V. Técnicas de hipofisación
La técnica de inyectar extractos pituitarios a partir de un donador a un receptor para inducir la ovulación, es conocida como "hipofisación", y fue aplicada con éxito por primera vez en 1934 por Von Ihering y sus colaboradores en Brasil (Von Ihering, 1937). Esta técnica ha experimentado un notable refinamiento y sofisticación, hasta el punto de haber utilizado con diversos grados de éxito, gonadotropinas homólogas purificadas, hormonas liberadoras hipotalámicas, hormonas de mamíferos, hormonas esteroidales que indirectamente estimulan el eje hipotálamo-hipófisis, substancias "extrabiológicas" como las antiestrogénicas, Citrato de Clomifeno y Tamoxifen, los nucleótidos cíclicos (db AMP y db GMP) y sus derivados (Harvey y Hoar 1980 y Rosa-do, 1983).
En lo que respecta al uso y la aplicación de extractos pituitarios de peces para inducir la ovulación, los antecedentes indican que el papel que desempeña la glándula pituitaria sobre el ciclo reproductivo ha sido revisado ampliamente por Atz (1957),
Atz y Pickford (1959), Schreck y Scanlon (1977), y las técnicas de colecta, preservación y almacenaje de las pituitarias han sido descritas por Chaudhuri (1976),
Yamazaki (1976), y Chondor (1980), entre otros. Diversos estudios para evaluar el potencial de la gonadotropina de las pituitarias han sido publicados por Clements y Sneed (1962), quienes demostraron que no existen diferencias en la actividad de las pituitarias colectadas a lo largo del año.
Aún cuando muchos esfuerzos han sido enfocados a descubrir y producir hormonas gonadotropinas sintéticas que puedan reemplazar a las pituitarias, en muchos países todavía se usan para propósitos de piscicultura, particularmente en China, India, Europa Central, América e Israel, entre otros, y tal vez sigue siendo la alternativa más viable por razones de tipo técnico y económico.
Los inconvenientes del uso de extractos pituitarios son fundamental-mente el aprovisionamiento de las glándulas y su dosificación, independientemente de que hay que tomar en cuenta la edad del donador, el sexo, el estado de madurez y las técnicas de extracción y preservación (Jalabert et al., 1977 y Rothbard, 1981).
Además, su actividad específica está en entredicho, ya que el extracto pituitario contiene numerosas hormonas, no relacionadas con la reproducción y cuyos efectos no son previsibles y que pueden alterar con el tiempo la fisiología del organismo (Lam, 1982).
En la última década, se han hecho innovaciones de las técnicas de hipofisación utilizando extractos pituitarios, las que se encuentran detalladas en los trabajos de Chaudhuri (1976), Yamazaki (1976), Rothbard (1981) y Woynarovich y Hovarth (1980).
5.1 Adquisición de las glándulas pituitarias
Los extractos pituitarios liofilizados pueden ser adquiridos en casas comerciales en donde este producto es vendido a precios relativamente elevados, aunque en los últimos años se han establecido bancos de hipófisis, como los formados por el Instituto de Investigaciones de Pesca Costera de la India y el Programa de Coordinación y Desarrollo de la Acuacultura FAO/PNUD. En nuestro país, es posible conseguir estos extractos a partir de organismos donadores, como es el caso de la carpa común Cyprinus carpió, que es capturada en grandes volúmenes, pero en últimas fechas se han incrementado sus costos y por lo tanto deben buscarse otras alternativas más baratas.
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a) Las carpas son sexuadas, pesadas y medidas antes de realizar el sacrificio.
b) Se les corta la cabeza a la altura del opérculo branquial, separando la del resto del cuerpo.
c) Se coloca la cabeza en una base de madera y se realiza otro corte de tangencia] a la altura de los ojos.
d) Se localiza la glándula y se extrae por medio de unas pinzas.
e) Inmediatamente, se limpia la glándula del exceso de tejido y se sumerge después en un primer baño con acetona y se deja por un periodo de 10 a 11 horas, pasado este tiempo se elimina la acetona y se reemplaza por nueva, dejando la glándula en esta solución de 10 a 12 horas más.
f) Finalmente, las glándulas se colocan en un desecador o en un envase de vidrio, donde se mantienen hasta su uso y aplicación.
Existen otras formas para preservar las glándulas pituitarias, como es la técnica brasileña, que sugiere incluir la glándula en alcohol absoluto, durante 24 horas. Después de ese tiempo, se cambia el alcohol y se mantiene en esas condiciones por otras 24 horas.
Se sacan del alcohol y se guardan en pequeños recipientes de vidrio, los que contienen una etiqueta que señala la fecha de colecta, la cantidad de pituitaria almacenada, el peso del organismo donador y su sexo (Rothbard, 1981).
Algunos autores sugieren que la glándula pituitaria sea mantenida en refrigeración hasta su uso, ya que de esta forma se mantiene la potencia de las hormonas gonadotropinas, la que tiende a perderse cuando se tiene a temperatura del medio ambiente.
5.2 Técnicas de inducción a la ovulación, utilizadas en el centro ciprinico de la ciudad de Tezontepec de Aldama, HGO.
En los últimos diez arios, las distintas técnicas utilizadas en este Centro para inducir la ovulación de las diferentes especies de carpas, han sufrido una serie de cambios y adaptaciones, que permiten un manejo adecuado de los reproductores, las dosis y los tiempos de aplicación, que en su última época fueron desarrolladas por las investigaciones pioneras de Juárez y Palomo (1980). Esto sin duda se ha reflejado en una elevada producción de alevines y crías de las diferentes especies de ciprínidos asiáticos, que tan solo en 1983 superó la cifra de 20 millones en total y para 1985 se programa lograr 45 millones.
Las especies que se vienen manejando en este Centro son:
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Carpa espejo, Cyprinus carpio specularis
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Carpa barrigona, Cyprinus carpio rubrofruscus
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Carpa brema, Megalobrama amblycephala
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Carpa herbívora, Ctenopharyngodon idellus
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Carpa plateada, Hypophtalmichthys molitrix
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Carpa cabezona, Aristichthys nobilis
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Que de acuerdo con el tipo de huevo que producen se dividen en dos grupos: las tres primeras tienen huevos adherentes que se fijan a un sus-trato preferentemente herbáceo y las tres últimas con huevos no adherentes o pelágicos. A partir de este criterio, se manejan las distintas técnicas de hipofización, iniciándose en una serie de actividades comunes, pero que en detalle presentan algunas variantes.
5.2.1 Especies que tienen huevos adherentes
Para las tres carpas de este grupo se sigue una serie de actividades previas a la inyección del extracto, tal como se indica en la figura 1.
a) Técnica de la cama con rama de casuarina.
Una vez seleccionados los reproductores, se aplican las dosis a los machos y hembras: para las hembras se prepara el extracto hipofisiario, mezclando .5 ml de oxitín, .5 ml de suero fisiológico y 3 mg de glándula pituitaria por cada kilogramo de peso de la hembra. Esta mezcla se coloca en un mortero y se muele todo hasta que la glándula queda completamente diluida y homogeneizada.
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La solución así preparada se toma con una aguja hipodérmica preferentemente esterilizada y se divide en dos partes: la primera (aproximadamente el 15%) se aplica en la base de la aleta dorsal de la hembra, la que previamente ha sido anestesiada; la segunda se suministra doce horas después (85%), de la misma manera.
Al momento de inyectar la segunda dosis a las hembras, se da una sola dosis a los machos, que contiene 2 mg de pituitaria y .25 ml de Prolan E*Oleoso por kilogramo de peso.
(*) Prolan E = 2,500 U.I. de gonadotropina coriónica humana.
Una vez aplicadas las inyecciones, se colocan dos machos por cada hembra en las piletas de desove (5 m² x .5m de profundidad o 2.5 m³), las cuales han sido preparadas previamente con una cama de rama de casuarina tratadas con un baño de azul de metileno durante 24 horas.
Pasadas 24 horas, después de colocar a los reproductores y observando que se ha realizado el desove y fecundación del huevo-cilio, se retiran las ramas de casuarina y se colocan en las incubadoras de canal circulante, donde se dejan hasta el momento que emergen los alevines y se retiran las ramas. Es importante señalar que esta técnica se aplica a las carpas espejo, barrigona y brema.
b) Técnica de Woynarovich modificada
Las dosis que se utilizan para esta técnica son las mismas que la de los casos anteriores, sólo que al aplicar la segunda dosis (85% restante) las hembras son anestesiadas con xilocaina más carbonato de sodio. Para lograr esto, las hembras se colocan en la solución por 1 o 2 minutos, después se sacan, se secan y se les aplica la inyección con la segunda
Figura 1. Actividades previas a la inyección del extracto pituitario
dosis, en la base de la aleta pectoral; inmediatamente se cose el poro genital, para evitar la salida del huevo y se pasan a la pileta de desoves.
Al mismo tiempo se aplica la dosis a los machos y se les reúne con las hembras. Pasadas de 12 a 14 horas se inicia el cortejo y se les da un tiempo de excitación de aproximadamente 30 minutos; al cabo del cual se checa a las hembras, tocando el abdomen, que debe estar completamente suave al tacto.
Esta etapa requiere de experiencia, ya que muchas veces la hembra no se encuentra totalmente madura, para estar seguro de esto, se puede colocar una hembra que no tenga el poro cosido para que sirva como un indicador.
Una vez transcurrido el tiempo de excitación, se sacan tanto los machos como las hembras y se secan perfectamente. Se extrae el esperma a los machos, recibiéndolo en un recipiente de vidrio (generalmente un tubo de ensayo) y se procede a descoser a la hembra. Una vez realizada esta operación, se aprieta ligeramente el abdomen y el huevo es recogido en una charola de plástico, en donde inmediatamente se agrega el esperma y se realiza la fecundación.
Existen tres técnicas de fertilización que pueden ser usadas y cuyo principio se basa generalmente en reunir los productos sexuales, pero difieren en sus procesos de fertilización (ffiismn, 1976) y Rothbard, (1981). Estas técnicas son:
a) Técnica húmeda: Los productos sexuales (huevo y esperma) son colocados en una charola o recipiente de plástico llena con agua.
b) Técnica seca: También conocida como técnica rusa, aquí los huevos son recogidos en un recipiente de plástico seco y se agregan de 2 a 3 ml de esperma por cada litro de huevo; se mezclan cuidadosamente y posteriormente se añade una solución de lavado.
La solución de lavado consiste de tres partes:
Solución A. Que se prepara mezclando 0.4% de cloruro de sodio (NaC1) y 0.3% de urea. Se requiere cerca de 10 litros de esta solución para un litro de huevos.
Solución B. Un gramo de ácido tánico, disuelto en un litro de agua. Se requieren cerca de dos litros de esta solución para un litro de huevos.
Solución C. Es la solución B diluida dos veces, y se requiere de un litro de esta solución para un litro de huevo.
c) Técnica superseca: Muy similar a la técnica seca, sólo que en este caso el huevo es colocado en un tamiz para despojarlo de su propio fluido y entonces es fertilizado. A continuación se les agrega la solución de lavado en las mismas condiciones que en la parte b.
La técnica de lavado consiste en:
a) Después de que se ha colocado el esperma sobre el huevo y se ha mezclado cuidadosamente con una pluma de ganso, se añade la solución A, agitando constantemente con la pluma y reemplazando la solución cada dos o tres minutos, para completar un tiempo aproximado de 40 minutos hasta que el huevo no se adhiere en una masa compacta y éste se separe completamente.
b) Una vez que los huevos están separados, se agrega la solución B y se deja por unos segundos y se desecha. Este paso debe hacerse con agitación constante.
c) El mismo paso es repetido para la solución C y ambas son necesarias para endurecer la capa externa del huevo.
d) Finalmente, los huevos son lavados con agua corriente durante diez minutos aproximadamente y son trasladados a las incubadoras.
Recientemente, Woynarovich y Woynarovich (1980), sugirieron un diferente sistema del lavado del huevo, que consiste en colocarlo en la solución A por 3 o 4 minutos y después con una solución preparada mezclando 4 g de NaC1 + 20g de urea disuelta en 1 litro de agua por otros 30 minutos. La ventaja que tiene esta técnica es la de ahorrar tiempo en el trabajo, por lo que el huevo no se agita constantemente, únicamente cada 10 o 15 minutos, cuando la solución es reemplazada.
Otras técnicas para eliminar la adherencia del huevo.
Se ha visto que un problema que va asociado a la producción intensiva de huevos de carpa común o brema, es la eliminación de la capa adherente que rodea al huevo cuando éste entra en contacto con el agua. Para superar este problema se ha venido utilizando tradicionalmente una mezcla de 3 g de urea y 4 g de cloruro de sodio disueltos en agua (Técnica de Woynarovich). En esta solución, se lavan los huevos agitando levemente y reemplazándola constantemente por un período de 30 a 40 minutos. Esta técnica ha sido muy utilizada en muchos países, sin embargo, se han ensayado otras nuevas como el uso de enzimas como la hialurodinasa y la proteasa al-calina bacteriana, el uso de talco repartido en los huevos para evitar el aglutinamiento y la leche en polvo.
En el caso de la técnica de leche en polvo, se ha visto que una vez obtenidos los huevos y sumergidos en una solución de leche en polvo (de 11 a 15 g de leche en polvo por litro), se elimina la capa adherente. Para lograr esto, es necesario lavar el huevo en esta solución, reemplazándola por otra nueva cada 30 segundos por un tiempo entre 35 y 40 minutos, hasta que el huevo no se adhiere a las paredes y forme conglomerados. De acuerdo con Schoonbaly Braidt (1982), esta técnica ha resultado efectiva para la eliminación de la adherencia de los huevos, incluyéndola como una rutina en la técnica de Woynarovich.
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5.2.2 Especies que tienen huevos pelásgicos no adherentes
Las rutinas para preparar a los reproductores de este grupo, son inicialmente las mismas que para las especies con huevos adherentes. Sólo que en este caso las dosis que se utilizan son diferentes. Para las hembras se prepara una solución calculada de 3.5 mg de extracto pituitario por kilogramo de peso, diluido en .5 ml de suero fisiológico (0.6-0.8% de NaCl) y .5 ml de oxitin, la cual es dividida en dos dosis, la primera del 10% de la solución y la segunda del 90%. La segunda dosis se aplica 12 horas después de que se suministró la primera.
En otros países como en Israel, la segunda dosis se aplica 24 horas después de la primera y la dosis utilizada es de 3 mg de pituitaria seca por kilogramo de peso del receptor; así una hembra de 3 kg de peso total, puede ser tratada con una primera inyección, que contiene 0.3 mg de glándula pituitaria y 24 horas después se aplica una segunda dosis que contiene 2.7 mg de extracto de pituitaria (Roth-Bard, 1981).
Sin embargo, la determinación de una dosis precisa para los reproductores de la estación de Tezontepec, puede ser estimada conociendo algunas relaciones morfométricas, como son el peso total expresado en kilogramos, la longitud total en centímetros, la circunferencia del cuerpo en cm y la dosis total; partiendo de la relación de 3.5 mg de extracto pituitario por kilogramo de peso de las hembras.
De un total de 21 registros morfométricos de hembras de carpa herbívora, se obtuvieron los siguientes resultados (Tabla 5)
A partir de estos datos se efectuaron una serie de regresiones lineales bivariadas, a fin de encontrar aquellas que presentaran una elevada correlación. Encontrando que existe una correlación significativa entre el peso total y la circunferencia del cuerpo
El valor más alto de correlación se presentó entre el peso total y la circunferencia del cuerpo, pudiéndose observar que a mayor peso el abdomen de la hembra se incrementa, por lo que es posible tomar esta relación para calcular la cantidad de dosis total a ser inyectada.
Tabla 5. Datos morfométricos y dosis de extractos hipofisiarios, aplicadas a 21 hembras de carpa herbívora (Ctenopharyngodon idellus)
Fotografía 10. Posición de un reproductor de carpa negra que permite el registro de datos morfométricos
De esta manera al correlacionar la dosis total de extracto hipofisiario contra la circunferencia del cuerpo en centímetros, se logró una correlación elevada
Así, es fácil calcular la dosis total de extracto hipofisiario al inyectar a las hembras, simplemente conociendo el peso total o la circunferencia del cuerpo y estimándola de la regresión.
Figura 2. Correlaciones lineales bivariadas en las que se encontró la significancia mas alta, obtenidas a partir de los datos fotométricos y dosis de extracto pituitario, aplicado a 21 hembras de carpa herbívora
Es interesante señalar que para esta especie, es necesario hacer ajustes en las curvas dependiendo de la temporada, ya que una dosis total de 3.5 mg de glándula pituitaria por kilogramo de peso de la hembra, sólo es funcional en el inicio de la temporada de reproducción y posteriormente es conveniente calibrar variando la dosis desde 3.5 hasta 5.0 mg por kilogramo de peso de la hembra receptora. No obstante, la regresión aquí calculada puede ser utilizada sobre todo al inicio de la época de reproducción, aunque es necesario realizar una mayor investigación al respecto.
Para el caso de los machos, se aplica una única inyección al momento de la segunda dosis para las hembras. Esta consiste en una dosis total donde se mezclan .25 ml de Prolan Oleoso y 2 mg de extracto pituitario por kilogramo de peso. La inyección se aplica en todos los casos en la parte musculosa de la aleta dorsal, dan-do un ligero masaje a fin de que el producto no se salga y se extienda adecuadamente.
Una vez aplicadas las dosis, los organismos se colocan en la pileta de desoves, dos machos por cada hembra y después de 24 horas, se obtienen los productos sexuales (esperma y huevos).
El manejo de los productos en estas especies tiene dos variantes:
a) Desove espontáneo. Esto implica que los reproductores son dejados en la pileta de desove, hasta el momento en que son ex-pulsados naturalmente de los productos sexuales, lo que sucede después del cortejo amoroso y dentro de las 24 horas después de la segunda dosis. Para colectar el huevo, previamente se coloca una red de organza sobre el piso de la pileta y se espera a que el huevo se hidrate, posteriormente se recoge y se traslada a las incubadoras, o bien el huevo es colectado con redes de cuchara.
b) Desove manual. Después de las 24 horas de la segunda dosis, se revisan las hembras y a los machos. Cuando las primeras están a punto, se capturan los machos y se obtiene el semen en un tubo de ensayo. Inmediatamente, se toma a la hembra y se le aplica una fuerte presión en la parte superior del abdomen, con el objeto de que expulse la mayor cantidad de huevo, el cual se coloca en una palangana de plástico seca. A los óvulos así obtenidos se les añade el esperma de dos machos y se esparce con una pluma de ganso, con movimientos lentos por un lapso de 3 minutos de manera que se realice una óptima fecundación.
Pasados los tres minutos, los huevos se lavan con suero fisiológico, el que se vierte suavemente por los bordes del recipiente de plástico, sin dejar de agitar suavemente con la pluma de ganso.
Para esta labor se requieren 500 ml de suero fisiológico, el cual debe ser renovado constantemente. Posteriormente, se retira el suero fisiológico con mucho cuidado y se enjuagan los óvulos con agua corriente y se agitan constantemente hasta que éstos se hidraten por completo para finalmente colocarlos en las incubadoras de canal circulante.