23ª Parte: Enteritis Inducida por la Harina de Soya en las Dietas de Peces Marinos: Efectos Sobre la Integridad del Intestino Distal y la Respuesta Inmune en Totoaba macdonaldi
Resumen
El objetivo del presente estudio fue caracterizar los efectos perjudiciales en el intestino de juveniles de Totoaba macdonaldi producidos por el incremento en los niveles de inclusión de una mezcla de harinas de soya (SBM) en dieta en la inducción de enteritis. Cuatro dietas isoproteícas (48%) e isolipídicas (8,6%) fueron formuladas incluyendo niveles crecientes de SBM, 0%, 22%, 44% y 64% de la dieta con 1% de taurina adicionada. Al final del experimento (i.e., 8 semanas), se observó una marcada respuesta dosis-dependiente en el crecimiento producida por la inclusión de SBM. Basándose en las alteraciones histológicas del intestino distal, se observó una severa enteritis al incluir SBM por encima del 22%.
Además, se observó un aumento en la exfoliación epitelial del borde de cepillo intestinal en relación con los niveles de inclusión de SBM. Los niveles de expresión de la interleucina (il-8) mostraron una clara respuesta inflamatoria en presencia de SBM en la dieta lo que sugiere un estado de estrés crónico cuo se presentan niveles más altos de inclusión de SBM (i.e., 44% y 64%). Los resultados muestran un efecto perjudicial por parte de SBM sobre la fisiología digestiva de totoaba en niveles de inclusión superiores al 22%. Por lo tanto, se sugiere que se utilice con cautela SBM al momento de formular alimentos para totoaba.
Palabras clave: Totoaba macdonaldi, harina de soya, expresión de interleucina, enteritis.
1. Introducción
La creciente demanda de productos del mar ha llevado a un aumento sostenido de la producción acuícola (FAO, 2014). La disponibilidad de materias primas para la fabricación de alimentos acuícolas es una limitación para esta expansión continua. Aunque las denominadas "pesquerías de reducción" que producen aceite de pescado de harina de pescado (FM) se consideran estables, las demandas por FM aumentan a medida que los gastos de acuicultura. La acuicultura consume anualmente cerca del 70% de la FM producida en todo el mundo, y las dietas para especies de peces carnívoros consumen la mayor proporción. Por lo tanto, la búsqueda de nuevas fuentes de proteínas para sustituir FM sigue siendo una gran preocupación en la investigación acuícola. Las fuentes de proteínas vegetales alternativas, en particular la harina de soja (SBM), que contiene uno de los niveles de proteínas más altos entre las fuentes vegetales, se ha señalado como una de las fuentes de proteínas alternativas más prometedoras. No es sorprendente que el uso de SBM se haya adaptado cada vez más a la nutrición de varias especies en los últimos años. En la acuicultura, la harina de soya desgrasada se ha considerado una alternativa viable para reemplazar al menos una parte de la FM en los alimentos para peces marinos debido a la alta disponibilidad en el mercado de un alto contenido de proteína cruda (40-48 %) con un perfil constante de aminoácidos a niveles bajos. costo (Gatlin et al. 2007). Sin embargo, la inclusión de altos niveles de SBM en las dietas de peces carnívoros se ha asociado con la aparición de enteritis intestinal (Bakke-McKellep et al. 2000; Krogdahl et al. 2003), que se define como una inflamación no infecciosa del intestino distal (DI ) (Baeverfjord y Krogdahl, 1996).
Además, la SBM contiene un alto nivel de factores antinutricionales para los peces, además de los inhibidores de la tripsina (saponinas, lectinas, ácido fítico, alcaloides, oligosacáridos, antígenos), que están asociados con daños en la integridad de la mucosa, disminución de enzimas pancreáticas y mucosas, pérdida de nitrógeno en las heces, supresores de la hormona tiroidea, menor absorción de minerales, palatabilidad reducida y supresión del sistema inmunitario (Francis et al. 2001; Krogdahl et al. 2010). Las quimiocinas son un grupo de citocinas estructuralmente relacionadas que pueden atraer y activar tipos específicos de leucocitos en el sitio de inflamación o lesión. Por lo tanto, los niveles de expresión relativos de interleucina (il-8) son un buen indicador de una reacción inflamatoria (Li & Yao, 2013).
Totoaba macdonaldi es la Sciaenidae más grande del Golfo de California, destacada como una especie en peligro de extinción con alto valor comercial. Su cultivo es de gran importancia no solo para los programas de mejoramiento de poblaciones, sino también para estimular su acuicultura. En condiciones comerciales, la totoaba puede alcanzar los 2-3 kg en 18 meses (Juarez et al. 2016) y se considera candidata para la acuicultura comercial en la región de Baja California. La totoaba es una especie carnívora con una alta demanda de proteína >50% (Rueda-López et al. 2011), por lo que existe interés en reducir la inclusión de FM en la dieta. En el presente estudio evaluamos los efectos de aumentar los niveles de inclusión (0, 22, 44 y 64%) de una mezcla de harinas de soya (harina de soya + concentrado de soya) con un nivel constante de taurina (1%) en la inducción de enteritis. en juveniles de totoaba (aprox. 70 g) alimentados durante 56 días y utilizando la histología intestinal y los niveles de expresión de interleucina (il-8) como variables de respuesta.
2. Resultados
2.1. Morfología del intestino distal
El análisis histológico de la DI reveló que la inclusión de SBM en la dieta disminuyó la longitud del pliegue mucoso (MF) del intestino con el aumento de la coalescencia de los pliegues intestinales (Fig. 1.B). El ancho de Lamina Propia (LP) y Mucosa Subepitelial (SM) aumentó con algunas infiltraciones de granulocitos eosinofílicos con el aumento del contenido de SMB en la dieta.
Asimismo, las células caliciformes (GC) aumentan en número y se observan grupos compactos de estas estructuras hacia los ápices de MF (Fig. 1. B a D). Las vacuolas supranucleares (SV) en la dieta con 22 % de SBM mostraron cierta vacuolización (Fig. 1.B), pero en los tratamientos con 44 y 64 % de SBM, la SV disminuyó a casi inexistente (Fig. 1. C y D). A los 56 días, se observó la misma tendencia de acortamiento de la longitud de MF con una mayor inclusión de SBM en la dieta. Además, se observó un aumento del ancho de LP, la infiltración de granulocitos eosinófilos (EG) en SM y LP, la coalescencia de los pliegues y la ruptura del tejido de la MF con el aumento del contenido de SMB en la dieta. Además, algunas muestras dieron como resultado una vacuolización de enterocitos con una gran variación en el tamaño de las vacuolas (Fig. 1. F y H). En los casos más severos, el MF era generalmente más corto con una lámina propia más ancha y una disposición celular desordenada (es decir, pocos GC y MF sin la presencia de SNV) (Fig. 1. G y H).
2.2. La expresión génica
Los patrones de expresión relativa de la interleucina (il8) se muestran en la Fig. 2. A los 28 días, la expresión relativa de il8 mostró un pico en la dieta con 22 % de SBM (2,00), mientras que el nivel de expresión de las dietas con 0 %, 44 % y 64 % de SBM permaneció con niveles de expresión significativamente más bajos (0,87, 0,75 y 1,02, respectivamente). A los 56 días, el nivel de expresión más alto se encontró en una dieta con 44 % de SBM (1,10). Sin embargo, no se encontraron diferencias significativas (P>0.05) entre los niveles de inclusión de SBM (0.93, 82.46 y 0.54 para 0%, 22% y 64%, respectivamente).
Figura 1. Los cambios histomorfológicos asociaron un proceso inflamatorio del intestino distal de T. macdonaldi alimentados con dietas con 0% SBM (A, E), 22% SBM (B, F), 44% SBM (C, G) y 64% SBM (D, H) durante 28 días (A - D) y 56 días (E - H). Barra = 200 μm.
Fig. 2. Expresión relativa de interleucina (il8) en T. macdonaldi a los 28 y 56 días alimentados con dietas que contenían diferentes niveles de SBM. Letras diferentes representan valores significativamente diferentes (P<0.05) dentro del mismo día (n=9). r2 y la ecuación de la regresión se muestran en el recuadro.
4. Discusión
El esfuerzo de investigación para evaluar la inducción de enteritis por fuentes dietéticas de proteínas alternativas, incluida la SBM, es considerable. Hay muchos informes sobre el uso de SBM en peces carnívoros con resultados contradictorios; por ejemplo, algunos investigadores confirman que SBM podría usarse en niveles altos sin efectos negativos (Bonaldo et al. 2008; Trejo-Escamilla et al. 2016), mientras que la mayoría de los informes demuestran un rendimiento negativo en niveles de inclusión intermedios o altos (Bakke-McKellep et al. 2007; Chikwati et al. 2013; Ferrara et al. 2015; Gu et al. 2016; Urán et al. 2008). El presente trabajo corrobora con la mayoría de la literatura que destaca que el SBM dietético afectó el rendimiento fisiológico digestivo general y el estado de salud de los juveniles de Totoaba en los niveles de inclusión intermedios o altos.
Los resultados histológicos destacaron un claro daño inflamatorio patológico perjudicial de los tejidos analizados (intestino distal e hígado) relacionado con la SBM dietética. La integridad de la barrera de la mucosa es crucial para mantener la homeostasis tisular frente a patógenos y antígenos alimentarios
(Sahlmann et al. 2013). El moco secretado por GC proporciona la primera capa de protección intestinal y la integridad de la barrera mucosa depende de la proliferación celular para reemplazar las células dañadas (Sahlmann et al. 2013).
Con base en las alteraciones histopatológicas reportadas previamente para la DI en la literatura, nuestros hallazgos sugieren que la totoaba sufrió una inflamación de la DI. Esta inflación DI fue dependiente de la dosis a medida que aumentó la SBM en la dieta, lo que resultó en un cambio morfológico de la mucosa intestinal. Los casos más severos se encontraron en peces alimentados con las dietas 44 y 64% SBM con un claro arreglo celular desorganizado, con marcada disrupción tisular, aumento de la coalescencia de los pliegues y alta presencia de EG en el SM con migración al LP. Esto es evidencia de un claro proceso de inflamación crónica del intestino con una importante reducción de la superficie de absorción del intestino reflejada en la reducción del ISI claramente documentada a los 56 días. Se ha sugerido que estos cambios morfológicos están relacionados con un recambio celular con un aumento concomitante de la migración celular y la apoptosis (Sahlmann et al. 2015).
Con respecto a los niveles de expresión molecular de la respuesta inmune, la interleucina-8 (il-8) es una de las principales citoquinas inmunorelevantes producidas durante una reacción inflamatoria para inducir la cicatrización de heridas durante un proceso inflamatorio (Li & Yao, 2013; Lilleeng et al., 2009). Como era de esperar y de acuerdo con la literatura, observamos un aumento en la expresión de il-8 en peces alimentados con dietas basadas en SBM, incluso en el nivel de inclusión más bajo (22% SBM), lo que indica una respuesta en el intestino posterior (Bonaldo et al. 2015; Perera & Yúfera, 2017; Urán et al. 2008). La reducción en los niveles de expresión de il-8, demuestra el efecto negativo de la SBM dietética, produciendo una reacción de estrés constante, independientemente del nivel de inclusión.
No obstante, la reducción en los niveles de expresión, con relación al mayor nivel de inclusión de SBM, podría ser consecuencia del grado de daño en la DI, verificado mediante análisis histológico. Es posible que la reducción en la expresión de IL-8 dentro de la DI pueda ser el resultado del aumento de la exfoliación epitelial del borde en cepillo intestinal como se informó para muchas especies (Bakke-McKellep et al. 2007; Gu et al. 2016; Sahlmann et al. otros 2013).
En conclusión, el presente estudio caracteriza las limitaciones de la inclusión de SBM en las dietas de T. macdonaldi, afectando notablemente la estructura y fisiología del intestino distal (es decir, a nivel histológico y molecular). Además, nuestros hallazgos demostraron un estado de estrés crónico en totoaba causado por alta niveles de inclusión de harina de soja en la dieta Por lo tanto, el presente trabajo sugiere directamente que la harina de soja debe usarse con cautela en los alimentos para totoaba.