17ª Parte: Cambio en la Capacidad de Digestión de Proteínas Durante la Ontogenia de Peces Juveniles: Aproximación al Pargo Rosado (Lutjanus guttatus)
Resumen
La acuicultura se enfrenta a un reto en la búsqueda de nuevas fuentes nutricionales alternativas para generar dietas altamente digestibles y rentables para las especies acuícolas. Además, la comprensión de los cambios en la capacidad digestiva en especies de peces con potencial acuícola es de gran importancia, ya que la capacidad de asimilación de diferentes nutrientes puede cambiar durante el desarrollo juvenil de la especie.
Numerosas investigaciones se han centrado en comprender los cambios y adaptaciones del desarrollo y las capacidades del sistema digestivo durante la ontogenia temprana de los peces, minimizando la importancia de los posibles cambios durante la ontogenia juvenil, como detonante del aumento de la eficiencia de engorde en piscicultura.
Así, pocos estudios abordan los cambios digestivos durante la ontogenia de peces juveniles y sus implicaciones en la capacidad de asimilar diferentes fuentes nutricionales, considerando que no debe haber cambios durante esta etapa, que en general representa el período de engorde hasta el tamaño comercial, previo a sus etapas reproductivas.
El presente trabajo trata sobre la importancia de caracterizar los cambios en la capacidad digestiva durante el engorde del pargo moteado
(Lutjanus guttatus). Estudios comparativos de tallas juveniles de la especie (20 a 400 gramos) han demostrado la existencia de cambios en la actividad óptima de la proteasa alcalina, así como una diversificación y aumento en el número de enzimas digestivas de la fase alcalina en relación con la ontogenia juvenil, resultando en cambios del grado de hidrólisis in vitro y liberación total de aminoácidos de diferentes fuentes proteicas.
Palabras clave: proteasas, caracterización enzimática, electroforesis, digestibilidad in vitro, Lutjanidae.
Introducción
Según sus hábitos alimenticios y su morfología digestiva, los peces se clasifican en detritívoros, herbívoros, omnívoros o carnívoros. Independientemente de la clasificación de los hábitos dietéticos, los peces son capaces de modificar su comportamiento digestivo y su metabolismo en respuesta a cambios en las fuentes dietéticas y en la disponibilidad de alimento (Rust, 2002; Pérez-Jiménez et al. 2009). Así, el crecimiento y la eficiencia que provoca la ingestión de un alimento en los peces dependerá de su capacidad fisiológica y bioquímica para digerir y transformar los nutrientes, sin embargo muchos factores bióticos y abióticos pueden influir en el estado fisiológico de los peces y por tanto, en los procesos relacionados con la digestión, absorción y transformación de estos nutrientes (Furnè et al. 2008).
Debido al rápido crecimiento del sector acuícola, así como al surgimiento de nuevas especies con potencial acuícola, actualmente existe un gran número de investigaciones relacionadas con el desarrollo de dietas formuladas con el objetivo de buscar nuevas fuentes de ingredientes de bajo costo y alta digestibilidad. . Durante la búsqueda de ingredientes, es importante comprender la capacidad digestiva de las especies de interés, donde la comprensión del número y tipo de enzimas digestivas, su actividad enzimática, así como la afinidad que presentan a diferentes fuentes nutricionales, será importante para el diseño de nuevas formulaciones que tiendan a generar una industria acuícola sustentable.
De las enzimas digestivas, las proteasas juegan un papel clave en la digestión, lo que se traduce en un alto crecimiento y supervivencia. Las proteasas que se encuentran dentro de los órganos digestivos de los peces son responsables de catalizar la hidrólisis de los enlaces peptídicos (Klomklao, 2008), que incluye enzimas como pepsina, gastricinas, tripsinas, quimotripsinas, colagenasa, elastasa, carboxipeptidasas y carboxilesterasas (Haard, 1994; Simpson , 2000), donde la tripsina, quimotripsina y pepsina son consideradas como las enzimas digestivas más importantes debido a su abundancia y alta actividad proteolítica según estudios en diferentes especies de peces (Castillo-Yáñez et al. 2004, 2005, 2006; Klomklao et al. 2004, 2007).
En peces se ha hecho un gran esfuerzo por comprender los cambios en la capacidad digestiva fisiológica durante la ontogenia temprana de diferentes especies de peces, lo que ha impulsado el desarrollo de la zootecnia en la producción de larvas y juveniles de peces (Kolkovski, 2001; Zambonino-Infante y Cahu , 2001; Lazo et al. 2007; Rønnestad et al. 2007; Álvarez González et al. 2008; Galaviz et al. 2012; Salze et al. 2012; Moguel-Hernández et al. 2013).
La digestibilidad de un nutriente o dieta depende de su composición química, tipo de ingredientes y capacidad digestiva de la especie para descomponer los macronutrientes en micronutrientes para ser absorbidos (Lemos & Tacon 2011). El criterio principal para determinar el valor nutricional de las fuentes de proteína parece ser el coeficiente de digestibilidad aparente (ADC) (Dimes et al. 1994) en el cual, la asimilación total (digestión y absorción) de nutrientes específicos se obtiene mediante la recolección y análisis de heces. Por otro lado, el sistema pH Stat es una herramienta práctica para realizar mediciones in vitro utilizando el grado de hidrólisis (DH%) como criterio, brindando múltiples ventajas tales como: respuesta específica mediante el uso de enzimas de especies estandarizadas, condiciones estables, rapidez, precisión, probar diferentes ingredientes en pequeñas cantidades y apropiados para diferentes fuentes de ingredientes, incluir ingredientes marinos, animales y vegetales (Lemos et al. 2009; Yasumaru & Lemos 2014). Actualmente, existe un gran interés y esfuerzos para la estandarización del método pH Stat en especies de peces (Dimes et al. 1994; El-Mowafi et al. 2000; Tibbetts et al. 2011a, b; Yasumaru & Lemos 2014) y crustáceos (Ezquerra et al. . 1997; Lemos et al. 2000; Lemos et al. 2009; Perera et al. 2010), debido a que la principal limitación de los ensayos de pH-Stat parece ser el conocimiento completo del origen y actividades de las enzimas, dado que, variaciones en especies, peces el tamaño/edad y el fenotipo podrían generar una reproducibilidad deficiente en los ensayos de digestión in vitro (Tibbetts et al. 2011a).
Son pocos los estudios en organismos acuáticos sobre cambios enzimáticos o diversificación durante la ontogenia juvenil o adulta en una misma especie. Los informes en especies como la cucaracha (Rutilus rutilus L.), la gambusia cubana (Gambusia punctata), la anguila japonesa (Anguilla japonica) y la tilapia (Oreochromis niloticus L.) mostraron que las actividades proteolíticas y los zimógenos pueden diferir durante las etapas de juveniles/adultos en el mismo (Chiu & Pan 2002; Kuzʼmina 1996; Falcón-Hidalgo et al. 2011; Unajak et al. 2012).
Existen algunos ejemplos consistentes sobre las ventajas relacionadas con la presencia de algunas isoenzimas digestivas en organismos acuáticos, donde la ostra (Crassostrea gigas) presenta un polimorfismo genético en dos genes de alfa-amilasa (AMYA y AMYB), que están relacionados con el crecimiento (Prudence et al. 2006). La langosta espinosa (Panulirus argus) presenta variación genética en el patrón digestivo de tripsina (tres fenotipos; A, B y C), que generan diferencias in vitro en la eficiencia de la digestión sobre diferentes fuentes de proteína (Perera et al. 2010, 2015).
En este sentido, el salmón del Atlántico (Salmo salar) es el pez más estudiado, donde los peces que poseen cierto fenotipo de tripsina (TRP-2*92), muestran una mejor tasa de crecimiento y/o eficiencia de conversión alimenticia, relacionada con la capacidad de digestión de proteínas (Bassompierre et al. 1998; Rungruangsak-Torrissen et al. 1998; Torrissen et al. 1987; Torrissen 1991).
Por lo tanto, se requiere la comprensión de los aspectos fisiológicos digestivos que afectan directamente la eficiencia alimenticia y el crecimiento de las especies objetivo. La especie estudiada es el pargo moteado (Lutjanus guttatus), que forma parte de la familia Lutjanidae, compuesta por peces depredadores con hábitos alimenticios variables, donde todos son carnívoros, alimentándose principalmente de peces y crustáceos bentónicos (Allen 1987; Vázquez et al. 2008). En la especie ya se han realizado grandes esfuerzos en la búsqueda de fuentes alternativas de proteínas para la fabricación de alimentos en la etapa juvenil, con el fin de reducir la dependencia de la harina de pescado, sin embargo estudios se centran en las diferencias en la capacidad de digestión durante la ontogenia juvenil. Por lo tanto, el objetivo del presente trabajo fue caracterizar las proteasas digestivas de forma comparativa durante la ontogenia juvenil del pargo manchado y determinar las posibles diferencias en la capacidad digestiva de proteínas mediante técnicas in vitro.
Material y métodos
Animales de experimentación
Los peces para este estudio se obtuvieron del Laboratorio de Reproducción y Criadero de Peces Marinos (CIAD), Sinaloa, México, donde todos los estadios juveniles se obtuvieron de un solo lote de desove, realizado según lo descrito por Álvarez-Lajonchère et al. (2012). Después de un cultivo de larvas por lotes, todos los peces juveniles continuaron bajo un proceso de cultivo normal (paso de vivero) y engorde, hasta que se recolectaron en diferentes momentos de un ciclo. Según su peso húmedo, los peces se clasificaron en tres grupos (todos considerados en la etapa juvenil): juvenil temprano (EJ; 21,3±2,6 g; 3 meses después del criadero, MAH), juvenil medio (MJ; 190±4,4 g; 7 MAH) y juvenil tardío (LJ; 400±11,5 g; 12 MAH). Los peces se adaptaron a la dieta de control reportada por Silva-Carrillo et al. (2012). Los peces fueron privados de alimento durante 24 horas para asegurar el vaciado del intestino, sacrificados éticamente mediante un solo pinchazo en la cabeza con bisturí e inmediatamente disecados para extraer el tracto digestivo.
Disección y preparación de extractos.
El tracto digestivo de cada pez se dividió individualmente en cinco segmentos: estómago (ST), ciego pilórico (PC) e intestino en tres secciones (proximal (PI), medio (MI) e intestino distal (DI). Todos los procedimientos se realizaron a temperaturas de 0-4 °C. Todos los segmentos se congelaron individualmente a -64 °C hasta que se realizó el ensayo. Antes del análisis, el segmento se diluyó en una proporción de 1:10 (peso húmedo: volumen) en un fisiológico solución salina (NaCl 9g L⁻¹) y se homogeneizó en hielo con un homogeneizador Ultra-Turrax, los homogeneizados se centrifugaron (8500 × g) a 4 °C durante 15 min y el sobrenadante se utilizó para realizar ensayos de actividad enzimática (Matus -de-la-parra et al. 2007).
Ensayo de actividad enzimática
La actividad de la proteasa ácida total o de tipo pepsina se midió mediante un método modificado de Sarath et al. (1989), con hemoglobina desnaturalizada (2 % pH 2) como sustrato. La actividad de la proteasa alcalina se estimó por el método de Walter (1984) utilizando caseína como sustrato. La actividad de tripsina se determinó por el método modificado de Erlanger et al. (1961), utilizando clorhidrato de Nα-benzoil-larginina-4-p-nitroanilida (BAPNA 1 mmol L⁻¹) como sustrato. El contenido de proteínas de la solución sobrenadante se determinó mediante el ensayo de Bradford (1976) utilizando albúmina de suero bovino como estándar. Una unidad (U) de actividad enzimática se definió como la cantidad de enzima que produce 1 μg de producto liberado por minuto. La cantidad de tirosina liberada de la hidrólisis de hemoglobina y caseína se determinó a 280 nm, mientras que la cantidad de p-nitroanilina liberada de BAPNA se determinó a 410 nm.
1) Actividad total (Unidades ml⁻¹) = [Δabs*volumen final de reacción (ml)]/[MEC*tiempo (min)*volumen de extracto (ml)]
2) Actividad específica (Unidades mg prot-1) = Actividad total/proteína soluble (mg) Δabs representa el aumento de absorbancia, y MEC representa el coeficiente de extinción molar de tirosina o p-nitroanilina (0,005 y 0,008 mL/μg/cm, respectivamente).
Caracterización de enzimas digestivas
La proteasa alcalina total similar a la pepsina y la tripsina se caracterizaron determinando la actividad relativa (%) en función del pH y la temperatura. El efecto de la temperatura para la pepsina se midió de 10 a 50 °C; La proteasa alcalina y la tripsina se midieron de 10 a 60 °C, con condiciones de ensayo similares a las descritas anteriormente. El efecto del pH sobre la actividad digestiva se midió a 37 °C, y los tampones estaban en un rango de pH de 1 a 10 usando tampones como se describió anteriormente por Matus-de-la-Parra et al. (2007).
Además, se realizaron caracterizaciones de proteasas ácidas y alcalinas según Guerrero-Zárate et al. (2014) utilizando inhibidores específicos. Se utilizó pepstatina A (1 mmol L⁻¹) como inhibidor de las proteasas ácidas del estómago y la inhibición de la actividad de la proteasa alcalina en ciegos pilóricos y cortes de intestino se realizó con los siguientes inhibidores: 250 mmol L⁻¹ inhibidor de tripsina de soja (SBT1), 10 mol L⁻¹ N-tosil-L-fenilclorometilcetona (TPCK), 100 mmol L⁻¹ fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 10 mmol L⁻¹ Clorhidrato de Nα-tosil-L-lisina cloromicetina (TLCK), 10 mmol L⁻¹ 1,10-Fenantrolina (Phen) y 250 mmol L⁻¹ Tipo II-Ovomucoide de huevo de pavo (Ovo).
Análisis químico
Los niveles de humedad, proteínas, lípidos y cenizas en los ingredientes de prueba se determinaron usando métodos estándar AOAC (2000). Las muestras fueron homogeneizadas y secadas a 105 °C por 24 horas antes de los análisis químicos. El nivel de proteína cruda se determinó usando el método micro-Kjeldahl por Labcocnco System (Labconco, Kansas City, MO). El contenido de lípidos se analizó utilizando un sistema automático micro Foss Soxtec Avanti 2050 (Foss Soxtec, Hoganeas, Suecia) después de la extracción con éter de petróleo y el contenido de cenizas se determinó por calcinación de las muestras en un horno de mufla a 550 °C (Fisher Scientific International, Inc. Pittsburgh, Pensilvania, EE. UU.). La NFE se determinó por la diferencia entre las sumas de todos los nutrientes.
Ensayo de actividad enzimática
Grado de hidrólisis in vitro (DH)
La digestibilidad de 13 fuentes de proteínas diferentes se evaluó mediante el sistema pH-Stat in vitro Tritando Meltrohm 901, donde la lista de ingredientes utilizados se resume en la Tabla 1. Los ensayos de hidrólisis in vitro se realizaron con extractos crudos de estómago (St) o ciego-intestino pilórico ( PC-I) solo en estadios juveniles tempranos y tardíos. Para determinar el grado de hidrólisis (DH) de la proteína, se incorporó cada fuente de proteína en una concentración de 8 mg ml⁻¹ para ser utilizada como solución sustrato, según Saunders et al. (1972) y modificado por Dimes & Haard (1994). Para ambos estadios juveniles, los extractos de St se ajustaron para ser agregados en solución de sustrato a 193 U mL⁻¹ e iniciar la hidrólisis ácida a pH 3.0 en agitación continua durante 15 min (900 s) a 37 °C. El ácido clorhídrico (HCl 0,1 N) gastado para mantener constante el pH 3,0, se registró cada 100 segundos. El grado de hidrólisis alcalina se realizó agregando extractos del pool de PC-I. Como se describió anteriormente, los extractos de PC-I se ajustaron para agregarse en la solución de sustrato a 23 U mL⁻¹ e iniciar la hidrólisis alcalina a pH 8.0 en agitación continua durante 45 min (2700 s) a 37 °C. El hidróxido de sodio (NaOH 0,1 N) gastado para mantener un pH constante de 8,0 se registró cada 250 segundos. Todos los ensayos se realizaron por triplicado y el procedimiento se realizó para ambos estadios juveniles bajo los mismos parámetros. El DH se calculó utilizando el algoritmo según Adler-Nissen (1986).
Durante la reacción de hidrólisis de pH-Stat, se recolectaron muestras de reacciones de mezcla (40 μl) cada 100 para la reacción de hidrólisis ácida y cada 250 para la reacción de hidrólisis alcalina para realizar el análisis de cuantificación de aminoácidos.
Liberación total de aminoácidos (TAAR)
El análisis de aminoácidos totales (AA) liberados se realizó de acuerdo con Church et al. (1893). Se preparó una solución de o-ftaldialdehído (OPA) con 50 ml de tetraborato de sodio 100 mmol l⁻¹, 5 ml de SDS al 20%, 80 mg de OPA diluidos en 1 ml de metanol y 0,2 ml de β-mercaptoetanol, la solución se mezcló y se lleva a 100 ml con agua destilada. Brevemente, 20 μl de las muestras recolectadas en reacciones de mezcla de digestión se fijaron en 20 μl de TCA al 12% y se centrifugaron a 14000 rpm durante 15 min. Se añadieron muestras de sobrenadante de 10 μl a 1 ml de solución de OPA y se leyeron las absorbancias a 340 nm. El TAAR se calculó utilizando la curva estándar realizada con decretos de concentraciones de L-leucina.
Análisis de zimograma
Las técnicas de electroforesis se realizaron en Mini PROTEAN 3 Cell (Bio-Rad) con cuatro placas de geles verticales de 8x10x0,075 cm con capacidad para 10 muestras por placa. Para el análisis de las proteasas ácidas del estómago se realizó electroforesis en condiciones nativas no desnaturalizantes (Native-PAGE) compuestas por gel continuo de acrilamida (10 %) en tampón Tris (25 mmol l⁻¹) y glicina (192 mmol l⁻¹, pH 8,3, 80 voltios) según Davis (1964).
Tabla 1. Composición de nutrientes de las fuentes de proteínas utilizadas en los ensayos
ªCaseína calidad Hammarsten, Research Organics # Catálogo 1082C, ᵇEritrocitos bovinos US Biological # Catálogo H1850, Se obtuvo harina de pescado de primera calidad de Selecta de Guaymas, S.A. de C.V. Guaymas, Sonora, México, ᵈMaz Industrial, S.A de C.V. Mazatlán, Sinaloa, México, ᵉPROAQUA, S.A. De C.V. Mazatlán, Sinaloa, México, ᶠProteínas marinas y agropecuarias S.A. de C.V., Guadalajara, Jalisco, ᵍDroguería Cosmopolita, S.A. de C.V. México, D.F., México, ʰDieta fabricada en CIAD para la alimentación del pargo como dieta de referencia.
La placa se compuso apilando gel con poliacrilamida (PAA) al 4 % y gel de resolución con PAA al 10 %. La electroforesis se realizó en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE), con SDS 0.1 % en buffer Tris (25 mmol l⁻¹) y glicina (192 mmol l⁻¹, pH 8.3, 100 volts), según Laemmli (1970) y adaptada por García-Carreño et al. (1993).
Después de la electroforesis Native-PAGE, los geles fueron tratados para revelar isoformas de proteasas según el procedimiento de Díaz-López et al. (1998). El gel se sumergió durante 90 min a 25 °C en una solución que contenía hemoglobina al 0,25 % (tampón Glicina-HCl 0,1 mol l⁻¹, pH 2,0). Los geles se fijaron en solución de ácido tricloroacético (12%) por 15 minutos.
Después de la electroforesis SDS-PAGE alcalina, los geles se lavaron y se incubaron directamente durante 30 min a 5 °C en una solución de caseína al 0,5 % (tampón Tris-HCl 0,1 mol l⁻¹, pH 9). Luego, los geles se incubaron durante 90 min en la misma solución a 37 °C. Finalmente, los geles fueron lavados y fijados como se describió anteriormente. Para geles ácidos y alcalinos, después de que se desarrollaron áreas de actividad enzimática, los geles se tiñeron de acuerdo con Weber y Osborn (1969), utilizando una solución de azul brillante de Coomassie R-250 al 0,1%. Las técnicas electroforéticas se complementaron con el uso de inhibidores específicos descritos anteriormente. Se aplicó un marcador de peso molecular a cada SDS-PAGE. El peso molecular (MW) de cada banda en los zimogramas SDS (proteasa alcalina) se calculó mediante un modelo ajustado linealmente entre el Rf y el logaritmo decimal de los marcadores proteicos de PM.
Análisis estadístico
A modo de comparación, el porcentaje de inhibición y el porcentaje de actividad relativa en la caracterización enzimática y el grado de hidrólisis de pH-Stat se transformaron con arcseno (x1/2). Los datos de cada parámetro se sometieron a pruebas de normalidad y homocedasticidad. Se realizaron análisis ANOVA de una o dos vías cuando fue necesario. Cuando se encontraron diferencias se utilizó la prueba HSD de Tukey (P≤0.05). Se graficó el total de aminoácidos liberados (mg de equivalente de L-leucina), describiendo la relación entre la liberación acumulativa de aminoácidos y el tiempo de digestión para diferentes comidas con ajuste lineal (y = a + bx). Las diferencias entre la tasa de digestión (pendientes) entre las fuentes de proteína en la fase de hidrólisis específica y la etapa juvenil se evaluaron con ANCOVA (P≤0.05) (Zar 1984). Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software Statistica 7.0 para Windows (StatSoft, EE. UU.).
Resultados
Ensayos de actividad enzimática
Las actividades de proteasas ácidas y alcalinas de diferentes secciones del tracto digestivo en tres etapas juveniles se presentan en la Tabla 2.
Tabla 2. Actividad de la proteasa en el estómago (S), ciego pilórico (PC), intestino proximal (PI), medio (MI) y distal (DI) en tres estadios juveniles de pargo manchado Lutjanus guttatus.
La actividad proteolítica del ácido estomacal mostró un valor significativamente mayor de actividades específicas (P≤0.001) con el aumento de la etapa de vida. No se observaron diferencias significativas en la actividad específica de las proteasas alcalinas entre los ciegos pilóricos y las secciones de intestino para todas las etapas juveniles (P≤0.001). Mientras tanto, se encontraron actividades específicas significativamente más altas en la etapa LJ (P≤0.001) entre las etapas cuando se compararon las secciones individuales.
La actividad específica tipo tripsina mostró un valor significativamente mayor (P≤0.001) en la etapa EJ que en las etapas MJ y LJ (Tabla 3).
Efecto de la temperatura y el pH sobre la actividad de las proteasas ácidas y alcalinas
Los tres estadios juveniles presentaron temperatura óptima de proteasas ácidas a 45°C (Fig. 1A) (P≤0.001). La temperatura óptima de las proteasas alcalinas totales fue de 55°C para EJ, 50°C para MJ y LJ (Fig. 1B) (P≤0.001).
La actividad óptima de las proteasas ácidas se midió a pH 3 para EJ y LJ y a pH 2 para MJ, con 80 a 90 % de actividad remanente a pH 2 y 3, respectivamente (Fig. 1C) (P≤0.001). La actividad de la proteasa alcalina mostró una actividad relativa alta (%) en un amplio rango de pH (5-10) y un óptimo a pH 9,0 en los tres estadios juveniles (Fig. 1D) (P≤0,001).
Tabla 3. Actividad similar a la tripsina en los ciegos pilóricos en tres estadios juveniles del pargo lucio manchado Lutjanus guttatus. Los diferentes superíndices dentro de las filas indican diferencias significativas (P <0.05).
Figura 1. Efectos de la temperatura (°C) sobre la actividad relativa de las proteasas ácidas (a) y alcalinas (b) y efectos del pH sobre la actividad relativa de las proteasas ácidas (c) y alcalinas (d) en tres estadios juveniles de Lutjanus guttatus.
Se encontraron diferencias en el porcentaje de actividad relativa a pH 5 entre LJ (80%) y EJ, MJ (50%) (P≤0.001).
Efecto de la temperatura y el pH sobre la actividad de la tripsina
La temperatura óptima de tripsina fue de 50 °C para MJ y LJ, mientras que EJ presentó un óptimo de 60 °C. Se encontraron diferencias en la actividad relativa (%) entre casi
Se encontraron diferencias en la actividad relativa (%) entre casi todas las temperaturas probadas (P≤0.001) (Fig. 2B). La actividad de tripsina mostró una actividad óptima a pH 9 para todas las etapas juveniles (Fig. 2B).
Figura 2. Efectos de la temperatura y el pH sobre las actividades similares a la tripsina relativas en tres estadios juveniles de Lutjanus guttatus.
Efectos de inhibidores específicos
La pepstatina A inhibió las actividades totales en extractos de estómago en todas las etapas juveniles.
El porcentaje de inhibición de la proteasa alcalina se resume en la Tabla 4. En general, el porcentaje de actividad inhibida en las proteasas alcalinas totales fue significativamente mayor (P≤0.001) en EJ usando TLCK, PMSF, SBTI, Phen y Ovo en comparación con MJ y LJ. mientras que no se encontraron diferencias significativas entre el porcentaje de inhibición con TPCK (P=0.2402).
Tabla 4. Porcentaje de inhibición de la actividad en ciegos pilóricos después de la incubación con inhibidores específicos de enzimas en tres estadios juveniles de pargo manchado Lutjanus guttatu guttatu
Grado de hidrólisis in vitro (DH)
La hemoglobina presentó la DH más alta entre todos los ingredientes en digestión ácida para ambos estadios juveniles (P≤0.05). Los valores más altos de DH difieren en la fuente de proteína entre las etapas juveniles, donde SBM (harina de soya), CM (pasta de canola) y D-control (dieta de control) mostraron los valores más altos de DH en la digestión ácida de LJ, mientras que TM (harina de
subproductos de atún), SBM y D-control mostraron los valores más altos de DH en la digestión ácida de EJ. Por otro lado, los valores de DH de TM, SM (harina de calamar) y CM mostraron diferencias entre los estadios EJ y LJ en la hidrólisis ácida (P≤0.05) (Fig. 3A).
La hidrólisis alcalina mostró que FM (harina de pescado) presentó el mayor grado de hidrólisis entre todos los ingredientes en la etapa LJ, mientras que MBM (harina de carne y bovino), WGM (harina de gluten de trigo), CGM (harina de gluten de maíz) y D-control presentaron el mayor grado. DH entre todos los ingredientes en etapa EJ (P≤0.05). Ocho de los ingredientes probados mostraron diferencias en DH entre las etapas EJ y LJ en hidrólisis alcalina, incluidas fuentes de proteína animal (FM, MPM (harina de carne porcina), MBM, PM (harina de subproductos de aves)) y fuentes de proteína vegetal (WGM, CGM, CM) y D-control, como mezcla proteica de la dieta balanceada (P≤0.05) (Fig. 3B).
Figura 3. Grado de hidrólisis de proteínas (DH) de pH-stat in vitro de los ingredientes del alimento utilizando extractos de enzimas digestivas de L. guttatus temprano (20 g) y juveniles tardíos (400 g) de A) estómago y B) ciego pilórico. Las minúsculas muestran diferencias en la etapa EJ, las mayúsculas muestran diferencias en la etapa LJ y el asterisco muestra diferencias entre etapas juveniles (P <0.05). Los valores mostrados son medias (n=3) ± desviación estándar (barras de error).
Liberación total de aminoácidos (TAAR)
La cinética de TAAR se evaluó analizando la producción acumulada de aminoácidos a lo largo del tiempo de digestión. Estas relaciones se describieron mejor mediante regresiones lineales, todas ellas con coeficientes de determinación elevados (R2=0,90 a 0,98). ANCOVA comparó la tasa de liberación de aminoácidos y mostró diferencias significativas entre los ingredientes en la hidrólisis ácida y alcalina en ambas etapas juveniles (P≤0.05).
Para ambos estadios juveniles, la hemoglobina presentó el TAAR más alto. Sin embargo, el TAAR más alto con extractos de estómago en etapa EJ fue obtenido por SM, seguido de CM, SBM y KM (harina de krill), mientras que TM mostró el TAAR más bajo (P≤0.05) (Fig. 4A).
Figura 4. Cinética de aminoácidos libres liberados de los ingredientes que utilizan extractos de enzimas estomacales de L. guttatus a) juveniles tempranos (20 g) yb) juveniles tardíos (400 g). Los puntos de datos y las líneas de regresión de los valores acumulativos contra el tiempo para cada comida se representan con el mismo símbolo. Las letras a la derecha de las líneas de regresión indican diferencias (P≤0.05) entre pendientes.
La hidrólisis alcalina en etapa EJ mostró mayor TAAR por PM, seguida de Cas (caseína), MPM y TM, mientras que SBM y CGM mostraron la menor TAAR (P≤0.05) (Fig. 5A). La hidrólisis alcalina en la etapa LJ mostró mayor TAAR en MPM, seguida de FM, mientras que Cas y SBM mostraron los valores más bajos de TAAR (P≤0.05) (Fig. 5B).
Figura 5. Cinética de los aminoácidos libres liberados de los ingredientes que utilizan extractos de enzimas pilóricas del ciego-intestino de L. guttatus a) juveniles tempranos (20 g) yb) juveniles tardíos (400 g). Los puntos de datos y las líneas de regresión de los valores acumulativos contra el tiempo para cada comida se representan con el mismo símbolo. Las letras a la derecha de las líneas de regresión indican diferencias (P≤0.05) entre pendientes.
Análisis de zimograma
La electroforesis en condiciones de Native-PAGE, revela dos bandas con actividad de proteasa ácida en ambos estadios juveniles de SRS: una con un Rf de 0,72 y la otra con un Rf de 0,77, donde ambas bandas fueron completamente inhibidas por la pepstatina A (Fig. 6).
La electroforesis bajo condiciones SDS-PAGE mostró el mismo patrón de bandas en las secciones de intestino y ciego pilórico, por lo tanto, los resultados corresponden a todo el tracto digestivo de fase alcalina en L. guttatus en una etapa juvenil dada. Se observaron un total de nueve bandas en los extractos de PC-I entre las bandas de las etapas EJ y LJ (Fig. 7A y Fig. 7B, respectivamente; 98,1, 90,2, 87,3, 71,4, 53,1, 40,6, 26,1, 19,8 y 16,7 kDa), referenciadas como bandas primera a novena. En el caso del patrón de enzimas alcalinas en etapa EJ, se observaron cinco bandas en el control (98.1, 87.3, 53.1, 40.6 y 19.8 kDa, representando, primera, tercera, quinta, sexta y ocho bandas) (Fig. 7A).
Se observaron cuatro bandas adicionales en los extractos PC-I de la etapa LJ, con PM de 90,2, 71,4, 26,1 y 16,7 (que representan las bandas segunda, cuarta, séptima y novena) con un total de nueve bandas (Fig. 7B).
Figura 7. Zimogramas de proteasas alcalinas de extractos multienzimáticos de intestino y ciego pilórico de A) Juvenil temprano de L. guttatus (20 g) y B) Juvenil tardío de L. guttatus (400 g), con la acción de los respectivos inhibidores sobre las isoformas. M: marcador de peso molecular (kDa).
Figura 6. Zimograma de proteasas ácidas de los extractos estomacales multienzimáticos de estadios juveniles tempranos (EJ; 20g) y juveniles tardíos (LJ; 400g) de L. guttatus, con la acción del inhibidor de pepstatina A (PI) sobre las isoformas.
Discusión
Aunque hay muchas investigaciones en la caracterización de enzimas digestivas en
diferentes especies de peces, gran parte de esta investigación se ha centrado en la ontogenia temprana y/o caracterización en un tamaño juvenil de esta especie.
Durante la ontogenia temprana de muchas especies de peces, se producen sucesivos cambios en la actividad y/o expresión de diferentes enzimas junto con un rápido desarrollo del sistema digestivo y órganos auxiliares (Zambonino-Infante & Cahu, 2001), lo que ayuda a cerrar ciclos de cultivo de especies con potencial acuícola.
Por otra parte, la caracterización de las enzimas digestivas que se ha realizado durante los estadios juveniles, da por sentado que el número, tipo y/o actividad de las enzimas digestivas no cambia a lo largo del estadio juvenil, donde algunos estudios han abordado este tema en algunas especies (Unajak et al. 2012, Yasumaru & Lemos, 2014).
La presencia de cambios en la capacidad digestiva durante las etapas juveniles de diferentes especies es de gran importancia, ya que estas etapas de la vida corresponden en la mayoría de las especies acuícolas a la fase de cultivo antes de la cosecha. Por lo tanto, el conocimiento de los cambios y/o adaptaciones digestivas servirá de base para la formulación de dietas específicas para etapas de crecimiento de juveniles, con el fin de incrementar el rendimiento productivo.
Así, la presente investigación sirve de base para el desarrollo de investigaciones en diferentes especies con potencial de cultivo, donde se pone de manifiesto la existencia de modificaciones en la capacidad digestiva de proteínas en una misma especie durante el desarrollo juvenil.
Conclusión
En conclusión, el sistema digestivo del pargo manchado es altamente eficiente en la descomposición de las proteínas. Las altas actividades de pepsina y la presencia de dos isoformas de pepsina sugieren el potencial para la hidrólisis de una amplia gama de fuentes de proteínas unidas a la digestión alcalina final. Este potencial aumenta con el crecimiento de los peces a través de etapas juveniles en las que existe una diversificación en el tipo de enzimas alcalinas, afectando el grado de hidrólisis de diferentes fuentes de proteínas y la tasa y grado de absorción de aminoácidos libres totales. Se documentaron valores más altos de DH y TAAR en constituyentes como la harina de pescado y calamar, la harina animal porcina y la harina de aves producidas a partir de subproductos reciclados y la harina de soya y la pasta de canola como productos vegetales que brindan mejores fuentes de proteínas para su uso en el desarrollo de dietas prácticas. .