el tratamiento de enfermedades humanas (Wittrup y Lieberman, 2015), así como un método para el sistema de eliminación de genes para el análisis funcional en especies modelo para la biología del desarrollo como el pez cebra (Danio rerio) (Shinya et al. 2013), o como estrategia para el control de enfermedades virales en acuicultura (Papic et al. 2015).
2.2.MicroARN (miARN)
Los miRNA son, con mucho, los sncRNA más estudiados. Son moléculas monocatenarias pequeñas (20–24 nt) conservadas evolutivamente derivadas de transcripciones (premiARN) y caracterizadas por formar estructuras de horquilla distintivas (revisado en Ha y Kim, 2014). Los pre-miARN se procesan secuencialmente en el miARN maduro por DROSHA y DICER, aunque recientemente se ha demostrado un procesamiento independiente de DICER.
Los miARN maduros finalmente interactuarán con las proteínas AGO para formar RISC. Luego, los miARN se emparejan con los ARNm, más favorablemente con la región no traducida (UTR) 3′, aunque también se ha demostrado el emparejamiento con la UTR 5’ o la secuencia de ADN codificante (CDS). A diferencia de los siRNA, los miRNA no se adaptan perfectamente a la secuencia del mRNA. En cambio, se ha demostrado un emparejamiento no completamente complementario con las 2-8 bases (mer) de la 5'UTR de la semilla de miARN con la región específica del ARNm para regular la traducción postranscripcional de los ARNm específicos (Yartseva et al. 2016). ). La regulación postranscripcional de los ARNm dirigidos puede realizarse a través de la deadenilación del ARNm (seguida de su degradación), la escisión del ARNm y/o la represión de la traducción al inicio o la elongación. Además, además de estas funciones clásicas, también se ha demostrado que los miARN regulan la expresión génica en el promotor del ARNm diana a través de mecanismos epigenéticos. De una u otra forma, los miARN podrían dirigirse al 30-60% de los genes humanos transcritos (John et al. 2004; Sand et al. 2012), lo que tiene fuertes implicaciones en los procesos de diferenciación y muerte celular, respuestas al estrés y enfermedades. Durante la última década se ha llevado a cabo una gran cantidad de trabajos de investigación para identificar y predecir los mRNA (y los procesos biológicos) dirigidos por los miRNA en diferentes especies de peces (ver más abajo).
2.3.Testículo debilucho inducido por el elemento P (PIWI)-ARN interactivos (piRNA)
Los ARN interactivos (piRNA) inducidos por el elemento P (PIWI) son sncRNA conocidos de 24-31 nt de longitud, que forman complejos con las proteínas PIWI de la familia AGO y tienen un conjunto diverso de funciones (revisado en Siomi et al. (2011), Watanabe y Lin (2014), Iwasaki y otros (2015) y Sarkar y otros (2017), entre otros. Se ha demostrado que el papel principal de los piRNA es silenciar los elementos transponibles (TE) en la línea germinal de los animales.
Los TE son parásitos genómicos que amenazan la integridad genómica del huésped, ya que pueden moverse a nuevos sitios por inserción o transposición y, por lo tanto, alterar los genes. En los animales, los siRNA endógenos también silencian los TE, pero la vía del piRNA está a la vanguardia. Al silenciar los TE en la línea germinal, los piRNA evitan que las mutaciones dañinas se transmitan a las siguientes generaciones.
Sin embargo, investigaciones recientes sugirieron que los piRNA están desempeñando funciones importantes más allá del silenciamiento de TE, y se informó su expresión en tejidos distintos de las gónadas (revisado en Sarkar et al. 2017). En resumen (revisado en Siomi et al. 2011), los piRNA se originan a partir de precursores monocatenarios que dan lugar a piRNA antisentido, que luego reconocen y se dirigen a la escisión de los transposones por las proteínas PIWI asociadas. Esto genera piRNAs de sentido adicionales que surgen de la secuencia de transposones objetivo. Dicho proceso se conoce como el ciclo 'ping-pong', aumentando la abundancia de piRNAs y silenciando transposones. El mecanismo de acción del piRNA no se comprende por completo, pero probablemente involucre a la arginina metil transferasa PRMT5, las proteínas que contienen el dominio tudor (TDRD) y la proteína Maelstrom (MAEL; Sokolova et al. 2011). Curiosamente, un estudio reciente mostró que los genes de la ruta piRNA evolucionaron rápidamente en los peces teleósteos en comparación con los mamíferos, y es probable que se adapten a la mayor diversidad de transposones en las especies de peces teleósteos (Yi et al. 2014).
2.4.RNAs largos no codificantes (lncRNAs)
Los lncRNA son ncRNA de más de 200 nt, aunque algunos de ellos actúan como fuente de RNA más cortos. La categorización de los ncRNA dentro de los lncRNA es bastante ambigua/heterogénea con respecto a su localización. Algunos lncRNA se encuentran en el núcleo mientras que otros en el citoplasma. Además, algunos de ellos pueden tener o no cola poli A (revisado en Fatica & Bozzoni, 2013). Sin embargo, todos tienden a mostrar un bajo nivel de expresión. El grado de conservación de los lncRNA a lo largo de la evolución es bastante bajo, ya que solo el 4-11% de los lncRNA conservan algunas regiones conservadas entre mamíferos y peces (Basu et al. 2013).
Los lncRNA tienen funciones cruciales en el control de la expresión génica durante los procesos de desarrollo y diferenciación (revisado por Fatica y Bozzoni, 2013). En resumen, en el núcleo, los lncRNA guían a los modificadores de cromatina (ADN metiltransferasas y modificadores de histonas, como el complejo represivo Polycomb PRC2 y diferentes histonas) a loci genómicos específicos para inducir la formación de heterocromatina represiva y, por lo tanto, la represión transcripcional. Además, también reprimen la transcripción génica actuando como señuelos secuestrando factores de transcripción, modulando alostéricamente proteínas reguladoras y/o alterando dominios nucleares y estructuras cromosómicas tridimensionales de largo alcance. En este sentido, los lncRNA nucleares pueden actuar sobre el mismo loci (cis-) o sobre uno distante (trans-).
Los lncRNA citoplasmáticos pueden modular la traducción del mRNA a través de un conjunto diverso de modos: mediante regulación positiva o negativa con emparejamiento complementario directo con el mRNA objetivo, aumentando o disminuyendo la estabilidad del mRNA y/o uniéndose y secuestrando miRNA específicos. Un tercer tipo de mecanismo regulador de la expresión génica realizado por los lncRNA, y el mejor caracterizado, es a través de la compensación de dosis y la impronta genómica, que se basa en la formación de cromatina silenciada para producir la expresión monoalélica de genes específicos. La extraordinaria complejidad de la regulación transcripcional realizada por los lncRNA se refleja aún más en un solo lncRNA que funciona mediante diferentes mecanismos según el tipo de célula.
Hasta la fecha, de las decenas de miles de lncRNA de metazoos descubiertos por proyectos transcriptómicos de alto rendimiento, solo se han caracterizado funcionalmente unos pocos lncRNA. Algunos de ellos son XIST, HOTAIR y MALAT1, siendo el último conservado evolutivamente en especies de peces (Johnsson et al., 2014). Entre ellos, el gen H19 que codifica un ncRNA de 2,3 kb se expresa mucho durante la embriogénesis, pero se apaga en la mayoría de los tejidos después del nacimiento y se sabe que está involucrado en la impronta genómica. Se ha demostrado que la desnutrición materna regula la expresión de H19 de una manera específica para el sexo, siendo la dieta materna baja en proteínas la causa de las anomalías en los blastocistos de los ratones machos pero no de las hembras (Kaikkonen et al. 2011). En las especies de peces, mientras que se ha encontrado que otros lncRNA específicos inducen defectos de desarrollo en el pez cebra, como los lncRNA cyrano y megamind (Ulitsky et al. 2011), la modulación de los lncRNA se ha asociado con la respuesta inmune del salmón del Atlántico (Salmo salar) a infecciones patógenas (Boltaña et al. 2016).
2.4.1. ARN circulares (circRNA) y ARN endógenos competitivos (ceRNA)
Entre las diferentes clases de lncRNAs, dos de ellos actúan como esponjas para los miRNAs. Mientras que los ceRNA lineales tienen una vida media corta que permite un control rápido de la actividad de la esponja, los circRNA tienen una estabilidad mucho mayor y su rotación puede controlarse mediante la presencia de un sitio diana de miRNA perfectamente coincidente. Los circRNA difieren estructuralmente de otros lncRNA en que sus extremos 3' y 5' no están libres, sino que se unen covalentemente en un sitio flanqueado por señales de empalme canónicas en contraste con el patrón de empalme normal en el que un donante de empalme se une a un aceptor de empalme aguas abajo (revisado). en Ebbsen et al. 2016). Los CircRNA pueden derivarse del exón de genes que codifican proteínas, de regiones UTR intrónicas, intergénicas, loci de ncRNA y de ubicaciones antisentido para transcritos conocidos; y puede comprender uno o más exones.
Curiosamente, dado que algunos de estos circRNA multiexónicos consisten exclusivamente en secuencias exónicas, estos circRNA deben someterse a empalme para eliminar los intrones antes o después de la circularización, y luego se exportan desde el núcleo al citoplasma a través de una vía no caracterizada. El papel y la importancia biológica de los circRNA actualmente no están caracterizados y han sido una fuente de debate. Sin embargo, los circRNAs tienen una gran estabilidad ya que no se encuentran extremos libres donde pueda actuar la degradación por exonucleasas, sino que además la falta de una cola 3' poli(A) los hace resistentes a la deadenilación, decapping y degradación que normalmente se observa en los mRNAs. Así, ellos ser la esponja más eficiente para los miARN, ya que esta estabilidad permitirá que los circARN se acumulen y mantengan la función reguladora durante un período de tiempo más largo que los ceARN. Los circRNA se han predicho y aislado en el pez cebra y el celacanto (Latimeria chalumnae) (Shen et al. 2016) y en la gran corvina amarilla (Larimichthys crocea), donde las vías GO y KEGG de los genes incluidos en esos circRNA se relacionaron con el sistema digestivo y el metabolismo. (Xu et al. 2017).
2.4.2. ARN potenciadores (ARNe)
Los eRNA son otra clase de lncRNA. El tamaño de los eRNA oscila entre 0,1 y 9 kb y muestra una firma de metilación de histonas específica típica de los potenciadores (revisado en Smith y Shilatifard (2014) y Lam et al. (2014)). Más particularmente, los ARNe se producen a partir de regiones de ADN extremadamente ricas en monometilación en la lisina 4 de la histona 3 (H3K4me1), pero no en la trimetilación de H3K4 (H3K4me3), y se conservan evolutivamente. Varias evidencias indican que los eRNA funcionan como activadores transcripcionales, ya que el agotamiento del eRNA condujo a una disminución específica del gen en la expresión del mRNA. Además, esta actividad potenciadora de la transcripción parece ser específica de la secuencia, ya que la sustitución del eRNA por otros marcos de lectura abiertos condujo a una disminución de la actividad potenciadora, aunque el sitio de inicio de la transcripción permaneció intacto (Orom et al. 2010). Se ha llevado a cabo un trabajo limitado para explorar los eRNA en especies de peces, y solo se ha realizado recientemente y estrictamente en eRNA de pez cebra (Pauli et al. 2012; Taminato et al. 2016; Trinh et al. 2017).
2.5. Descripción general de los mecanismos de acción de los ncRNA
Como se mencionó anteriormente, cada ncRNA puede regular la expresión génica y la traducción en un conjunto diverso de formas dentro de cada célula. Además, algunos ncRNAs también pueden regular la acción de otros ncRNAs como es el caso de los circRNAs y ceRNAs respecto a la acción de los miRNAs. Los diferentes mecanismos se pueden agrupar en tres tipos: remodelación de la cromatina, regulación transcripcional y/o postranscripcional (revisado en Kaikkonen et al., 2011).
Por un lado, diferentes ncRNAs (lncRNAs y piRNAs) pueden regular la transcripción reclutando complejos remodeladores de cromatina, que a su vez median cambios epigenéticos (cambios hereditarios en el fenotipo y la expresión génica causados por mecanismos distintos a los cambios/mutaciones en las secuencias de ADN). Un ejemplo clásico de este modelo es la inactivación del cromosoma X, donde las proteínas del grupo Polycomb (PcG) se unen al ncRNA XIST expresado en el cromosoma X objetivo e inician el silenciamiento epigenético mediante la trimetilación de H3K27. PcG también media la represión transcripcional a través de la interacción con las histonas desacetilasas y ejerce un silenciamiento duradero mediante la metilación de las islas CpG (o CG) a través de la interacción con la ADN metiltransferasa 3 alfa (van der Vlag & Otte, 1999; Viré et al. 2006).
Por otro lado, los ncRNA también pueden reprimir o activar la transcripción de genes. Como ejemplo, el gen DHFR contiene un promotor principal y uno secundario. Los lncRNA generados a partir del promotor menor se unen tanto al promotor principal (formación triple) como al factor de transcripción general IIB, lo que conduce a la disociación del complejo de preiniciación y, por lo tanto, reprime la expresión del gen DHFR (Martianov et al. 2007). Por el contrario, los ncRNA también pueden servir como coactivadores transcripcionales, como lo ilustra el ncRNA poliadenilado de EVF2 de 3,8 kb que forma un complejo con DLX2 y funciona como un activador transcripcional de la expresión de DLX5/6 de una manera específica de potenciador (Feng et al., 2006). ).
Finalmente, los ncRNA también pueden actuar a nivel postranscripción, modulando el empalme, el transporte, la traducción y/o la degradación del ARNm. Aunque los piRNA pueden actuar a nivel postranscripcional, los ncRNA más conocidos que realizan la regulación postranscripcional del mRNA son los siRNA y miRNA. La diferencia entre siRNAs y miRNAs es la región de acción.
Mientras que los siRNA silencian el locus del que derivan, los miRNA pueden actuar de una manera más amplia afectando genes distintos a los de su propio locus. Algunos ncRNA se superponen con (i) el límite exón-intrón, lo que permite un empalme alternativo; (ii) las regiones 5' UTR, CDS y/o 3' UTR, bloqueando la traducción en la iniciación o elongación; y (iii) la región 3' UTR que induce la deadenilación (seguida de la eliminación y degradación del ARNm) o la escisión del ARNm (Wilczynska & Bushell, 2014).
3. ARN no codificantes en circulación.
El complejo programa de desarrollo codificado en el ADN y su regulación a través de la acción de los diferentes ncRNA dentro de cada célula de manera autocrina se distorsiona aún más por el paracrino y posiblemente de manera endocrina (Viereck et al. 2014) cuando se considera el organismo completo. . En este sentido, el descubrimiento de ncRNAs circulantes asociados a exosomas y/o lipoproteínas abrió la posibilidad de una nueva y holística mediación de la regulación génica. Se ha observado un conjunto significativo y diverso de ncRNA fuera de las células, incluso en diferentes fluidos corporales (revisado en Allegra et al. (2012), Silva & Melo (2015) y Viereck & Thum (2017)). Aunque queda por descubrir la consecuencia biológica de los ncRNA liberados en sitios distantes, los patrones de expresión de los ncRNA en los fluidos corporales están altamente correlacionados con estados de enfermedad y otras condiciones fisiológicas en humanos, y recientemente se asociaron con la diferenciación sexual en la planta de la lengua (Cynoglossus semilaevis ) (Sun et al. 2017; ver más abajo).
La resistencia de los ncRNA a las RNasas y a las duras condiciones (p. ej., ebullición, pH extremo, almacenamiento a temperatura ambiente o ciclos de congelación y descongelación), pero también su presencia en fluidos corporales como sangre, suero/plasma, orina y leche materna, hace que ncRNA circulantes adecuados para la evaluación clínica y el seguimiento del estado fisiopatológico del paciente (Viereck y Thum, 2017). En circulación, el transporte de ncRNA implica la encapsulación en vesículas membranosas que incluyen exosomas (30 a 100 nm), microvesículas (100 a 1000 nm) y cuerpos apoptóticos (500 a 2000 nm); asociación a proteínas de unión a ARN, como la nucleofosmina, AGO2 o complejos de lipoproteínas como las lipoproteínas de baja y alta densidad. Dado que el contenido de ncRNA de las vesículas extracelulares puede diferir del de la célula parental, se podría favorecer un mecanismo específico de clasificación y empaquetamiento. El contenido de ncRNA de las vesículas extracelulares puede ser absorbido por las células receptoras, lo que permite la comunicación de célula a célula, que está mediada potencialmente a través de receptores de membrana, la fusión de vesículas con la membrana de las células diana, la endocitosis o permanecer adherido a la membrana plasmática activando receptores específicos. vías de señalización (revisado en Fritz et al. 2016). respectivamente. Curiosamente, los estudios de lncRNAs se centraron en su asociación con la respuesta inmune de los peces contra varios patógenos, en su mayoría realizados por el grupo de investigación del Dr. Gallardo-Escátare de Chile.
Entre los ncRNA que se encuentran en circulación, los miRNA fueron los más estudiados (Allegra et al. 2012) y se han caracterizado casi exclusivamente en especies de mamíferos. Una de las principales ventajas de los miRNAs (así como otros ncRNAS) como mediadores de la comunicación célula-célula, es que su presencia en fluidos corporales y su alta estabilidad pueden representar un recurso infinito de biomarcadores no invasivos, no solo en cáncer y otras enfermedades , pero también en nutrición. Sin embargo, algunos desafíos aún limitan su uso. En general, la posible falta de especificidad de un miARN para una enfermedad o condición fisiológica, así como la estandarización del análisis de miARN circulantes (y otros ncARN) con respecto a la preparación de suero/plasma o la cuantificación de miARN (identificación de 'adecuados' miARN/ARN pequeño de suero de limpieza). Además, se debe prestar especial atención al procedimiento de aislamiento de los ncRNA circulantes, ya que, por ejemplo, gran parte de los miRNA circulantes se originan a partir de células sanguíneas (McDonald et al. 2011) y, por lo tanto, la hemólisis podría enmascarar o proporcionar biomarcadores de ncRNA erróneos. El uso potencial de los ncRNA circulantes en especies de peces acuícolas relevantes necesita más consideraciones para usarlos como nuevos biomarcadores de condición fisiológica. En este sentido, la mayoría de las especies acuícolas no tienen su genoma secuenciado, lo que dificulta la predicción de nuevos ncRNAs pero también la investigación de los procesos biológicos a los que se asocian a través de sus secuencias diana (independientemente de que sean secuencias de ADN y/o ARNm).
Si bien la implementación de tecnologías NGS en la investigación acuícola y la disminución de los precios de este tipo de análisis podrían promover un mayor conocimiento sobre este tema en un futuro cercano, hoy en día un enfoque alternativo y aceptable podría ser mapear los ncRNA aislados con especies estrechamente relacionadas donde el genoma ya se conoce (por ejemplo, salmón del Atlántico, trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss), pez globo japonés (Takifugu rubripes), tilapia (Oreochromis niloticus) y/o pez cebra). Además, el desarrollo de herramientas bioinformáticas más potentes y fáciles de usar también beneficiará el avance en este tema de investigación y, eventualmente, permitirá la implementación de estrategias terapéuticas basadas en la modulación de ncRNA específicos para mejorar el sistema inmunológico, permitir la producción monosexual y /o resolver problemas de maduración sexual en cautiverio.
Sin embargo, para lograr estos objetivos a largo plazo, aún se requieren estudios funcionales en especies modelo como el pez cebra o medaka (Oryzas latipes), donde se dispone de un conjunto diverso de herramientas biotecnológicas.
4. ARN no codificantes en especies de peces de cultivo.
La identificación y caracterización de diferentes ncRNAs en especies de peces se inició desde un punto de vista evolutivo, estudiando los miRNAs siguiendo un enfoque de homología sobre las secuencias genómicas publicadas. Posteriormente, este conocimiento se amplió con la secuenciación del genoma de diferentes especies de peces. Se han realizado algunos trabajos de investigación sobre la caracterización funcional de ncRNAs particulares en especies de peces modelo de investigación (pez cebra y medaka, principalmente). En cambio, solo se realizaron unos pocos estudios de investigación sobre la caracterización de ncRNA particulares en rasgos específicos de peces de cultivo. En este caso, la prioridad obvia para identificar los ncRNA conservados evolutivamente (o no) en especies de peces de acuicultura se tradujo en su descubrimiento aplicando enfoques in silico y/o de secuenciación de ARN (RNA-Seq). En este sentido, en la Tabla 1 se presentan los diferentes estudios realizados en especies de peces de acuicultura y en distintos estadios de desarrollo y/o tejidos mediante tecnologías de alto rendimiento para identificar ncRNAs.
Los trabajos de investigación sobre ncRNAs se realizaron en 9 especies de peces de cultivo de agua dulce, 8 marinas, 2 catádromas y 1 anádromas, que comprenden aproximadamente el 51, 32, 6 y 11 % de los estudios, respectivamente. Las especies de peces más estudiadas son la carpa común (Cyprinus carpio) (5), el salmón del Atlántico (4) y la trucha arco iris (4), en línea con las especies de peces de mayor producción mundial (en Tns y valor; FAO, 2016). Sorprendentemente, una excepción a esto es la cuarta especie de pez más estudiada, el halibut del Atlántico (Hippoglossus hippoglossus), con 3 estudios, todos ellos del Laboratorio del Dr. Babiak (Universidad de Nordland, Noruega), quien es una de las referencias científicas en Investigación de ncRNAs en especies de peces, principalmente en lo que respecta a los miRNAs.
Entre las investigaciones realizadas, el 57 % fue sobre tejidos específicos (siendo el hígado, cerebro, cabeza de riñón y gónadas los más estudiados), el 23 % sobre diferentes estadios de desarrollo larvario, y solo se ha realizado un trabajo en líneas celulares y otro en circulante. ncRNA. En cuanto al tipo específico de ncRNAs estudiados, la investigación sobre miRNAs es la más abundante (comprende casi el 83 % de los estudios de investigación), siendo ampliamente revisada en Bizuayehu y Babiak (2014), y en particular sobre los que se encuentran específicamente en el tejido muscular (conocidos como como myomiRs; revisado en Mennigen (2016)).
Por el contrario, solo un esfuerzo de investigación limitado y muy reciente se ha centrado en los lncRNA y los piRNA, que representan menos del 12 y el 6 %,
*músculo, corazón, cerebro, riñón, hígado, bazo, intestino, branquias y piel; ** corazón, hígado, cerebro, bazo y riñón; *** Bazo, riñón e hígado; ^hígado, branquias, cabeza, riñón, bazo, corazón, cerebro, músculo, estómago, intestinos y piel; ^^ hígado, bazo, riñón, cabeza, riñón, corazón, cerebro, branquias, músculo blanco e intestino; # músculos rápidos y lentos, corazón, ojo, cerebro, intestino, hígado, ovarios y testículos; ## branquias, cabeza, riñón e hígado; ### cerebro, bazo y cabeza de riñón.
El enfoque seguido en todos estos estudios reflejó claramente la actualidad de este tema de investigación. Solo un estudio utilizó la tecnología de secuenciación individual de Sanger, dos se basaron en la predicción a través de la inferencia genómica, mientras que el 90 % restante se realizó utilizando tecnologías de secuenciación de alto rendimiento como las plataformas Solexa, Solide, Roche 454 e Illumina (HiSeq2000, HiSeq2500 y MiSeq). El resultado obtenido (número de ncRNAs identificados) fue muy variable, dependiendo del tejido, órgano y etapa de desarrollo, el tipo de ncRNA estudiado y/o la plataforma de secuenciación utilizada. El número de ncRNA identificados normalmente oscila entre 43 y 31 195, con una sola excepción: la identificación de 862 289 piRNA por Zhou et al. (2016) de las gónadas de tilapia, tejidos conocidos por expresar abundantemente este tipo de sncRNAs.
Finalmente, la expresión de todos estos ncRNAs se asoció con diferentes procesos biológicos: metamorfosis de peces planos, plasticidad térmica, sistema inmunológico, diferenciación sexual, desarrollo y reproducción gonadal, pigmentación, miogénesis, osmorregulación y/o nutrición (extensamente revisado en el caso de los miRNAs en Bizuayehu y Babiak (2014)). En este sentido, como se mencionó anteriormente, dado que diferentes ncRNAs son capaces de regular genes a nivel transcripcional y postranscripcional y existe un intrincado programa genómico que regula la absorción de nutrientes (en el intestino), el metabolismo (en el hígado) y el transporte; Se podría esperar un papel claro de esos ncRNA en la nutrición.
5. ARN no codificantes y nutrición
A pesar de la detección limitada mencionada anteriormente de los ncRNA involucrados en la nutrición y el metabolismo de los peces, los investigadores han aprovechado el conocimiento más amplio y profundo sobre este tema de las especies de mamíferos.
En este sentido, cómo la nutrición materna puede alterar y dar forma al perfil metabólico de la descendencia y/o la función de los órganos a través de alteraciones en los sncRNA, como miRNA, piRNA y tRNA, ha sido un área de investigación intensa (revisado en Loche y Ozané (2016) respecto al caso particular de las enfermedades cardiovasculares). Además, varias evidencias sugirieron que no solo los ncRNA producidos endógenamente podrían regular el metabolismo, sino que también los obtenidos de fuentes dietéticas (alimentos vegetales y leche de vaca) podrían afectarlo al alterar la expresión de genes de miRNA endógenos en especies de mamíferos (revisado recientemente en Cui et al. al., 2017). La encapsulación de miARN en exosomas y partículas similares a exosomas confiere protección contra la degradación del ARN y crea una vía para el transporte endotelial intestinal y vascular por endocitosis, así como su entrega a los tejidos periféricos (ver arriba, sección 3: ARN no codificantes en circulación) . Por lo tanto, los componentes de los alimentos y las preferencias dietéticas pueden modular los perfiles de miARN en suero que finalmente podrían influir en procesos biológicos particulares (Cui et al. 2017). Teniendo en cuenta la relevancia de los trastornos metabólicos humanos hoy en día en nuestra sociedad, se han desarrollado nuevos proyectos y bases de datos, incluida una base de datos de miARN dietéticos que informa sobre miARN en 15 fuentes dietéticas (Cui et al., 2017). Estas bases de datos podrían ser ejemplos de necesidades futuras para estudiar los diversos tipos de ncRNA proporcionados a los peces a partir de las diversas fuentes de nutrientes en los alimentos acuícolas, y principalmente considerando la fuerza impulsora actual en la sostenibilidad de la acuicultura, la sustitución del aceite y la harina de pescado por diferentes fuentes alternativas ( principalmente de origen vegetal). Además, y de manera interesante, Liang et al. (2015) demostraron en ratones la eficacia de los perfiles de expresión de lncRNA para discriminar los tipos de microbios en el intestino (libres de gérmenes, convencionales y/o gnotobióticos). Dado que se sabe que la microbiota intestinal tiene efectos fundamentales en la fisiología, el metabolismo, la nutrición y la inmunidad del huésped, este trabajo proporcionó un recurso inicial de lncRNA asociados con los microbios intestinales para la identificación de biomarcadores de lncRNA en las interacciones entre el huésped y los microbios.
Por lo tanto, la pregunta para los piscicultores y los desarrolladores de alimentos podría ser si este también podría ser el caso de los peces de cultivo.
Tabla 1. Principales trabajos de investigación sobre identificación de ARN no codificantes mediante tecnologías de alto rendimiento realizados en especies de peces de acuicultura.
Por un lado, varios miARN se han asociado con el metabolismo energético en especies de peces a través de análisis comparativos entre especies de mamíferos y teleósteos, a pesar del trabajo limitado realizado con tecnologías de alto rendimiento (RNA-Seq; ver Tabla 1). Para obtener una lista completa de los miARN potenciales implicados en la regulación del metabolismo de los peces, se recomienda encarecidamente a los lectores la revisión reciente de Mennigen (2016).
Algunos ejemplos relevantes de diferentes miARN y las rutas metabólicas relacionadas son los siguientes. Mientras que el miARN-33 en el metabolismo de los lípidos y el miARN-8163 en el metabolismo del hierro se han asociado debido a la presencia de esos miARN en un intrón de los genes SREBP y transferrina, respectivamente; Se demostró funcionalmente que otros miARN estaban relacionados con el metabolismo. En este sentido, se demostró que la inhibición del miARN-122 específico del hígado disminuye la concentración de triglicéridos séricos posprandiales y, por el contrario, causa hiperglucemia posprandial en la trucha arcoíris (Mennigen et al. 2014). Además, la inhibición de miRNA-17 en el pez conejo (Siganus canaliculatus) regula, al menos parcialmente, la biosíntesis del ácido docosahexaenoico (DHA) a partir del ácido docosapentaeónico (DPA) a través de la desaturación Δ4 mediada por la desaturasa de ácidos grasos 2 (FAD2) (Zhang et al. 2014b) . Además, y aunque poco conocido, se ha encontrado que algunos estímulos metabólicos exógenos regulan los miARN metabólicos. De hecho, se ha informado que varios miARN están regulados en condiciones pospandriales y de ayuno, así como por la cantidad de macronutrientes (como los lípidos) incluidos en las dietas. En este sentido, el miRNA-122 de la trucha arcoíris, al mismo tiempo que regula la homeostasis de los lípidos, se encontró que está regulado posprandialmente (Mennigen et al. 2012); Se informó una mayor abundancia de let-7d y miRNA-140-5p en el pez cebra cuando los peces estaban en ayunas (Craig et al. 2014); y los niveles de 12 miARN se alteraron en el hígado de la dorada (Megalobrama amblycephala) cuando se alimentó con una dieta alta en grasas durante un período prolongado, y seis genes relacionados con el metabolismo de los lípidos (fetuina-B, Cyp7a1, NADH deshidrogenasa (ubiquinona) 1 subunidad 2 del subcomplejo beta, 3-oxoácido CoA transferasa 1b, estearoil-CoA desaturasa y ácido graso sintasa) se predijo bioinformáticamente que serían el objetivo de los miARN expresados diferencialmente (Zhang et al. 2014a).
Recientemente, un análisis de los microARN expresados al alimentarse por primera vez con larvas de una especie de pez marino (bacalao del Atlántico, Gadus morhua) proporcionó nuevos conocimientos sobre cómo estos ARNnc podrían mediar los efectos nutricionales en el crecimiento (Bizuayehu et al. 2016). Los miARN expresados en larvas alimentadas con la dieta estándar de oro para especies de peces marinos (zooplancton, en su mayoría copépodos), y que mostraron un mejor rendimiento de crecimiento y desarrollo, se compararon con los encontrados en larvas alimentadas con las presas vivas más utilizadas en acuicultura: rotíferos enriquecidos. y Artemia. Se encontraron ocho miARN diferentes (miR-9, miR-19a, miR-130b, miR-146, miR-181a, miR-192, miR-206 y miR-11240) expresados diferencialmente entre los dos grupos de alimentación en al menos un desarrollo. La etapa de los seis objetivos comparados y predichos de estos miARN se asoció con vías metabólicas, de fototransducción y de señalización. Además, dado que también se ha demostrado que los miARN regulan la expresión génica a través de mecanismos epigenéticos en el promotor del ARNm diana, además de la regulación postranscripcional (John et al. 2004; Sand et al. 2012), estos resultados sugieren cómo primero la alimentación podría afectar el crecimiento y desarrollo de los peces más adelante, en las fases de crecimiento, a través de la programación nutricional. Además, dado que se han proporcionado pruebas sólidas de que los humanos pueden absorber cantidades efectivas de miARN exógenos (de la leche de vaca), las concentraciones fisiológicas de miARN exógenos afectan la expresión génica humana in vivo e in vitro (revisado en Cui et al. (2017)) ; Los efectos sobre el crecimiento y el desarrollo, así como la modulación de los miARN en larvas de bacalao del Atlántico alimentadas con dietas acuícolas regulares o estándar de oro, podrían deberse a esos miARN exógenos proporcionados por presas vivas, cuyos miARN también se caracterizaron (Bizuayehu et al. 2016).
Finalmente, y de manera similar a los lncRNA asociados con microbiota intestinal de ratones (Liang et al. 2015), Nuñez-Acuña et al. (2017) demostraron cómo los perfiles de expresión de los lncRNA intestinales en la trucha arco iris difieren cuando se alimentan durante 30 días con dietas funcionales basadas en prebióticos y probióticos. Por lo tanto, la modulación de los ncRNA a través de las dietas y su papel en el metabolismo de los peces parece haberse conservado evolutivamente, abre nuevos desafíos de investigación para explorar la identificación, caracterización de ncRNA en peces de cultivo, así como su uso como confiable y no invasivo (en el caso de ncRNA circulantes) biomarcadores de la nutrición de los peces, entre otros procesos biológicos relevantes (p. ej., resistencia a patógenos, diferenciación sexual y rendimiento reproductivo).
6. Perspectivas de futuro y conclusiones.
Teniendo en cuenta las diversas evidencias de que los ncRNA desempeñan funciones reguladoras en el desarrollo de los peces y en respuesta a diferentes estímulos ambientales (p. ej., temperatura de cría, infección patógena, osmolaridad del agua y composición nutricional, entre otros), así como otros factores como el sexo y la base genética, se Un objetivo interesante en la piscicultura sería identificar y caracterizar funcionalmente el espectro completo de ncRNA con respecto a las condiciones fisiológicas normales frente a las anormales en las especies producidas más importantes. El desarrollo de tecnologías de secuenciación aún más poderosas y versátiles, y el precio decreciente por muestra secuenciada beneficiaría claramente el progreso en este tema de investigación. En este sentido, RNA-Seq ya se ha aplicado a una amplia gama de problemas en especies de peces (revisado en Li y Li, 2014) y, en comparación con la tecnología de microarrays, RNA-seq ofrece posibilidades casi ilimitadas en el bioanálisis moderno, ya que no está limitado. hacia la cantidad de ARN, la cuantificación de niveles de transcritos y el conocimiento previo sobre secuencias a detectar y/o cuantificar. Los análisis de RNA-seq no solo permiten el nivel de expresión de mRNA, sino también la detección y cuantificación de variantes de empalme y ncRNA en una escala de todo el genoma. El reciente y rápido avance de las tecnologías NGS ya ha hecho que la secuenciación del ADN esté ampliamente disponible, lo que permite la secuenciación de importantes especies de peces de cultivo, como el salmón del Atlántico, la trucha arcoíris o el rodaballo (Scophthalmus maximus) (Berthelot et al. 2014; Lien et al. 2016; Figueras et al. 2016). Por lo tanto, se espera que el número de especies de peces con genoma secuenciado aumente continuamente en los próximos años. Sin embargo, incluso en especies en las que aún no se conoce la secuencia completa del genoma, los ncRNA pueden identificarse a partir de la salida de lectura de RNA-Seq realizando un análisis comparativo con las secuencias conocidas de otras especies depositadas en bases de datos de ncRNA relevantes como miRBase (http:/ /www.mirbase.org/; Kozomara y Griffiths-Jones, 2014), piRBase (http://regulatoryrna.org/database/piRNA/; Zhang et al. 2014c) y/o lncRNAdb (http://www.lncrnadb.org/; Quek et al. 2015), entre otros.
El análisis comparativo es un enfoque poderoso para extraer información funcional o evolutiva de secuencias biológicas (revisado en O'Brien y Fraser, 2005); sin embargo, la baja conservación entre las relaciones miARN-objetivo, especialmente entre peces teleósteos y especies modelo de mamíferos, así como la presencia de miARN específicos de especies, limitan esta información obtenida de este enfoque en ambas direcciones: identificación de ncARN en las especies de interés y confiable la predicción de los ARNm o secuencias de ADN diana, ya que la conservación de secuencias de ADN en regiones no codificantes (p. ej., promotores de genes) no es tan alta, incluso cuando se comparan especies de mamíferos estrechamente relacionadas (Chiba et al., 2008). Otro tema que requiere atención en este tipo de análisis para la predicción del ARNm objetivo es la existencia de diferentes algoritmos para calificar cómo es más probable que ocurra la interacción ncRNAmRNA. Se ha desarrollado un enorme conjunto de software diverso en este sentido (consúltelos en OMICtools; https://omictools.com/; Henry et al. 2014), siendo los más utilizados miRanda, TargetScan, PITA y/o RNAhybrid por ejemplo (Riffo-Campos et al. 2016).
Cuando se tienen en mente estudios cuantitativos para descubrir nuevos ncRNA asociados con una condición fisiológica particular, entre otros factores, se requieren procedimientos de normalización correctos para obtener resultados precisos y confiables. En este sentido, aunque existen protocolos estándar y comerciales sobre procedimientos de aislamiento, tratamiento y secuenciación para disminuir la variabilidad entre muestreos, la normalización mediante la adición de cantidades conocidas de ncRNA añadidos o mediante lecturas totales son los procedimientos más actuales y aceptados en el análisis de preprocesamiento bioinformático. (Tam et al. 2015). Particularmente problemática es la normalización, estandarización y cuantificación del análisis de ncRNAs en circulación. Evitar la contaminación en las preparaciones de plasma y encontrar un ncRNA confiable en el suero son los principales objetivos que se deben perseguir. En cualquier caso, se debe realizar una confirmación adicional y final de los resultados obtenidos del análisis RNA-Seq mediante RT-qPCR. Los investigadores tienen principalmente tres opciones para realizar una cuantificación precisa de los sncRNA: cebadores lineales convencionales, de ácido nucleico bloqueado (LNA) o de bucle de tallo; siendo la tecnología stem-loop la más sensible y precisa mientras que el LNA la más específica (discriminar entre isomiRs; Nolan et al. 2013).
Finalmente, una de las investigaciones más importantes a realizar en los próximos años será sin duda el desarrollo de los estudios funcionales. En este sentido, los experimentos in vivo (utilizando especies modelo como el pez cebra o medaka) y/o in vitro en los que se analicen o eliminen los ncRNA y/o la inhibición, imitación o sobreexpresión particular de los miRNA utilizando miRNA producidos sintéticamente, serán objeto de estudio. necesario para validar la asociación predicha de estos ncRNA con una condición fisiológica particular previamente explorada por RNA-Seq. En este sentido, se puede demostrar empíricamente la metilación del ADN predicha, la remodelación de la cromatina y/o la regulación transcripcional/postranscripcional del ARNm.
En conclusión, recientemente se han obtenido nuevos conocimientos sobre cómo los ncRNA regulan los genes en diferentes niveles y formas aplicando tecnologías NGS en especies de peces de cultivo. Estos conocimientos básicos abren las puertas a nuevas estrategias para resolver viejos problemas de la acuicultura, como el aumento de la resistencia a los agentes patógenos, como el uso de siRNAs y la aplicación para controlar enfermedades virales en la acuicultura (Papic et al. 2015), la programación nutricional temprana por miRNAs exógenos ( Cui et al.2017); y/o como biomarcadores fiables de inmunocompetencia de peces en el caso de lncRNAs (Boltaña et al. 2016; Nuñez-Acuña et al. 2017) o miRNAs para condiciones metabólicas y de diferenciación sexual (miRNAs; Mennigen, 2016; Sun et al. 2017). Además, aunque queda por descubrir la consecuencia biológica de los ncRNA circulantes en sitios distantes, su caracterización en fluidos corporales como el plasma podría ser un enfoque interesante para permitir un método de monitoreo continuo y menos invasivo de la condición de los peces en el futuro cercano.