24ª Parte: Efecto de la Dieta en el Microbioma Intestinal de Organismos Acuáticos
Resumen
El tracto digestivo de los organismos esta colonizado por microorganismos que cumplen con variadas e importantes funciones. Mucho se ha estudiado la microbiota del tracto digestivo en organismos terrestres, pero poco en organismos acuáticos. Gracias a los recientes métodos de secuenciación masiva del ADN, se ha abierto una ventana para explorar la composición taxonómica (microbiota) de los microorganismos no cultivables que existen en todos los ecosistemas, y el intestinal no es la excepción.
Además, también ha sido posible conocer los genes que están presentes (microbioma) en esos sitios al secuenciar todo el ADN presente, lo que se conoce como metagenómica.
Es ya conocido que la dieta es quizá el principal factor que puede alterar la composición tanto de la microbiota como del microbioma en animales terrestres, pero es poco lo que se conoce en animales acuáticos. Los principales factores que determinan el microbioma en peces son el nivel trófico (dieta), el hábitat y quizá su posición filogenética (Sullam et al., 2012).
En el presente trabajo, se contemplarán solo los avances que se han realizado en el efecto de la dieta en la microbiota y el microbioma obtenidos por métodos de secuenciación masiva, ya que éstos están menos sujetos a desviaciones causadas por el método usado, como pueden ser especialmente los causados por métodos de cultivo dependientes o incluso aquellos cultivos independientes pero de poca resolución como la electroforesis en gel con gradientes desnaturalizantes (DGGE por sus siglas en inglés) o el análisis de conformación de una sola hebra (SSCA).
Es ya plenamente conocido que el tracto intestinal de prácticamente todos los animales estudiados contiene una alta cantidad de microorganismos comensales y una elevada diversidad taxonómica de éstos. El caso de los organismos acuáticos no es diferente y diversos estudios se han enfocado a caracterizar la microbiota o el microbioma del tracto intestinal de peces y, en menor medida, de crustáceos.
Palabras claves: microbioma, NGS, organismos acuáticos
Peces
Microbiota núcleo
Una pregunta pocas veces realizada es si los organismos acuáticos tienen una microbiota en común, lo que se denomina “core gut microbiota” o microbiota núcleo intestinal. En peces, tanto marinos como dulceacuícolas, se ha determinado que Proteobacteria es el phylum dominante seguido de Firmicutes, Fusobacteria y Bacteroidetes, y éstos comprenden hasta el 90 % de los grupos bacterianos presentes en el tracto (Kahlke et al. 2012; Ingerslev et al. 2014; Ni et al. 2014; Ghanbari, Kneifel & Domig, 2015; Llewellyn et al. 2015; Zarkasi et al. 2016). En el salmón del Atlántico (Salmo salar) determinaron que solo 22 OTUs conformaban la microbiota núcleo de la especie (Gajardo et al. 2016) mientras que en la trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) se encontraron 52 (Wong et al. 2013).
Debido a que estos grupos son casi siempre encontrados, se ha especulado que contribuyen de manera importante a las funciones del hospedero, tales como digestión, absorción de nutrientes y respuesta inmune y que el hábitat intestinal “selecciona” a estos grupos (Roeselers et al. 2011).
Microbiota residente y transitoria
Es necesario diferenciar a la microbiota residente o autóctona de la transitoria o alóctona; la primera es aquella adherida al epitelio intestinal y al mucus, y la segunda, aquella presente en las heces. En la lubina (Dicentrarchus labrax) encontraron que la microbiota residente era más diversa que la transitoria y lo atribuyeron a la menor presencia de bacterias asociadas al mucus en la transitoria (Carda-Diéguez, Mira and Fouz, 2014). Diferencias significativas entre ambos tipos de microbiota también se han reportado para el pargo flamenco (Lutjanus guttatus), con una mayor riqueza de Unidades Operacionales Taxonómicas (OTUs por sus siglas en inglés) en la transitoria que en la residente (García, 2016). Un comportamiento similar se observó en el salmón del Atlántico (S. salar) en donde tanto la riqueza como la abundancia de bacterias fue mayor en la microbiota transitoria, también llamada “digesta” que en la residente o “mucosa” (Gajardo et al., 2016). En la residente predominaron las Proteobacterias y en la transitoria tanto Proteobacteria como Firmicutes. El sitio de muestreo dentro del intestino también puede tener una microbiota diferente entre si, diferencias significativas se observaron entre intestino anterior e intestino medio y distal, pero no entre medio y distal en el salmón (Gajardo et al. 2016). En el pargo lunarejo, se obtuvieron diferencias entre taxones de bacterias en los ciegos pilóricos y en la mucosa intestinal (García, 2016).
Metanálisis han sugerido que existe una comunidad bacteriana intestinal similar entre diferente tipo de peces y que si es factible que exista la microbiota núcleo (Sullam et al. 2012), e incluso esta microbiota núcleo es mas similar a la presente en el intestino de vertebrados e invertebrados que a la presente en el ambiente circundante.
Factores que afectan la microbiota intestinal
Entre los principales factores que afectan la estructura taxonómica de la comunidad microbiana en el tracto intestinal de peces, se encuentran la dieta, el nivel trófico, el hábitat y probablemente la filogenia (Sullam et al. 2012; Miyake, Ngugi and Stingl, 2015).
Salinidad
La salinidad es un factor que tiene una influencia en la microbiota de peces, diferencias significativas han sido encontradas en la microbiota intestinal de peces de agua dulce y marina (Roeselers et al. 2011). Sin embargo, poco se conoce como la comunidad microbiana puede cambiar en el mismo pez cuando este es cultivado en baja o nula salinidad y luego aclimatado a una mayor salinidad o vice versa. En el caso de la tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus), la salinidad fue un factor crítico para el cambio en la microbiota intestinal (Zhang et al., 2016); 55 de 89 OTUs analizadas fueron dependientes de la salinidad. Los géneros Devosia, Pseudoalteromonas y Cetobacterium fueron más abundantes en alta salinidad mientras que Actinobacteria lo fue en agua dulce (Zhang et al. 2016).
Sexo
Se ha visto que el sexo de algunos tipos de peces también tiene una influencia en la composición de la microbiota intestinal, tanto en peces silvestres como en cultivados (Bolnick, Snowberg, Hirsch, et al. 2014). Estos autores han sugerido que la inmunidad adaptativa puede constreñir a las comunidades comensales de bacterias (Bolnick, Snowberg, Caporaso, et al. 2014).
Inanición
La inanición es otro de los factores que afecta la composición de la microbiota; en la lubina asiática (Lates calcifer) notaron un significativo aumento en el número de Bacteroidetes (Xia et al. 2014) y se atribuye a la capacidad de este grupo de bacterias para obtener energía adicional de los alimentos. En la tilapia, también se observaron cambios en la microbiota en el colon y en el ciego en periodos de inanición (Kohl et al. 2014), así como en la carpa (Ctenopharyngodon idella) (Ni et al. 2014).
Dieta
Se considera que las larvas de peces son colonizadas por bacterias del agua circundante, ya que el intestino y el agua presentan taxones bacterianos en frecuencias similares (Semova et al. 2012). Sin embargo, la dieta (nivel trófico) modifican esta microbiota. Un análisis de varios peces y tiburones demostró que Proteobacteria era el grupo dominante en todas las muestras, seguido de Firmicutes (Givens et al. 2015), pero los organismos omnívoros presentaban mayor diversidad de bacterias intestinales que los carnívoros.
La dieta es reconocida como el principal factor que influye en la diversidad y en la estructura de la comunidad microbiana en el tracto digestivo de los peces (Tarnecki et al. 2017). En la trucha arcoíris (Oncorhynchus mykiss) se encontró que la microbiota núcleo, compuesta por los phyla (Bacteroidetes, Proteobacteria, Firmicutes y Actinobacteri) no era básicamente alterada por cambios en la dieta, pero si había cambio en la microbiota “accesoria” (Desai et al. 2012; Wong et al. 2013; Ingerslev et al. 2014). Se ha demostrado en varios estudios que la composición de la dieta y el origen de los ingredientes pueden tener una influencia en la microbiota de la trucha, dieta con contenido vegetal tiende aumentar la relación de bacterias del phylum Firmicutes contra las Proteobacteria cuando se compara contra una dieta a base de harina de pescado (Desai et al. 2012). Para el caso del pargo flamenco (Lutjanus guttatus), pez carnívoro, se observó un comportamiento diferente; peces alimentados con una dieta con proteína de origen vegetal y luego al cambiarle a proteína de animal marino sufrieron una considerable disminución de Proteobacteria (64.6%) y un aumento en Fusobacteria (26.25%) y Firmicutes (8.04%) (García, 2016) en la microbiota transitoria (heces). También se encontró que la microbiota residente del intestino distal del pargo era mas susceptible a cambios en la dieta.
En el salmón del Atlántico (Salmo salar) se observaron cambios en la microbiota relacionados al periodo de muestreo, de una dominancia de Bacteroidia y Clostridia en meses fríos a anaerobios facultativos (bacterias ácido lácticas) en meses posteriores y no tanto respecto a la dieta (Zarkasi et al. 2016). Al final del experimento, el género predominante de bacterias fue Aliivibrio. Es importante recalcar, la amplia variación en las comunidades microbianas encontradas entre individuos de un mismo grupo (mismo tanque), lo que hace difícil determinar el efecto de un parámetro como la dieta (Zarkasi et al. 2016). Resultados similares en cuanto a la escasa influencia de la dieta en la microbiota fueron observados en otro estudio con el salmón (Schmidt et al. 2016), agrupamiento de ciertas OTUs fueron observados entre peces alimentados con dos dietas con diferente tipo de harina, principalmente obtuvieron diferencias entre las lacto bacterias, pero también entre organismos de diferentes tanques. Truchas arcoíris (O. mykiss) alimentadas con dietas con harinas de pescado o de granos, mostraron ligeras diferencias en la microbiota intestinal a pesar de cambios significativos en el crecimiento de las mismas (Wong et al. 2013).
Observaron cambios significativos en el género Lactobacillus, aumentando en los intestinos de los peces alimentados con dietas a base de harina de granos, mientras que Clostridia más abundante con harina de pescado. En la dorada (Sparus aurata), al igual que en lo casos anteriores, la influencia de la dieta fue limitada en la riqueza de OTUs, sin embargo, hubo decremento de bacterias lácticas al sustituir harina de pescado por vegetal (Estruch et al., 2015).
De estos estudios se desprende que varios factores influyen significativamente en la composición taxonómica de la microbiota de los peces y que la dieta, por lo poco que hasta ahora se sabe, no es uno de los mas importantes.
Muy pocos son los trabajos que no solo analicen la microbiota, sino también el microbioma.
Para el caso de la carpa herbívora (C. idella) observaron cambios en las rutas metabólicas de la fructuosa, manosa y piruvato, de glicerolípidos y fosfoglicerolípidos y varias de las rutas del metabolismo de aminoácidos en carpas alimentadas con centeno (Ni et al. 2014).
Camarón
Microbiota núcleo
Para el caso de los camarones peneidos, son pocos los trabajos que investigan la microbiota de éstos organismos y menos los que relacionan la dieta con la microbiota. No se ha establecido si existe una microbiota núcleo intestinal, pero los principales phyla encontrados siempre son las Proteobacteria hasta con un 98 % del total, y en menor medida, Bacteroidetes y Firmicutes (Rungrassamee et al. 2013, 2014; Oetama et al. 2016; Wang, 2016; Vargas-Albores et al. 2017), este patrón se observó tanto en el camarón blanco del Pacífico (Penaeus vannamei) como en el tigre de Asia (Penaeus monodon). Sin embargo, camarones silvestres presentan una mayor diversidad de bacterias en el intestino, pero en muchos casos, las proteobacterias y especialmente las gamaproteobacterias son dominantes (Rungrassamee et al. 2014; Enciso-Ibarra, 2016; Montero-Lizárraga, 2017).
No es claro cual es la relación entre los grupos bacterianos presentes en el tracto intestinal y en el agua o sedimento donde se encuentran estos camarones. Se ha observado que la comunidad bacteriana del agua difiere de la intestinal en P. vannamei (Johnson et al. 2008; Zhang et al. 2014; Enciso-Ibarra, 2016) lo que sugiere que el ambiente intestinal ejerce una presión selectiva sobre el establecimiento de la comunidad microbiana (Zhang et al. 2014).
Efecto del tipo de cultivo
Se ha observado un cambio en la microbiota intestinal de los camarones al ser cultivados, y también dependiendo del tipo de cultivo (con o sin sedimento). La diversidad alfa en el tracto digestivo disminuye al cultivar camarones silvestres (P. vannamei) en un sistema con sedimento, y disminuye aún mas al transferirlos a un sistema sin sedimento (Enciso-Ibarra, 2016).
Dietas
Pocos han sido los estudios del efecto de la dieta en la microbiota, y menos en el microbioma, del camarón. Camarones alimentados con un alimento balanceado (pellet) tuvieron una mayor diversidad en la microbiota intestinal que aquello alimentados solo con calamar fresco (Enciso-Ibarra, 2016), en éstos últimos, mas del 80% de las OTUs pertenecían a proteobacterias.
Diferentes fuentes de proteína se probaron para determinar si éstas tenían un efecto en la microbiota y en el microbioma del camarón. Montero-Lizárraga (2017) preparó dietas con harina de pollo, cerdo y pescado y empleó como controles una dieta comercial de referencia y calamar crudo. Las heces provenientes de camarones alimentados con harinas de pescado, soya y con calamar, tuvieron la menor diversidad y mayor dominancia de un grupo (Proteobacteria) y las de harina de ave y dieta de referencia, las mas diversas. Sin embargo, aunque hubo variabilidad en la estructura taxonómica de la microbiota, no se observaron mayores cambios en las rutas metabólicas del microbioma, esto es, aunque había diferentes bacterias, éstas hacían los mismo incluso comparado con muestras de camarones silvestre (datos no publicados).
Camarones (P. vannamei) alimentados con diferentes fuentes de lípidos (soya, carne, aceite de linaza, pescado y una combinación de éstos) no mostraron diferencias significativas en la diversidad alfa ni entre los principales grupos de bacterias detectados (Zhang et al. 2014) aunque si en el crecimiento de los camarones. Una vez mas, la alta variabilidad entre los organismos, enmascara cambios significativos que pudiera haber.
Pre y probióticos
Una práctica común es el usar microorganismos benéficos (probióticos) o nutrientes que promuevan el desarrollo de estos microorganismos benéficos (prebióticos) en el cultivo del camarón, sin embargo, son también pocos los estudios metagenómicos que analicen el efecto de estos aditivos en la comunidad intestinal del camarón. A pesar que los Firmicutes no son los principales miembros de la comunidad intestinal y que comúnmente tampoco existen en organismos silvestres, miembros de este grupo son los que se han usado como probióticos, quizá por que se extrapoló la idea de organismos terrestres, principalmente mamíferos. Dietas fueron suplementadas con dos cepas de bacterias lácticas, Lactobacillus pentosus y Enterococcus faecium así como sobrenadantes de éstas, en ninguno de los tratamientos se observaron diferencias significativas en el número de phyla observados, excepto en las actinobacterias en solo unos de los tratamientos (Wang, 2016). Mas importante, no pudieron detectar secuencias de las especies bacterianas añadidas en ninguno de los tratamientos, quizá por la escasa o nula capacidad de este tipo de bacterias de colonizar o permanecer en el contenido intestinal, pero no se analizó si existían en la mucosa o epitelio intestinal. Sin embargo, es sistemas de cultivo en los que se usa como probióticos una mezcla de gamaproteobacterias, bacilliales (Firmicutes) inoculados directamente en el estanque de cultivo, se obtuvo mayor riqueza en los intestino de camarones colectados en aquellos estanques con el probiótico que en los que no lo recibieron así como poblaciones significativamente diferentes de bacterias, favoreciendo las proteobacterias y disminuyendo los Firmicutes (Vargas-Albores et al. 2017).
Conclusiones
Hay fuertes evidencias que los organismos marinos, principalmente peces y camarones, tienen unos grupos de bacterias que están presentes en sus tractos digestivos, lo que se conoce como microbiota núcleo y esta microbiota no se modifica mucho con cambios en su entorno, incluidas diferentes dietas. Esta microbiota es seleccionada por el ambiente intestinal. Sin embargo, también existe una microbiota que podemos llamar accesoria que si puede varía significativamente como respuesta a cambios en el entorno intestinal, como son el uso de diferentes dietas.
Es importante considerar la gran variabilidad que existe en la microbiota intestinal entre organismos al diseñar experimentos en los que se quiere determinar el efecto de un parámetro. Es recomendable tener el mayor número de réplicas posible e incluso darles seguimiento individual a los organismos para registrar el cambio de la microbiota o microbioma en el individuo y no necesariamente en la población (tanque).