Cap. 5 | patologia

Patología en acuicultura

Técnicas de diagnostico en enfermedades de peces

1. Introducción

Las técnicas de diagnóstico de las enfermedades de los peces no difieren mucho de las utilizadas para

otras especies animales, incluido el hombre.

Quizás las diferencias más importantes radiquen en que las patologías en peces están peor conocidas y, por tanto, la parte del diagnóstico, basada en la descripción de la sintomatología, se obtenga un menor grado de información que en las enfermedades de mamíferos y aves. En cambio, en lo que se refiere a la metodología empleada para la identificación del patógeno se utilizan los mismos métodos que para la determinación de patógenos de animales superiores, si bien, en general, no se dispone aún de la diversidad de reactivos comerciales que encontramos en el diagnóstico de enfermedades de mamíferos y aves de interés económico.

En este capítulo se describe la metodología a seguir para el diagnóstico de una enfermedad en peces. Puesto que sólo se tiene un conocimiento sistemático de las enfermedades infecciosas que afectan a los salmónidos, en algunos de los aspectos descritos en este capítulo se ejemplifica con las vías analíticas desarrolladas para el diagnóstico de enfermedades que afectan a salmónidos. No obstante, cabe señalar que técnicas semejantes se podrán desarrollar con otras especies en el momento en que se conozcan con exactitud las enfermedades que las afectan.

Obviamente la posibilidad de establecer una metodología experimental para el diagnóstico de enfermedades de moluscos y crustáceos están aún muy lejos de poder realizarse.

2. Técnicas generales de muestreo y necropsia

2.1. Toma de muestras

Sin duda alguna., el éxito del aislamiento de un patógeno depende de un adecuado muestreo. Ante todo, debernos determinar si nuestro objetivo es aislar un patógeno o realizar una inspección, ya que condiciona la toma de muestras. Por lo tanto, diferenciaremos:

A. Muestreo para una inspección sanitaria:

Las muestras serán tomadas por lotes, debiéndose mantener cada uno de ellos separado durante todo el proceso. Podemos definir un lote como un grupo de peces de la misma especie, edad, que proceden de la misma puesta y del mismo tanque de cultivo.
Iniciaremos la muestra tomando los peces moribundos y la completaremos con peces asintomáticos procedentes del mismo lote. Los ejemplares sintomáticos serán procesados separadamente del resto, pero teniendo en cuenta que forman parte de la misma muestra.
El tamaño minino de la muestra nos ha de proporcionar un 95% de posibilidad de que los especímenes infectados estén incluidos en ella, asumiendo una existencia mínima de Infección en la población igual o mayor al 2, 5 10% (véase cuadro I).
Los peces tienen que estar vivos y procesarse lo más pronto posible. Si no se pueden mantener vivos, deberán guardarse en bolsas de plástico, escépticas y selladas, y mantenerlos en hielo, pero nunca congelados.

B. Muestreo para aislar un agente patógeno:

Tomar por lo menos 10 especímenes que muestren sintomatología externa típica de la enfermedad que afecta a la población

Los peces deben estar vivos cuando son muestreados y procesarse inmediatamente. Si no Hiera posible, hay que mantenerlos en bolsas de plástico escépticas y selladas a 4°C en hielo. Nunca deben congelarse.

En ambos sistemas de muestreo tendremos en cuenta los requisitos específicos que posteriormente se citan según el agente patógeno que pretendamos detectar; especialmente, por lo que se refiere al tiempo máximo aconsejable entre muestreo y procesamiento, y a técnicas especificas.

2.2. Necropsia

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2.2.1. Recopilación de datos

Una vez realizado el muestreo y antes de iniciar la necropsia, se elegirá un código oportuno para la identificación de cada. muestra y/o ejemplar, etiquetándolo debidamente. Se realizará un historial completo, donde se especificará,:

Número de referencia
Origen de las muestras.
Fecha del muestreo.
Tipo de alimentación administrada a los peces.
Sintomatología que presentaban en los estanques o hábitat natural.
Porcentaje de mortalidad del lote estudiado.
Características físico-químicas del agua.
Manipulaciones recientes de los peces (selección de tallas, despesques, tratamientos…)
Esquema de las instalaciones de cultivo: número y forma de los estanques, toma de aguas, desagües, localización de las fases de cultivo y de la población afectada..
Relación de las enfermedades sufridas anteriormente en la piscifactoria y diferentes tratamientos a los que se ha sometido el lote (tipo, frecuencia, dosis...). Deben tomarse las muestras antes de que se realice cualquier tratamiento.
Cualquier información adicional que pueda sernos útil, así como esquemas o fotografías si se estima oportuno.

2.2.2. Técnicas de necropsia

La necropsia nos ha de facilitar muestras de diferentes tejidos para diversos test (bacteriológicos, virales, parasitológicos). Las muestras de parásitos externos deben tomarse antes de desinfectar la superficie externa de los ejemplares. Una vez abiertos, debemos trabajar asépticamente y tomar, en primer lugar, las muestras para análisis de agentes etológicos bacterianos. Seguiremos el siguiente procedimiento:

A. Estudio microscópico externo:

Se anotarán todas las anormalidades: color del cuerpo, exoftalmia, escamas levantadas, opérculos, aletas o pedúnculo caudal erosionados, áreas hemorrágicas, inflamaciones, úlceras, supuraciones, necrosis, mucosidades y cualquier anomalía en las branquias...
Inocular los medios de crecimiento adecuados para el estudio bacteriológico a partir de estas lesiones. Realizar frotis de material procedente de ellas para tinción GRAM u otros test.
Examinar las branquias en un microscopio de disección. Raspar branquias, aletas y superficie corporal, montar preparaciones frescas y observarlas para la detección de ectoparásitos.

B. Apertura de la cavidad abdominal:

Mantener el instrumental en alcohol de 70°C y flamearlo antes de usarlo.
Desinfectar la superficie del pez frotándola con un algodón o toalla de papel humedecida con alcohol de 70°C hasta que quede ligeramente opaca.
Cortar una aleta lateral con unas tijeras. Hacer una incisión con el bisturí en el punto de intersección entre la línea media ventral y la perpendicular a la misma desde la aleta cortada. Con unas tijeras, y empezando por la incisión, cortar por dicha perpendicular hacia la parte dorsal hasta encontrar cierta resistencia, que nos indicará que hemos alcanzado la parte superior de la cavidad abdominal. Seguidamente realizaremos cuidadosamente un corte a lo largo de la línea media-ventral hasta el ano, pero sin llegar a él, y sin perforar o dañar el intestino. Levantar la zona cortada con la ayuda de unas pinzas, separándola de la masa visceral. Finalmente, y empezando en la parte posterior del corte medio-ventral, cortaremos la porción de pared corporal que hemos levantado (fig. 1)

Fig. 1. Esquema de la apertura de la cavidad abdominal.

C. Estudio macroscópico interno:

Para reducir el riesgo de contaminación tomaremos, en primer lugar, las muestras para análisis microbiológico del riñón anterior y de cualquier tejido que presente alguna anormalidad También realizaremos frotis de dichas muestras para Unción GRAM u otras.
Se anotarán el aspecto general de los órganos y sus posibles anomalías: color, consistencia, puntos hemorrágicos, inflamaciones, pústulas, presencia o ausencia de comida o mucus en el estómago e intestinos.

Tomar las muestras de los tejidos para los diferentes estudios: virológico, detección de mixosporidios, examen histológico, etc.

D. Desecho de las muestras:

Los restos de las muestras, medios de cultivo utilizados, agua de transporte, etc., tienen que ser debidamente autoclavados, incinerados o desinfectados por cualquier procedimiento antes de desecharlos.
Debe descontaminarse todo el instrumental y material utilizado.

3. Métodos para la detección de agentes etiológicos bacterianos

Los métodos presentados a continuación son los mínimamente necesarios para un estudio bacteriológico de las muestras. Deben aplicarse a todas ellas en una inspección sanitaria, sobre todo si hay una clara evidencia de signos externos o mortalidades características de una enfermedad concreta

3.1. Toma de muestras

Como ya se ha indicado en el apartado 2, las muestras para este estudio se tomarán, en primer lugar, y asépticamente, obteniéndolas preferiblemente de los siguientes tejidos y sembrándolas en los medios indicados:

A) Material procedente de lesiones externas e internas, y muestras de riñón anterior. Se sembrarán en TSA. Incubar a 20°C, observándolas diariamente durante cinco días.

B) Material procedente de lesiones externas e internas, y muestras de las branquias (raspado) si la observación microscópica sugiere una infección mixobacteriana (véase 3.3.). Se sembrarán en medio de Shieh (SH Agar) o en altar para Cythophaga (CA). Incubar a 15°C-20°C durante cinco días observando diariamente (fig. 2).

3.2. Tinciones directas de la muestra patológica

Se prepararán frotis de todas las muestras tomadas para Unción GRAM. Se examinarán un mínimo de 25 campos a 900-1.000 X* Si se detectan diplobacilos GRAM +, extra e intracelulares, puede existir una infección por salmoninarum (BKD), lo cual vendría corroborado por la falta de crecimiento en TSA (SaNDEas & FaYEE, 1980). Entonces si disponemos de anticuerpos específicos de las especies sospechosas, en este caso R. salmoninarum, se pueden realizar pruebas serológicas directamente a partir de la muestra patológica.

Preparación de las placas. Añadir 10 ml del siguiente medio en una placa de Petri de 60 mm de diámetro: Agar noble, 1,0%; NaCl, 0,9%; Thimerosal o Mertiolato, 0,01%.
Perforar seis cavidades de 6 mm de diámetro alrededor de una central de las mismas dimensiones y equidistantes todos ellos 6 mm.

* El caso más frecuente sena II salmoninarum que describiremos como ejemplo de cómo se debe proceder.

Fig. 2. Diferenciación de las colonias aisladas en SH o CA

A) Inmunodifusión (Cnzti et al, 1974):

Colocar 0,1 ml de anticuerpo especifico contra A salmoninarum en la cavidad central Las periféricas las llenaremos una con 0,1 ml de solución salina (control negativo), otra con una suspensión en solución salina de células de A salmoninarum (control positivo) y las otras cuatro restantes con un homogenizado del tejido del riñón que estamos analizando al 50% en solución salina.
Incubar en cámara húmeda a 15°-20°C durante 48 horas. El test será positivo si aparece una linea de precipitación entre las muestras y el antisuero igual a la que debe aparecer entre el control positivo y el antisuero.

B) Inmunofluorescencia directa (Humo et al, 1980):

Realizar un frotis de la muestra del riñón en un portaobjetos limpio permitido que se seque, y fijar bien en acetona durante 5-8 m. o bien mediante calor (60°C) durante 2 min.
Añadir una o dos gotas (cubrir la muestra) de la dilución óptima recomendada en la globulina conjugada contra R salmoninarum para mejorar el contraste, añadir una o dos gotas de rodamina 1/150-1/200. Dejar actuar durante 5-8 min. a 20°-28° C.
Lavar dos veces la muestra durante 2 min. en PBS, pH 7,2.
Secar y montar (medio de montaje pH 9).
Examinar un mínimo de 60 campos con el objetivo de inmersión utilizando un microscopio equipado con luz ultravioleta. Hay que realizar un control positivo como referencia. La presencia de diplobacilos fluorescentes indica que el test es positivo.

C) Inmunofluorescencia indirecta (anima y Sruciay, 1975):

Preparar frotis de una muestra de riñón. Fijar durante 5 min en acetona o bien a 60°C durante 2 min.
Cubrir la muestra con suero de conejo anti-R salmoninarum, e incubar en cámara húmeda durante 30 min. a 20°C.
Lavar durante 10 min. en PBS, pH 7,2.
Cubrir la muestra con globulina conjugada de cabra contra globulina de conejo, e incubar durante 30 min_ a 20°C.
Lavar durante 10 min en solución tampón bicarbonato-carbonato (una parte de 5,3% NaCO3 y cuatro partes de 4,2% NaHCO3H20 (Ph 9-9,5).
Secar y montar (medio de montaje pH 9).
Examinar con el objetivo de inmersión un mínimo de 50 campos, utilizando un microscopio equipado con luz ultravioleta Hay que realizar un control positivo como referencia. La presencia de diplobacilos fluorescentes indica que el test es positivo.
Existen medios selectivos para aislar A salmoninarum, pero el crecimiento en ellos es muy lento y puede requerir hasta seis semanas de incubación a 15°-18°C (OADAL y Enar, 1956; EVELYN, 1977; Austin', 1983).

3.3. Aislamiento y caracterización

Como en el apartado anterior se describe el proceso a seguir en Salmónidos. Para otras especies en su día se deberá determinar una metodología adecuada a los patógenos que les afecten.

Crecimiento en SH o CA*

Si el estudio macroscópico sugiere una infección mixobacterial (focos cutáneos blanco-grisáceos en las aletas, cabeza y tronco, llegando a erosionar la epidermis, lesiones branquiales en forma radial desde un punto, pero sin fusionarse las lamelas, posible coloración amarillo-naranja alrededor de las lesiones), preparar frotis de tejido branquial y/o de las lesiones. Examinarlos para detectar la presencia de masas de bacilos largos y delgados. Aislar las colonias amarillo-rizoides que han crecido en las placas de SH o CA, y realizar la Unción GRAM. Si observamos bacilos GRAM negativos, alargados y delgados, y con motilidad positiva, podemos suponer una infección mixobacteriana.

Para un diagnóstico confirmativo se realizará un test de aglutinación utilizando suero contra flexibacter columnaris y suero contra Cytophaga psychrophils; teniendo en cuenta que ciertas cepas de estas bacterias autoaglutinan en solución salina. Para evitarlo, debemos sondear o mantener 5 min. a 50° C en baño de agua las suspensiones celulares. Es aconsejable realizar un diagnóstico bioquímico (PácsA, 1968; AMEND, 1983; BULLOCK et al., 1986; Siusit, 1980).

Crecimiento en TSA

Para diferenciar las colonias que han crecido en las placas de TSA tendremos en cuenta las características reseñadas en la figura 3 y en los cuadros II y III. El uso de medios selectivos facilitará el aislamiento (Sitarrs y Rnurr, 1973; WALTMAN y SHorrs, 1984), aunque un diagnóstico definitivo comportará una caracterización bioquímica Para alguna de las especies existen serodiagnósticos rápidos, eficaces y suficientemente precisos (Kruo y Kansa, 1974; MCCARTHY y Rau, 1975; CIPRIANO et al, 1985a; CIPRIANO et al, 1985b).

3.4. Serodiagnóstico

En algunas situaciones la confirmación de un diagnóstico puede estar basada en un estudio serológico. Algunas técnicas de serodiagnóstico han sido desarrolladas o adaptadas para la detección de patógenos en peces (AxsEssos y DixoN, 1985). Citaremos las más habituales:

Fig. 3. Diferenciación de las colonias aisladas en TSA

A) Test de Inmunofluorescencia del anticuerpo (FAT)

Existen en el mercado globulinas conjugadas con isotiocianato de fluoresceína (FITC) para la detección por Inmunofluorescencia directa de R. salmonada, A salmonieida, E. tarda, V. anguillarum y Y. ruckeri. También podemos encontrar diferentes antisueros de conejo contra las distintas bacterias patógenas de peces. Diferentes compañías privadas y laboratorios oficiales de algunos países tienen a la venta o suministran desinteresadamente los diferentes reactivos biológicos necesarios para serodiagnóstico.

A1. Inmunofluorescencia directa (DFAT)

Extensión en portaobjetos de una gota del cultivo bacteriano o frotis de una muestra de tejido. Secar y fijar a (50°C durante 5 min. Hay que realizar un control positivo y uno negativo.
Rehidratar la globulina conjugada-FITC según la dilución de trabajo indicada por la compañía suministradora.
Cubrir la muestra, control positivo y control negativo con unas gotas de dicha dilución de globulina conjugada. Incubar en cámara húmeda a 20° C durante 5 min.
Aclarar y mantener en baño de 2-5 min. en PBS, pH 7,2.

Secar y montar (medio de montaje pH 9). Examinar con el objetivo de inmersión en un microscopio equipado con luz ultravioleta.
El test es positivo si observamos bacterias con fluorescencia verde-amarilla. Para conservar durante un tiempo las preparaciones, deberán mantenerse a 4°C y en oscuridad

A2. Inmunofluorescencia indirecta (IFAT)

Para realizar esta técnica necesitamos globulina conjugada-FITC de cabra contra suero de conejo y antisuero de conejo contra la bacteria en cuestión.
Frotis del cultivo bacteriano o la muestra del tejido. Secar y fijar a 60°C durante unos 5 min. Hay que realizar un control positivo y uno negativo.
Rehidratar los antisueros y diluirlos a las concentraciones de trabajo indicativas por la compañía suministradora.
Cubrir la muestra y controles con unas gotas del antisuero de conejo contra la bacteria. Incubar durante 5 min, en cámara húmeda a 20°C.
Aclarar y mantener en baño de 2-5 min. en PBS, pH 7,2.
Cubrir las muestras y controles con unas gotas de globulina conjugada-FITC de cabra contra suero de conejo. Incubar 5 min. en cámara húmeda a 20° C.
Aclarar y mantener en baño de 2-5 min. en PBS, pH 7,2.
Secar y montar (medio de montaje pH 9). Examinar con el objetivo de inmersión en un microscopio equipado con luz W.
El test, es positivo si observamos bacterias con fluorescencia verde-amarilla. Para conservar las preparaciones durante un tiempo, deberán mantenerse a 4°C y en oscuridad.

B. Test de macroaglutinación

Limpiar con alcohol algunos portaobjetos excavados o un portaobjetos con 12 excavados para macroaglutinación.
Diluir las muestras o suspensiones bacterianas (muestras y controles) a una concentración standard. Es suficiente que la dilución presente una ligera turbidez (cloudy). Como orientación, podemos tomar el grado 3 de la escala de McParland o una lectura de 30% de transmitancia, a 525 nm.
Si utilizamos una muestra de bacterias procedente de un medio sólido, hay que emulsificarla en solución salina y comprobar, por observación microscópica, que no presenta aglomeraciones celulares.
Poner una gota de cada suspensión bacteriana o antígeno en dos pozos excavados.
Añadir una gota del antisuero especifico para la bacteria o antígeno en estudio en uno de los pozos anteriores, y otra gota en los pozos control. Agitar suavemente.
Añadir una gota de antisuero normal al otro pozo donde tenemos la suspensión bacteriana o el antígeno (control negativo). Agitar suavemente.
Con una suspensión conocida del antígeno estudiado, reali79remos los mismos pasos anteriores, sirviéndonos de control positivo.
Observar las reacciones inmediatamente. La aglutinación en las muestras y en el control positivo Indicarán que el test es positivo. La muestra con el suero normal no debe presentar aglutinación.

C. Test para cuantificar la aglutinación

C.1. Test de aglutinación en tubos: Nos proporcionará el título del anticuerpo utilizado y la confirmación positiva del diagnóstico realizado. Se basa en la misma técnica de mezclar suspensiones bacterianas con antisueros, pero en pequeños tubos. Hemos de diluir el antisuero en un banco de diluciciones de razón 1/2.

C.2. Test de microaglutinación: Básicamente es el mismo procedimiento que en C.1, pero realizan con microtiters., agujas de microdilución y pipetas de goteo (droppers). El antisuero se diluye en proporción 1/2 a lo largo de los sucesivos pozos, y se añade a cada uno de ellos una cantidad específica de antígeno o suspensión bacteriana (ANDEssox y DIXON, 1985).

4. Métodos para la detección de agentes etiológicos víricos

4.1. Toma y tratamiento de las muestras

Para detectar agentes virales en una epizootia, se examinarán un minino de 10 peces, en dos grupos de 5 individuos cada uno. Nunca reuniremos en un mismo grupo o lote muestra de más de 5 individuos. Los ejemplares seleccionados estarán recién muertos o moribundos, presentando síntomas de la enfermedad (véase apartado 2). Nunca deben mezclarse ejemplares asintomáticos con sintomáticos.
Si la muestra procede de una población asintomática y estamos realizando una inspección, el tamaño de la muestra no será superior al 5% de prevalencia según el cuadro I.
Los tejidos muestreados dependerán del agente vira] que estemos estudiando. Pueden servirnos de referencia los indicados en el cuadro IV.
Según el tamaño de los ejemplares, tomaremos las muestras de la siguiente manera.
Alevines: Todo el ejemplar. Si presentan vesícula vitelina, la descartaremos.
Ejemplares entre 2-4 cm de longitud: Cortar y despreciar la cabeza y el pedúnculo caudal. El resto del cuerpo y las branquias constituirán la muestra final.
Ejemplares entre 4-10 cm de longitud: Tomaremos como muestra las branquias y toda la masa visceral, incluyendo los riñones.
Ejemplares de 10 o más cm de longitud. Tomaremos muestra de los siguientes tejidos: riñón, bazo, ciegos pilóricospáncreas y branquias. La proporción de estos tejidos será: 3:1:1:1, respectivamente.

La proporción del riñón incluirá muestras de la parte anterior, media y posterior de este órgano.

Reproductores: Muestras del fluido ovárico, analizadas individualmente o en lotes de 6 peces como máximo. Si fuera posible, tomaremos muestras de riñón y bazo.
Si las muestras no pueden analizarse inmediatamente o han de ser transportadas, se mantendrán refrigeradas a 4 °C o con hielo, pero nunca se congelarán ni se analizarán más tarde de 48 h.

4.2. Homogenización de los tejidos y preparación de los inóculos

Pesar y homogenizar las muestras en un almirez con ayuda de una pequeña. cantidad de arena estéril (80-120 malla silicica). El equipo utilizado debe esterilizarse entre cada lote o grupo muestreado.

Diluir el homogenizado al 10% respecto el peso inicial en HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) o PBS pH 7,2 o MEM (Eagle's Minimum Essential Medium) al 2% de suero bovino pH 7,2-7,6. Todos ellos deben llevar 100 1U de penicilina/mi y 100 µg de estreptomicina/ml, o bien 100 µg de gentamicina/ml como tratamiento antibacteriano. Puede utilizarse algún antifúngico, por ejemplo, 25 IU de nistatina/ml.
Centrifugar los extractos a 3.000 rpm durante 15 min. a 4°C.
Filtrar el sobrenadante a través de un filtro de 0,45 pm de diámetro de poro. Para evitar cualquier pérdida de virus por absorción en el filtro, recoger el máximo posible de muestra filtrada.
Si las muestras son liquidas (fluido ovárico), se diluirán 1:5 con MEM o HBSS o PBS, y seguirán el mismo proceso que las muestras de tejidos. La centrifugación y el filtrado se realizarán tal como hemos descrito.
La mínima dilución para el inoculo en el cultivo celular será de 1/100 para las muestras de tejidos, y de 1/10 para las muestras de fluido ovárico.

4.3. Cultivo celular e inoculación de las muestras

El virus estudiado nos determinará la linea celular más adecuada (cuadro V).
Las lineas celulares estarán libres de micoplasmas y se conocerá, si es posible, su susceptibilidad a los virus enzoóticos de la zona o región origen de las muestras.
Preparar por duplicado las placas o «microtiters» con la monocapa celular. Si el «microtitero» es de 96 pozos, tomaremos un mínimo de 8 pozos para cada muestra. Se utilizará MEM al 10% de suero fetal bovino con antibióticos para la formación de la monocapa El cultivo será de un 80- 90% confluente antes de inocularlo, y nunca más viejo de 48 horas.

Sacar el medio de cultivo de las placas o «microtiters», y lavar con PBS. Este se extraerá antes de inocular las muestras.
En el cuadro VII se citan los volúmenes de inóculo según la medida de la placa o «microtiter» utilizado.
Incubar los cultivos inoculados a 15°C durante 6090 min., agitándolos cada 15 min. para permitir la absorción del virus.
Añadir, sin extraer el inóculo, MEM al 2% de suero hasta el volumen habitual utilizado en la placa o pozos del «microtiter».

Incubar a la temperatura y pH adecuados (cuadro VI) durante 14-21 chas observando diariamente la formación de CPE (Cytopathic Effects).
Deberemos incluir controles en el análisis. Los controles positivos demostrarán que las células utilizadas son sensibles al virus que queremos detectar. Son sensibles las células que presentan la habilidad de manifestar efecto citopático cuando se exponen a una suspensión del virus de 10a TCID50/ml o equivalente. Los controles negativos deberán permanecer sin CPE a lo largo de todo el periodo de incubación.

Una muestra es considerada negativa si no presenta CPE en el cultivo celular inoculado con las muestras, y tiene CPE en los controles positivos a los 14 ó 21 días de su inoculación. Si la muestra es positiva, realizaremos un test de seroneutralización.
En caso de destrucción de la monocapa celular por toxicidad de la muestra, realizaremos diluciones de los pozos o placas afectadas de 1/10 a 1/1.000 e inocularemos todas estas diluciones en nuevas monocapas de la misma linea celular utilizada previamente.

4.4. Seroneutralización

Se analizará sobre la misma linea celular que hayamos utilizado para detectar el efecto citopático.
El suero especifico contra el virus que queramos detectar será diluido según las instrucciones del suministrador. Dicha dilución podrá neutralizar una, suspensión conteniendo 10²-10³ TCID50/ml del virus homólogo. También dispondremos de suero normal.
Filtrar el medio de las placas que presentaban CPE, a través de un filtro de 0,45 µm de poro. Este paso no es necesario si el medio de cultivo lleva antibióticos, aunque si aconsejable.
Realizar un banco de diluciones de 10¹ hasta 10³, usando KESS o MEM con el pH adecuado para el virus en estudio (cuadro VI).
Mezclar 0,3 ml del antisuero especifico con 0,3 ml de cada dilución de la muestra.
Mezclar 0,3 ml del antisuero normal con 0,3 ml de cada dilución de la muestra.
Repetir el mismo proceso del banco de diluciones y mezcla con antisueros para una suspensión conocida y valorada del virus (aproximadamente 500 TCID50/ml) que nos servirá de control positivo.
Incubar todas las mezclas a 15°C durante 60 min., agitándolas suavemente cada 15 min.
La inoculación del cultivo celular podemos realizarla de las siguientes formas:
- Tener la monocapa confluente ya crecida en las placas o «microtiters» que utilizaremos para la neutralización. Deberemos extraer el medio de cultivo, lavar con PBS e infectar con las muestras tal como se indicó en el test anterior (4.3.). Inocularemos un mínimo de 0,2 ml de carta lote distribuido según el tipo de placa o «microtiter» (cuadro VII ).
- Si utilizamos «microtiter» de 96 pozos sin tener crecida la monocapa, pondremos 50 µl de cada mezcla por pozo (mínimo de 5 pozos/mezcla). Luego añadiremos a cada pozo 100 µl de células dispersadas que estarán en suspensión en MEM al 10% de suero y antibióticos.
Realizar controles negativos sólo con sueros que nos manifestarán si existe toxicidad debida a ellos mismos.
Incubar a 15°C de 2 a 12 días, dependiendo del agente viral. Observar diariamente si aparecen CPE. Si hubiera CPE en las monocapas inoculadas con la mezcla del suero normal. muestra analizada, y no en las monocapas inocularlas con la mezcla suero especifico•muestra analiza/12s, el test es positivo, siempre que los controles hayan actuado como tales.
Si el test es negativo, debemos realizar una nueva seroneutralización pero con un antisuero especifico contra otro virus. Si ningún antisuero neutraliza la muestra, consideraremos la posibilidad de una infección mixta viral (MincAY y PRYER, 1976; SCHIÁNIFELDT y PROST, 1975), toxicidad de la muestra o presencia de un nuevo agente viral aún no conocido.
Para una lectura más cómoda de los CPE, puede utilizarse MEM al 4% de suero y con 1% de agarosa (medio sólido) si se realiza la prueba en placas de un tamaño adecuado. Cuando se observen CPE, se extraerá el medio sólido, se fijará con formol durante 10-15 min. y se teñirá con cristal de violeta durante 2 min. Después de un lavado con agua, pueden observarse y contarse.

4.5. Otros métodos

Existen diversos test inmunoserológicos más específicos que han sido utilizados para diferentes agentes virales: Inmunofluorescencia, ELISA, inmunoblot-ELISA, etc. (McAnisrEs. y SCHILL, 1986; AMEND y WEDEMEYER, 1970; AMEND, 1970; Mc. Ainsrza et al., 1986). Todos ellos pueden ser muy prácticos y útiles en algunas situaciones.

5. Métodos para la detección de parásitos

5.1. Recomendaciones generales

Observar cuidadosamente la superficie corporal y las branquias, ya que algunos ectoparásitos pueden detectarse a simple vista. Usaremos el microscopio de disección (10X) para analizar con más precisión y mayor aumento, posibles ectoparásitos de tamaño inferior. También es aconsejable realizar frotis de raspados de branquias y superficie corporal, y observarlos en el microscopio a 100X
Para el estudio de endoparásitos seguiremos las mismas instrucciones que para los ectoparásitos, pero después de haber tomado las muestras bacteriales y virales. Observaremos externamente las vísceras, branquias, escisiones de los ojos y masa encefálica en el microscopio de disección. Realizaremos frotis de contenidos y raspados intestinales, vejiga, riñón, hígado y de cualquier anomalía interna que se presente, estudiándolas a 100, 200 y 500X

5.2. Preparación de los parásitos para su estudio

El objetivo principal es preparar las muestras para una identificación clara de las diferentes características de cada parásito. Protozoos y algunos Helmintos tienden a contraer las partes blandas o apéndices de su cuerpo. Debido a ello hemos de utilizar una técnica de relajación antes de preservarlos (Parratartn y KsusE, 1982).

5.2.1. Protozoos

Utilizando formol al 1/4.000 como agente relajante durante 30 min., se obtienen excelentes resultados. La solución Bouin o formol al 5% son buenos medios de preservación Podemos realizar extensiones frescas o incluir en bloques para un posterior estudio microscópico de los tejidos o estructuras (branquia g, aletas, epidermis...) donde se encuentran los parásitos. De algunos de ellos se dispone de técnicas especificas de concentración y serodiagnóstico, como es el caso de Myxobolus cerebralis (McLEAN, D. G., 1971; Cobrros & RarHENBACKER, 1974; Mmunw & WOLF, 1974a, 1974b, 1978 y 1980; WOLF & MARKIW, 1979).

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5.2.2. Tremátodos

Monogenea: Relajación en formol al 1/4.000 durante una hora. Preservación en formol al 10%.
Digenea: tratarlos con formol al 5% a 90°C en baño de agua para distendir las estructuras y matar al parásito. Fijación en formol al 5%.

5.2.3. Cestodos

Relajación y muerte en formol al 5% a 90°C en baño de agua.

5.2.4. Nemátodos

Relajación y muerte en alcohol 70% en baño de agua a 70° C.

5.2.5. Acantocéfalos

Para extender sus probóscides hay que colocarlos en agua durante algunas horas o dial. Matarlos en formol al 5% a 90° C.

5.2.6. Crustáceos

Matar y preservar en formol al 10% o en alcohol 70%.

6. Métodos para la detección de hongos

6.1. Recomendaciones generales

Los mismos métodos usados en la sección de parasitología pueden sernos útiles.
Muchas infecciones fúngicas son detectables a simple vista, Si la infección es externa, examinaremos cuidadosamente la superficie corporal y las branquias. Micelas, nódulos u otras lesiones epiteliales pueden indicarnos la presencia de hongos. Realizaremos frotis no sólo de estas regiones, sino también de un raspado superficial para tomar una muestra del mucus. La observación microscópica se realizará a 10, 100 y 500X
Cuando la infección sea interna, examinaremos los órganos y tomaremos muestras de ellos y de las anomalías que se presenten, siempre después de haber tomado las muestras bacteriológicas. Examinaremos en el microscopio de disección las branquias, masa encefálica, vísceras y riñones. Realizaremos frotis de los diferentes órganos y anomalías morfológicas, así como contenido estomacal e intestinal, observándolos de 10 a 500X

6.2. Fijación de los hongos

La fijación se realizará satisfactoriamente con formol al 10%.

6.3. Tinciones recomendables

Algunas de las Unciones recomendables para su observación son: PAS-McManus (fig. 4) y Fungi-Gridley (fig. 9), ambas descritas en la sección 7.4.

7. Técnicas histológicas para el estudio normal y patológico

Los atlas de histología normal para diferentes especies como los de ANDERSON y MrttMUU, 1974; GRIZZLE y ROGERS, 1976; GROMAN, 1982; YASUTAKE y WAIZS, 1983; son aconsejables en un principio para familiarizarse con la histología no patológica. Los atlas de histología patológica (Hierva, 1982; KusarA et al, 1983), junto con algunos capítulos de tratados sobre ictiopatologia (Asinn, 1972; SNIESZKO, 1972; ROBERTS, 1975), son muy prácticos y de gran ayuda para la observación de las preparaciones.

7.1. Recomendaciones generales

Los peces seleccionados para el examen histológico serán aquellos que presenten síntomas externos de alguna enfermedad. Los más adecuados son los moribundos y, en su defecto, los recién muertos.

No se deben tomar muestras de peces muertos, congelados o no fijados, ya que sus tejidos han sufrido cambios «postmortem».

Si es posible, se tomarán muestras de algún pez asintomático del mismo lote, especie y edad.
Dicho muestreo será previo a cualquier tratamiento contra la supuesta enfermedad.
Se elegirá un código oportuno para la identificación de cada uno de los ejemplares, y se etiquetarán con dicha referencia los frascos que ocuparán cada uno de los ejemplares.
El envío de las muestras a un laboratorio se realizará después de estar fijadas (24 48 horas en la solución fijadora). Se transferirán a una bolsa de plástico con cierre hermético y con un poco de alcohol etílico 65° (o solución fijadora en su defecto), manteniéndose de este modo la muestra húmeda. No es aconsejable el uso de frascos de cristal, ya que pueden romperse durante el trayecto y secarse las muestras.

7.2. Proceso de fijación

Fijadores más adecuados para tejidos de peces.

A) Solución de Bouin.

Es uno de los mejores fijadores. Conserva estructuras delicadas y actúa como mordiente en algunas unciones. Se conserva durante seis meses si se protege del frío y del calor.

Ácido pícrico saturado: Ácido pícrico, 21 g; agua destilada, 1.000 ml.
Solución de Bouin. Ácido pícrico saturado, 1.500 ml; formol, 500 ml; ácido acético glacial, 100 mi.

B) Solución de Bouin-Hollande

Este fijador es aconsejable para la Unción tricrómica de Masson.

Solución stock Solución A
Añadir 2,5 g de acetato cúprico en 100 ml de agua destilada
Añadir 4 de ácido pícrico y agitar hasta disolverlo. Filtrar.
Añadir 10 ml de formol y 1 mi de ácido acético. Solución .6
Cloruro de mercurio saturado: 2 g de cloruro de mercurio en 20 ml de agua destilada
Dejar enfriar y filtrar. Solución de trabajo:
Añadir 1 parte de la solución B a 9 partes de la solución A.
El tiempo de fijación es de 24-48 horas. Después se deben mantener las muestras en alcohol de 65°.

C) Solución neutra-tamponada de formol al 10%.

Es un buen fijador, pero puede destruir ciertos tejidos que presenten excesiva Inflamación.

Formaldehido (3740%), 100 ml; agua destilada, 900 ml; fosfato sódico monobásico, 4 g; fosfato sódico dibásico, 6,5 g.

Procedimiento

Se anestesiará el ejemplar con tricaina (MS-222, metano sulfanato de tricaina) hasta que pierda su estabilidad.
Realizar una sección mediolateral desde el ano al opérculo, finalizándola por delante de la aleta lateral y en el punto medio del plano longitudinal.
Observación microscópica interna.
Separar las vísceras del área ocupada por los riñones mediante un corte esofágico y levantar la vejiga natatoria para facilitar la fijación de los riñones.
Si el ejemplar tiene una longitud superior a 40 mm, se realizará un corte muscular laterodorsal desde la cabeza hasta el pedúnculo caudal para facilitar la fijación.
Cuando supere los 160 mm de longitud, se separará cada uno de los órganos que deseemos fijar. Es aconsejable tomar piezas de unos 25 mm', pero no más gruesas de 5 mm.
Colocar el ejemplar ya diseccionado o las muestras de tejidos, en la solución fijadora en un volumen de 1:10 (muestra:fijador).
El tiempo de fijación es de 24 a 48 horas.

Posteriormente, se transferirán las muestras a alcohol de 65°. Si no disponemos de éste, permanecerán en la solución fijadora,

7.3. Inclusión de las muestras

Dejaremos en un solo plano la superficie que desearnos cortar de la muestra fijada. Si la fijación se realizó con formol, lavaremos la pieza muestreada con agua corriente para eliminar el exceso de éste.

Colocaremos las muestras debidamente etiquetadas en el primer alcohol 65° para la deshidratación.

La deshidratación e inclusión en parafina se pueden realizar manualmente o utilizar alguno de los programas automáticos de un procesador de tejidos. Uno de estos programas, de 16 horas de duración, es el siguiente:

Según el modelo del procesador de tejidos, existen diversos programas que el usuario puede adaptar a sus necesidades e intereses.

Realización de los bloques de parafina.
Obtención de cortes histológicos mediante microtomo, de un grosor no superior a 4 pm.
Secado de las preparaciones en estufa a 60°C durante una hora.

7.4. Técnicas usuales de unción

Tinción hematoxilina-eosina

Soluciones stock:

Stock hematoxilina de Mayer:

Cristales de hematoxilina, 4 g.

Agua destilada, 2.000 ml.

Yodato sódico, 0,8 g.

Sulfato aluminico-potásico, 200 g.

Acido cítrico, 4 g.

Tricloro acetaldehido hidratado

Disolver el alumbre potásico en agua sin calentar. Añadir y disolver la hematoxilina en esta solución agitando bien Añadir el yodato sódico, ácido cítrico y el trieloro acetaldehido hidratado. Agitar hasta que todos los componentes estén completamente disueltos. El color final es rojo-violeta. Puede utilizarse inmediatamente, pero la solución mejora si se deja reposar una semana. Filtrar antes de usarla.

Stock eosina 0,5 alcohol:

Eosina Y, 10 g.

Agua destilada, 200 ml.

Alcohol absoluto, 1.800 ms.

Procedimiento:

Es una Unción de rutina y, en general, la más indicada para iniciar un estudio histológico. Comprende los siguientes pasos:

Desparafinado:

Histo-Clear; 2 baños de 2 min varia uno.

Histo-Clear: 2 baños de 2 min. cada uno.

Hidratación:

Alcohol absoluto: 2 baños de 1 min. cada uno.

Alcohol 95°: 2 baños de 1 min. cada uno. Agua destilada: 1 baño de 2 min.

Tinción:

Hematoxilina de Mayer: 15.30 segs. Lavado en agua corriente.

Virado:

Solución saturada LI2CO3: enjuagar rápido. Alcohol 65": 1 min. Alcohol 80°: 1 min.

Tinción de contraste:

Eosina 0,5 alcohol: 1-1,5 min.

Deshidratación.:

Alcohol 95°: enjuagar rápido. Alcohol 95°: enjuagar rápido. Alcohol 95°: enjuagar rápido. Alcohol absoluto: enjuagar rápido. Alcohol absoluto: enjuagar rápido.

Aclarado:

Alcohol absoluto + Histo-Clear (1:1): 2 min. Histo-Clear: 2 min. Histo-Clear: 2 min. Histo-Clear: 2 min.

Montar la preparación

Resultados:

Núcleos, azules. Citoplasmas en diferentes tonalidades de rosa permitiendo diferenciar los diversos tejidos (fig. 5).

Tinción May-Grunwald-Giemsa

Soluciones stock

Stock Giemsa:

Giemsa, 5 g; glicerina, 33 ml; mantenerlo a 60° C durante varias horas hasta su disolución; añadir 33 ml de alcohol metílico. Guardar a 4°C.

Solución de trabajo:

Stocks Giemsa, 5 mi; PBS pH, 6,4, 95 ml. 416
PBS (pH 6,4):

Fosfato sódico monobásico, 20 g; fosfato sódico dibásico, 17,74 g; agua destilada, 1.000 ml.

Stock May-Grunwald:

May-Grunwald, 1 g; alcohol metílico, 400 ml; calentar cuidadosamente el alcohol a 50°C. Añadir lentamente May-Grunwald. Dejar reposar 24 horas y filtrar. Proteger la solución de la luz en una botella oscura.

Solución de trabajo:

Se ha de preparar previamente a su uso. Solución stock May-Grunwald y PBS (pH 6,4) a partes iguales.

Procedimiento:

Desparafinar, llevar las preparaciones a alcohol etílico absoluto; pasar a alcohol metílico abs. 2 baños de 3 min. cada uno. Solución de trabajo May-Grunwald, 6 min.; solución de trabajo Giemsa, 45 min.; enjuagar con agua destilada; diferenciar en alcohol 95° con algunas gotas de ácido acético; deshidratar; aclarar y montar.

Resultados:

Núcleos, azules. Citoplasma de diferentes tonalidades rogailg s Bacterias, azules (figs. 6A y 6B).

Tinción tricrómica de Masson

Soluciones stock

Hematoxilina férrica de Weigert:

Solución A: Hematoxilina férrica, 1 g; alcohol 95°, 100

Solución B: Cloruro férrico 29%, 4 ml; agua destilada, 95 ml; HCI, 1 ml.

Solución de trabajo:

Partes iguales de la solución A y de la solución B.

Biebrich Scarlet-Fucsina ácida:

Escarlata de Biebrich 1%, 90 ml; fucsina ácida, 1%, 10 ml; ácido acético, 1 ml.

Solución ácida fosfomolibdica-fosfotúngstica:

Acido fosfomolibdico, 5 g; ácido fosfotúngstico, 5 g; agua destilada, 200 ml.

Azul de anilina:

Azul de anilina, 2,5 g; ácido acético, 2 ml; agua destilada, 100 ml.

Acido acético glacial 1 %:

Mido acético glacial, 1 ml; agua destilada, 99 ml.

Procedimiento:

Desparafinar.

Hidratación hasta agua destilada.

Mordiente de Bouin durante 1 h a 56°C. Precalentar antes de colocar las preparaciones.

Enfriar y enjuagar con agua del grifo.

Tinción con hematoxilina férrica de Weigert durante 10 minutos.

Lavar con agua del grifo.

Tinción con escarlata de Biebrich-Fucsina ácida durante 2 min.

Lavar con agua del grifo.

Solución ácida fosfomolíbdica-fosfottingstica durante 15 minutos.

Tinción con azul de anilina durante 5 mira Enjuagar.

Mido acético glacial 1% durante 3 min. Deshidratar.

Aclarar y montar.

Enjuagar con varios baños en alcohol 70°.

Tinción con fucsina aldehidica de Gomori durante 30 min_ Enjuagar en alcohol 95°.

Enjuagar con agua destilada

Contrastar con la solución «Metanil Yellow'. durante 1 minuto.

Enjuagar con agua destilada Deshidratar.

Aclarar y montar.

Resultados:

Micelas, púrpura oscuro. Tejidos elásticos y mucina, púrpura oscuro. Filamentos de Nocardia y Actinonlyces no se tiñen. Candida, de rosa oscuro a púrpura. Fondo amarillento (fig. 9).

Resultados:

Núcleos, azul oscuro. Citoplasma, queratina y fibras musculares, rojas Colágeno, azul (fig. 7).

Tinción PAS-McManus Soluciones stock:

Acido periódico al 5.

«Fast Green» al 0,03%.

Reactivo de Schiff:

Disolver 1 gr de fucsina básica en 200 ml de agua destilada hirviendo. Agitar durante 5 min. y enfriar a 50°C. Filtrar y añadir agitando 20 ml de HC1. Enfriar a 25°C y añadir 1 gr de bisulfito sódico. Agitar y conservar en botella oscura a 4°C. Previamente a su uso, dejarlo a temperatura ambiente. Esta solución necesita de 24 a 48 horas para tornar el color definitivo para su uso Se conserva de 2 a 4 meses, y se ha de despreciar cuando aparezca un color rosado. Puede servirnos como test de evaluación el añadir unas gotas de reactivo de Schiff en 10 ml de formol 37°-40°. Si esta solución vira a rojo púrpura rápidamente, podemos usar el reactivo. Si lo hace a azul púrpura oscuro, tenemos que despreciarla.

Procedimiento:

Hidratación hasta agua destilada

Acido periódico 5% durante 10 min.

Enjuagar con agua destilada

Reactivo de Schiff durante 15 min.

Lavar en agua corriente.

Tinción con «Fast Green» 0,03% durante unos segundos. Deshidratar.

Aclarar y montar.

Resultados:

Glucógeno, rojo-púrpura oscuro. Mucina, roja o púrpura. Fibrina y colágeno, rosa Quitina, roja (figs. 8A y 8B).

Tinción Gungi-Gridley (SANDERS, 1975).

Soluciones stocks.

Solución de ácido crómico al 4%.

Reactivo de Schiff (véase Unción PAS-McManus, pág. 418). Fucsina aldehidica de Gomori: Alcohol 70°, 100 ml; fucsina básica, 0,5 g; HC1, 1 ml; paraidehido U.S.P., 1 ml; dejar reposar durante 36-48 horas hasta que tome una coloración púrpura oscura Se conserva hasta 6 meses si se mantiene a 4° C.

«Metanil Yellow»:

Metanil Yellow, 0,25 g; agua destilada, 100 ml; ácido acético, 0,25 ml.

Procedimiento:

Desparafinar.

Hidratación hasta agua destilada. Mido crónico al 4% durante 1 hora Lavar en agua corriente 5 min. Reactivo de Schiff durante 15 min. Lavar en agua corriente 15 ruin lavar en agua corriente 15 min.

Fig. 4. Tincion Pas-Manus 160X. Micelitos teñidos de color purpura. Salmo Salar

Fig. 5. Tincion Hematoxilina-Eosina. 100X. Lamelas branquiales . Salmo Gairdneri

Fig. 6. Tincion May-Grunwald-GIEMSA. Parte posterior del riñón de Salmo salar. Presenta una Infección de Yersenia ruckeri A) 40 X ID 400 X 01 Bacterias de color azul

Fig. 7. Tinción tricrómica de MASSON. 40 X. Porción anterior del estómago en Salmo gairdnerl. Se aprecia claramente la coloración azul del tejido conectivo.

Fig. 9. Tinción Fungi-Gridley. 100 X Hongos en tejido epitelial de Morone saxatilis (Striped Bass) En el centro de la fotografía y de color purpura, se distingue una hila.

Fig. 8. Tinción PAS-McManue Parte posterior del cien de fontanalis. A) 40 X B) 100X

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