3. Mejora de la digestibilidad de las proteínas y los aminoácidos en la harina de plumas
3.1 Descripción general
La harina de plumas hidrolizada (FeM) es un ingrediente de pienso relativamente económico con un alto contenido de proteínas (78-87 % de proteína bruta). Este ingrediente se fabrica a partir de plumas, un subproducto de la industria avícola. Solo en 2012, se criaron y procesaron 60 mil millones de pollos en todo el mundo (estadísticas de la FAO). Las plumas representan entre el 5 y el 7 % del peso corporal de los pollos (Williams et al. 1991). En consecuencia, se generan anualmente volúmenes extremadamente grandes de plumas en todo el mundo (Poole et al. 2008; Huda y Yang 2009). Otros materiales queratinosos (pelo, lana, cuernos, pezuñas, garras, etc.) también representan recursos proteínicos muy importantes a nivel mundial.
Las plumas crudas están compuestas por más del 90 % de queratina, una proteína que también es el principal componente estructural del pelo, las uñas, la lana, los cuernos y las garras. La queratina contiene aproximadamente un 7% de cisteína y este aminoácido forma puentes disulfuro con otras moléculas de cisteína. Junto con los enlaces de hidrógeno, estos enlaces empaquetan firmemente los polipéptidos en una estructura filamentosa para formar una disposición helicoidal de láminas β retorcidas que le dan fuerza a la molécula de queratina (Fraser et al. 1972). Los enlaces disulfuro también hacen que la queratina sea muy resistente a la acción de las proteasas. Debido a su altísimo contenido de queratina, las plumas son prácticamente indigeribles en su estado natural. Varios estudios han demostrado que las plumas crudas son indigeribles para gatos, perros, polluelos, búhos y ratas (Mangold y Dubiski 1930; Moran et al. 1966). Las fuertes interacciones internas hacen que la queratina sea extremadamente resistente a los solventes gástricos y a las enzimas proteolíticas (Wrzesniewska-Tosik y Adamiec 2007).
La hidrólisis al vapor se utiliza comúnmente para procesar las plumas crudas y convertirlas en harina de plumas. La exposición de las plumas a una alta humedad, presión y calor crea condiciones que promueven la ruptura de los puentes disulfuro y de los enlaces de hidrógeno, que disocian las proteínas, lo que permite que los aminoácidos de la queratina sean accesibles a la proteasa y que la queratina se vuelva digerible, lo que libera aminoácidos y los vuelve potencialmente biodisponibles. Finalmente, la biomasa de plumas tratada con vapor se seca y se muele para producir harina de plumas. La harina de plumas es generalmente rica en arginina, cisteína y treonina, pero deficiente en metionina, lisina, histidina y triptófano.
La composición química, en particular el alto contenido de proteínas y aminoácidos digestibles de la harina de plumas, la convierte, en teoría, en un ingrediente muy interesante para los alimentos para animales, en particular los alimentos para especies de acuicultura que a menudo se formulan con niveles muy altos de proteínas (> 30%) (Bureau et al. 1999). Sin embargo, existen percepciones negativas entre los fabricantes de alimentos para acuicultura sobre la estabilidad del valor nutritivo de este ingrediente. Algunas partes interesadas de la industria de alimentos creen que la composición, la digestibilidad in vitro (ensayo de digestibilidad de pepsina) y el rendimiento de crecimiento logrado con este ingrediente son demasiado variables y relativamente impredecibles para ser utilizados a un nivel significativo en formulaciones de alimentos comerciales.
Los equipos y condiciones de procesamiento utilizados por los recicladores son relativamente diversos, y cada uno de ellos utiliza mezclas ligeramente diferentes de materia prima (plumas, pelo de cerdo, etc.), equipos de cocción, secado y molienda y condiciones de operación (temperatura, presión, duración, etc.). La variabilidad en el valor nutricional del FeM resulta del uso de diferentes materias primas y condiciones de procesamiento durante la producción de este ingrediente (Latshaw, 1990; Latshaw et al. 1994; Wang y Parsons, 1997; Bureau et al. 1999). Las variaciones en las condiciones de procesamiento térmico crean disparidades en los contenidos de conformadores de disulfuro, D-aminoácidos y aminoácidos reticulados, y estos afectan el valor nutricional de los ingredientes proteínicos. Una mejor comprensión de las interacciones químicas que ocurren durante el procesamiento del FeM permitiría el desarrollo de métodos para mejorar y estimar el valor nutricional de este ingrediente, lo que podría asegurar la calidad del FeM para los interesados en los alimentos.
3.2. Tratamiento enzimático y fermentación para mejorar la digestibilidad de las harinas de plumas
Durante las últimas dos décadas, se invirtió una gran cantidad de esfuerzo en mejorar el valor nutricional de los ingredientes de los alimentos a través del tratamiento enzimático. La mayor parte de los trabajos relacionados con el tratamiento enzimático de las plumas se centraron en la fermentación de la materia prima mediante el uso de bacterias queratinolíticas como Bacillus subtillis o B. licheniformis aisladas de desechos de queratina. La fermentación microbiana requiere el cultivo de bacterias y la incubación en un entorno controlado, lo que resulta logísticamente difícil de realizar a escala comercial. Los estudios sugirieron que la degradación bacteriana de la queratina se logra mediante la acción combinada de las disulfuro reductasas y las proteasas (Yamamura et al. 2002; Ramnani et al. 2005).
Las reductasas rompen los puentes disulfuro entre los aminoácidos de cisteína y permiten que las proteasas corten los péptidos (Bockle y Muller 1997). Ramnani y Gupta (2007) degradaron casi por completo la queratina de las plumas (96%) utilizando Savinase® (Novozymes), una serina proteasa de Bacillus sp., y sulfito de sodio como agente reductor. Se ha descubierto que el sulfito de sodio puede reducir los enlaces disulfuro-cistina abundantes en la queratina para producir un tiol de cisteína y una sal de Bunte (Elashi et al. 2013, Figura 8). Esta reducción de los enlaces disulfuro-cistina desestabiliza la proteína y, en teoría, la vuelve más susceptible a las enzimas proteolíticas.
Figura 8. La adición de un sulfito a un enlace cistina-disulfuro para producir un tiol de cisteína y una sal de Bunte Con base en el trabajo de investigación y desarrollo (I+D) patentado en torno a este proceso, Dupont Nutrition Biosciences APS (Copenhague, Dinamarca) solicitó la patente estadounidense Pub. No. US 2015/0197783 A1 “Método para la degradación de queratina y uso del hidrolizado de queratina producido”. El trabajo descrito en la patente consiste casi exclusivamente en estudios a escala de laboratorio con material queratinoso y solo se describe el uso teórico del “hidrolizado de queratina” en alimentos para animales. No parece que se hayan realizado ensayos a escala piloto ni ensayos con animales para evaluar el valor nutritivo del material resultante.
El procedimiento también aumenta considerablemente el costo de producción, ya que requiere reactivos costosos (enzimas, tampones y agente reductor), equipo complementario y la adición de agua, lo que demanda energía adicional para el secado. Por lo tanto, era necesario validar esta tecnología mediante ensayos con animales. También es necesario ampliar el procedimiento y examinar la viabilidad, el costo y el valor económico real de los ingredientes procesados.
3.3 Preprocesamiento de harina de plumas hidrolizada al vapor
3.3.1 Introducción
El objetivo de un estudio realizado en la Universidad de Guelph fue examinar el efecto de dos proteasas diferentes y un agente químico (disulfito de sodio) capaz de reducir los enlaces de disulfuro de cisteína abundantes en la hidrólisis en la hidrólisis in vitro de la queratina. El objetivo era tratar de desarrollar un protocolo optimizado para el pretratamiento de la harina de plumas antes de su uso en alimentos para animales. Se utilizó una estimación in vitro de la digestibilidad, el grado de hidrólisis de proteínas (grado de hidrólisis DH) como medida de la eficacia de la queratinólisis después del tratamiento con agentes enzimáticos y reductores.
3.3.2 Material y métodos
Se realizó un estudio de laboratorio con un modelo factorial completo para investigar el efecto de 1) el nivel de proteasa, 2) el nivel de sulfito de sodio y 3) el nivel de tampón de digestión en el grado de hidrólisis de plumas utilizando dos enzimas diferentes.
Este estudio examinó el efecto de dos proteasas diferentes: una proteasa fúngica (proteasa A) y una proteasa bacteriana (proteasa B), sulfito de sodio y agua en la hidrólisis de la proteína de muestras de harina de plumas según un diseño multifactorial (2x3x3x4) con 36 tratamientos (Tabla 7).
Cada prueba de hidrólisis se realizó a escala de laboratorio en una muestra (aproximadamente 20 g) de una harina de plumas comercial (Sanimax, Montreal, Qc, Canadá). Las pruebas se realizaron a las temperaturas y el pH recomendados por los fabricantes de enzimas durante un período de 3 h.
La reacción se detendrá agregando un volumen de ácido tricloroacético (TCA) al 20 %. Cada combinación de tratamientos se probó en tres incubaciones separadas (triplicadas). En este estudio, se incubaron un total de 216 muestras de harina de plumas.
Digestión enzimática
El tampón de digestión se preparó mezclando agua destilada con Trizma base® (1,211 g/L) y azida sódica (0,10 g/L) a fondo a temperatura ambiente (Coll et al. 2007). El pH del tampón de digestión se ajustó para cumplir con las recomendaciones del fabricante de la enzima con un pH de 10,0 para la proteasa B y un pH de 7,5 para AG175. Cada muestra se incubó durante un período de 3 horas en un baño de agua con agitación a temperaturas adaptadas a la actividad óptima informada de las proteasas, es decir, 37 °C para la proteasa fúngica (proteasa A) y 55 °C para la enzima bacteriana (proteasa B). Las muestras se centrifugaron (4000 rpm, 10 minutos) y se recolectó el sobrenadante para determinar el grado de hidrólisis.
La eficiencia de cada combinación de parámetros para hidrolizar FeM se evaluó como el porcentaje de nitrógeno solubilizado en solución de ácido tricloroacético por el pretratamiento y se expresó como grado de hidrólisis (DH).
Tabla 7. Diseño experimental del ensayo de hidrólisis
3.3.3 Resultados
Los resultados de este estudio de laboratorio demostraron que la harina de plumas podía hidrolizarse de manera muy efectiva in vitro con una mezcla de proteasa y sulfito de sodio. La adición de sulfito de sodio a la mezcla de incubación promovió la reducción química de los
puentes disulfuro y liberó sustancialmente la capacidad de las enzimas para hidrolizar FeM. Se encontró una diferencia en la efectividad de las proteasas. La proteasa B mostró una capacidad de hidroxilación significativamente mayor (P<0,0001) en comparación con la proteasa A.
Se determinó que un nivel de enzima de 3% (%FeM p/p), un nivel de agente reductor de 3% (%FeM p/p) y un nivel de agua de 500% (%FeM p/p) eran las condiciones óptimas para hidrolizar la harina de plumas utilizando ambas enzimas. En condiciones óptimas, se alcanzó una DH de 45% con la proteasa B.
La eficacia del pretratamiento para mejorar el valor nutritivo de FeM en dietas prácticas para animales necesita ser investigada sistemáticamente a través de ensayos de digestibilidad y biodisponibilidad con especies de ganado como peces, aves de corral y cerdos. Si se demuestra su eficacia, el pretratamiento podría permitir un aumento sustancial en la incorporación de FeM en los alimentos para animales.
¹ X1=Nivel de enzima (%FeM p/p), ² X2=Nivel de sulfito de sodio (%FeM p/p), ³ X3=Nivel de agua (%FeM p/p) ⁴ Los datos son medias (n=3) ± desviación estándar.
3.4 Evaluación de la biodisponibilidad de la arginina y la digestibilidad de los aminoácidos en dos harinas de plumas y en sus contrapartes pretratadas de trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss)
Efecto de este pretratamiento en la biodisponibilidad de la arginina (Arg) y en la digestibilidad de los aminoácidos de dos FeM comerciales hidrolizados al vapor y sus contrapartes pretratadas (PTFeM). Para producir FEM pretratados, los dos FeM comerciales se incubaron en agua destilada al 200% (%FeM p/p), con 0,05% de una proteasa (proteasa B, %FeM p/p) y 2% de sulfito de sodio (%FeM p/p) a 55ºC durante 24 horas en una incubadora con agitación. Luego, los dos PTFeM se liofilizaron.
La biodisponibilidad relativa de Arg en dos FeM y sus contrapartes pretratadas (PTFeM) se comparó con la de la L-arginina cristalina (L-Arg) en un ensayo de crecimiento de 8 semanas con trucha arcoíris. Se formuló una dieta basal deficiente en Arg (1,2 % de Arg) y se formularon otras diez dietas para contener 1,35 % o 1,5 % de Arg añadiendo cantidades crecientes de L-Arg, FeM o PTFeM.
Los resultados (Figura 9 y 10) indicaron claramente una mayor biodisponibilidad de Arg de los dos PTFeM en comparación con los dos FeM comerciales. Los dos PTFeM respaldaron mayores tasas de crecimiento y eficiencia de retención de Arg que sus contrapartes no tratadas. El PTFeM 1 respaldó una eficiencia de retención de arginina de aproximadamente el 70 %, que es la máxima eficiencia teórica de retención de arginina predicha por los modelos factoriales de requerimientos de aminoácidos desarrollados en la Universidad de Guelph.
Se llevaron a cabo dos ensayos de digestibilidad para examinar la digestibilidad de dietas formuladas con FeMs. En el primer ensayo, utilizando las dietas utilizadas en el ensayo de biodisponibilidad, las dietas que contenían PTFeMs presentaron coeficientes de digestibilidad aparente (ADC) de proteína cruda (PC) y aminoácidos significativamente más altos (P<0,05) en comparación con las dietas que contenían las contrapartes originales de FeM. En un ensayo de digestibilidad realizado con el protocolo estándar de digestibilidad indirecta 70:30, el ADC de PC en FeM1, PTFeM1, FeM2 y PTFeM2 se estimó en 85%, 95%, 82% y 96%, respectivamente. El pretratamiento de estos FeMs mejoró significativamente (P < 0,05) su ADC de PC y aminoácidos (con excepción de histidina, lisina y metionina).
Estos hallazgos contradicen los de Serwata (2007), Laporte (2007) y Davies et al. (2009) quienes no observaron una diferencia significativa en el ADC de CP entre FeMs hidrolizados con vapor estándar y FeMs tratados con enzimas por trucha arco iris, lubina europea, dorada y rodaballo. Esto parece indicar que la presencia tanto de un agente reductor como de disulfuro reductasa es esencial para permitir que las enzimas proteolíticas hidrolicen eficientemente la queratina en péptidos y aminoácidos.
Figura 9. Valores de consumo de alimento (a), ganancia de peso (b) y TGC (c) de truchas arcoíris en respuesta a la alimentación con dietas que contienen un contenido creciente de arginina suministrada por L-arginina, FeM1, PTFeM1, FeM2 o PTFeM2. Los valores son la media (n = 3).
Figura 10. Valores de nitrógeno retenido (a), energía recuperada (b) y eficiencia de retención de arginina (c) de truchas arcoíris en respuesta a la alimentación con dietas que contienen un contenido creciente de arginina suministrada por L-arginina, FeM1, PTFeM1, FeM2 o PTFeM2. Los valores son la media (n = 3).